Спосіб генетичного маркування і відбору дерев з великою кількістю гетерозиготного насіння у природних популяціях сосни кедрової європейської

Спосіб генетичного маркування і відбору дерев з великою кількістю гетерозиготного насіння у 3 теринських рослин. Відомо, що генетичні особливості дорослих рослин обумовлюють генетичну якість насіння. Як найближчий аналог вибрано спосіб відбору життєздатних, потенційно високопродуктивних рослин хвойних за рахунок визначення їх генетичної різноманітності на прикладі сосни звичайної, в якому аналізують 3 ізоферментні локуси неспецифічних естераз хвої сіянців [2]. Ці локуси використовують для визначення якісного вмісту білків, аналізуючи отриману електрофоретичним шляхом ділянку ізоферментного спектру, що кодує синтез естераз, і виділяють рослини, які мають максимальну або близьку до неї генетичну гетерогенність даної ділянки. Загальними ознаками корисної моделі, що заявляється, і найближчого аналогу є спосіб селекційного відбору рослин хвойних, що характеризуються кращими генетичними показниками, використовуючи як генетичні маркери ізоферментні локуси. Однак, в описаному способі аналізувались лише сіянці, з яких до створення штучних насаджень рекомендовано використовувати окремі, що мають найбільшу генетичну різноманітність. Але для створення лісонасіннєвих плантацій хвойних необхідно проводити пошук таких дерев та генетичних маркерів (ізоферментних локусів), за якими можливо відбирати рослини, що продукують насіння з покращеними генетичними якостями (гетерозиготне). При цьому слід мати на увазі, що ізоферментні локуси як генетичні маркери материнського дерева мають видову специфіку. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб генетичного маркування у природних популяціях сосни кедрової європейської дерев, що продукують насіння з великою кількістю гетерозигот. Поставлена задача вирішується тим, що у способі генетичного маркування дерев сосни кедрової європейської з великою кількістю гетерозиготного насіння, відповідно до корисної моделі, як генетичний маркер використовують ізоферментні локуси алкогольдегідрогенази Adh-1 і фосфоглюкомутази Pgm-1. Пошук генетичних маркерів дерев сосни кедрової європейської, що продукують насіння з під 65366 4 вищеною гетерозиготністю, здійснювали використовуючи 6 поліморфних локусів, що кодують синтез ізоферментів 5 ген-ферментних систем: алкогольдегідрогенази (локус Adh-1), форміатдегідрогенази (Fdh), глутаматдегідрогенази (Gdh), малатдегідрогенази (Mdh-2, Mdh-4), фосфоглюкомутази (Pgm-1). Генотипи материнських дерев визначають шляхом електрофоретичного розділення ізоферментів тканин гаплоїдних мегагаметофітів (ендоспермів) насіння, генотипи потомства - диплоїдних тканин зародків насіння. Для встановлення генотипу кожного дерева аналізували 8 випадково обраних насінин із різних шишок, оскільки вірогідність помилкового віднесення гетерозиготних дерев до гомозиготних розраховують із співвідноn-1 шення Р=0,5 (де n - кількість ендоспермів). Електрофорез ізоферментів ендоспермів та зародків насіння проводили одночасно на сусідніх доріжках у крохмальному гелі. Отримані ізоферментні спектри використовували у визначенні генотипів дерев та їх потомства. Вирішення технічної задачі корисної моделі полягає у тому, що на основі порівняльного аналізу кількості гетерозиготних дерев і зародків їх насіння встановлюють ізоферментні локуси материнських рослин, за якими визначають кількість гетерозиготного потомства. Технічний результат способу генетичного маркування дерев полягає у тому, що при створенні лісонасіннєвих плантацій сосни кедрової європейської використовують насіння з дерев, що продукують велику кількість гетерозиготних зародків за локусами Adh-1 і Pgm-1, що дозволяє мінімізувати частку гомозиготних проростків. Приклад реалізації запропонованого способу. Приклад 1 Вивчали 51 дерево з двох природних популяції сосни кедрової європейської в Українських Карпатах: популяція Яйко (27 дерев) та популяція Горгани (24 дерева). Сукупна вибірка зародків насіння з цих дерев склала 411. За досліджуваними локусами на основі аналізу електрофоретичних спектрів встановлено 17 генотипів материнських дерев (табл. