Спосіб визначення ризику розвитку цукрового діабету 2 типу за допомогою генетичних маркерів

Спосіб визначення ризику розвитку цукрового діабету 2 типу за допомогою генетичних маркерів, який відрізняється тим, як маркер використовують однонуклеотидний поліморфізм G276T гена ADPOQ і в разі наявності гомозиготного генотипу роблять висновок про підвищений ризик виникнення цукрового діабету 2 типу. (19) (21) u201007631 (22) 18.06.2010 (24) 27.12.2010 (46) 27.12.2010, Бюл.№ 24, 2010 р. (72) КАРАЧЕНЦЕВ ЮРІЙ ІВАНОВИЧ, ГОРШУНСЬКА МАР'ЯНА ЮРІЇВНА, АТРАМЕНТОВА ЛЮБОВ ОЛЕКСІЇВНА, ПОЛТОРАК ВІКТОРІЯ ВІТАЛІЇВНА, КРАВЧУН НОНА ОЛЕКСАНДРІВНА, ХИЖНЯК ОКСАНА ОЛЕГІВНА, ТИЖНЕНКО ТЕТЯНА ВАСИЛІВНА, ЛЕЩЕНКО ЖАННА АНАТОЛІЇВНА, ГЛАДКИХ ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, ПОЧЕРНЯЄВ АРТЕМ КОНСТЯНТИНОВИЧ, ГРИНЧЕНКО 3 ляції, що еволюціонувала в унікальних кліматогеографічних умовах. Для етнічних українців описана можливість використання поліморфізму Q192R гену PON1 для прогнозування ризику розвитку ЦД 2 типу [13]. Стратегія визначення групи ризику відносно захворювань із спадковою схильністю, зокрема до цукрового діабету, складається не з того, щоб знайти єдиний абсолютно надійний маркер. Це неможливо у принципі. Для полігенних захворювань, зокрема ЦД 2 типу, для яких часто пусковим механізмом є умови середовища, доводити прогноз до необхідного рівня ймовірності можна за використанням комплексу різних предикторів і маркерів. У зв'язку з цим використання будь-якого нового чинника, що дозволяє уточнити ризик, цілком виправдано. Кожний новий маркер вносить додатковий внесок в оцінку ризику, тому розширення їх переліку дозволяє підвищити точність діагностики. Задача корисної моделі: розробка способу визначення групи ризику відносно розвитку цукрового діабету серед етнічних українців. Поставлена задача вирішується тим, що при визначенні, групи ризику розвитку ЦД 2 типу за допомогою генетичних маркерів для етнічних українців в якості маркера використовують однонуклеотидний поліморфізм G276T (rs 1501299) гену адипонектину ADIPOQ і в разі наявності гомозиготного генотипу роблять висновок щодо підвищеного ризику виникнення ЦД 2 типу. Технічний результат - підвищення точності діагностики цукрового діабету серед етнічних українців за рахунок розширення переліку маркерів ризику розвитку цього захворювання. Однонуклеотидний поліморфізм G276T гену ADIPOQ (або АРМ-1), є заміною гуаніна (G) на тимін (7) в другому інтроні (SNP - single nucleotide polymorphism, G276T в Region Ex6+78A>G) [14]. Спосіб оцінки, що заявлено, реалізується таким чином. Відповідно до вимог біоетики була отримана добровільна згода мешканців м. Харкова етнічних українців на участь у дослідженні і проведено відповідне анкетування. У особи, що досліджується, забирають 10 мл венозної крові. ДНК виділяється з лейкоцитів за допомогою іонообмінної смоли Челекс-100 (Chelex-100). Метод заснований на зв'язуванні продуктів клітинного лізису та інгібіторів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), таких як іони магнію, спеціальним хелатуючим реагентом [15]. Аналіз поліморфних маркерів проводили методом ПЛР і поліморфізму довжин рестриктних 56075 4 фрагментів (ПДРФ) з використанням відповідних праймерів. Реакційна суміш загальним об'ємом 24 мкл для проведення ПЛР включає наступні реагенти: вода вільна від нуклеаз, буфер 10-Х КСl; MgCl2; 2mMdNTP; прямий та зворотній праймери, Taq полімераза і геномна ДНК. Однонуклеотидну заміну, локалізовану в другому інтроні гена адипонектину (SNP G276T (регіон IVS2+62G>T) [14] визначали шляхом ампліфікації в полімеразній ланцюговій реакції. Були використані прямий (ADIPOQ276F GGCCTCTTTCATCACAGACC) і зворотній (ADIPOQ276R AGATGCAGCAAAGCCAAAGT) праймери і ендонуклеаза BsmI (BsaMI, Mval269I) [15, 16]. Як маркер молекулярної маси була використана ДНК pUC19, гідролізована ендонуклеазою MspI. Програма ампліфікації включала стандартно попередню денатурацію при 94 °С протягом 5 хвилин з подальшими 30-35 циклами відпалу при специфічній для кожної пари праймерів температурі, елонгації ланцюгу при 72 °С (1 хв.) і денатурації при 94 °С (1 хв.). Програму завершувала фінальна елонгація при 72 °С протягом 5 хвилин. Розділення фрагментів ДНК після рестрикції проводили за допомогою електрофорезу в 2 % агарозному гелі, що містить 0,5 мг/мл етидиум бромиду при напрузі 65-100 вольт протягом 60 хвилин і візуалізували в УФ-світлі. Електрофореграма ПЛР-продуктів (фіг. 1) дає уявлення про генотипи донорів по гену ADIPOQ (М - маркер молекулярної маси ДНК pUC19, гідролізованої ендонуклеазою MspI. Довжина рестрикційних фрагментів ДНК: 501; 489; 404; 331; 242; 190; 147; 111; 110; 67; 34; 26 пар нуклеотидів (підкреслені фрагменти, які не видно в агарозному гелі); 18 - ДНК донорів з різними генотипами). У досліджуваних пробах одна смужка, відповідає фрагменту ДНК розміром 196 пар нуклеотидів, в зразках 1 і 2 вказує на гомозиготний генотип GG. У зразку 4, 5 і 8 (генотип 77) дві смужки представляють фрагменти ДНК завдовжки 135 і 62 пар нуклеотидів. Три смужки (199, 134 і 62 пари нуклеотидів) в зразках 3, 6 і 7 свідчать про гетерозиготний генотип TG. За нашими даними, частоти алелей гена ADIPOQ значуще не відрізняються у чоловіків і жінок, а також у росіян і українців, а також у хворих на ЦД 2 типу і здорових людей. Розбіжності між хворими і здоровими стосуються розподілу генотипів: у хворих на ЦД 2 типу спостерігається надлишок обох гомозигот GG i TT і нестача гетерозигот GТ(табл. 1). Таблица 1 Частоти генотипів за однонуклеотидним поліморфізмом гена ADIPOQ у хворих на цукровий діабет 2 типу і здорових людей Група Здорові Цукровий діабет 2 типу GG 6,8±2,5 28,8±4,2 Генотип, % GT 76,7±4,2 43,5±4,6 ТТ 16,5±3,7 28,7±4,2 5 56075 На підставі цих даних одержані показники відносного ризику. Для індивіда з генотипом GG ймовірність захворіти на ЦД 2 типу в 4,23 рази перевищує середнє популяційне значення, для індивіда з генотипом ТТ ризик, підвищений в 1,74 6 разів. Гетерозиготність за поліморфізмом GT ADIPOQ є фактором антиризику ЦД 2 типу – ймовірність захворювання для індивіда з генотипом GT в два рази менше, ніж в середньому в популяції (табл.2). Таблиця 2 Оцінка ризику захворювання на цукровий діабет 2 типу в залежності від генотипу за однонуклеотидним поліморфізмом гену ADIPOQ Чинник Генотип, % GT 0,57±0,12 0,33 0,81 GG 4,23±0,39 3,45 5,01 Відносний ризик 95 % довірчий інтервал Спосіб було апробовано в клініці ДУ «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського» АМН України на 96 хворих на ЦД 2 типу. Для оцінки ризику підраховували відношення шансів OR (odds ratio) [18]. Цей показник розраховували за допомогою чотирипільної таблиці. Якщо клітини таблиці позначити а (хворий з наявністю даного генотипу), b (хворий без даного генотипу), с (здоровий з даним генотипом), d (здоровий, що не має даного генотипу), то відношення шансів дорівнює: OR=ad/bc. Для знаходження статистичної похибки показника OR використовували : логарифмічну шкалу. Для цього находили натуральний логарифм OR ТТ 1,74±0,27 1,20 2,28 (lnOR), а його статистичну похибку slnOR розраховували за формулою: SlnOR= (1/a+1/b+1/c+1/d). Статистичну похибку slnOR використовували для знаходження довірчого інтервалу (ДІ) логарифма відношення шансів In OR: ДІ: lnOR±tslnOR де t - критерій Стьюдента, для 95 % інтервалу t=2. Потім за допомогою операції експонування знаходили довірчий інтервал для OR. 95 % ДІ OR: exp(lnOR-tslnOR) exp(lnOR+tslnOR) Отримані дані наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Відношення шансів для різних генотипів Генотип GG ТТ GG, TT GT a 32 33 65 50 Вихідні дані b с 7 71 70 17 50 24 65 79 d 108 98 79 24 Як бачимо з табл. 3, генотип GG збільшує шанс захворіти на ЦД 2 типу в сім разів, а генотип ТТ в 2,7 рази. Гомозиготність за вивченим поліморфізмом збільшує, а гетерозиготність (GT) зменшує ймовірність захворіти на цукровий діабет в чотири рази. Даний висновок узгоджується з верифікованою у хворих на цукровий діабет 2 типу - носіїв OR lnOR slnOR 95 % ДІ OR 6,95 2,72 4,28 0,23 1,94 1,00 1,45 -1,45 0,44 0,32 0,30 0,30 2,91-16,59 1,45-5,11 2,38-7,70 0,13-0,42 гетерозиготного генотипу (GT) меншою виразністю метаболічного компоненту інсулінорезистентності (підвищений рівень неетерифікованих жирних кислот у сироватці крові) порівняно з визначеним у хворих з гомозиготними генотипами (GG, ТТ) (табл. 4). Таблиця 4 Рівень неетерифікованих жирних кислот у сироватці крові хворих на цукровий діабет 2 типу Генотип GG ТТ GT Примітка: *- р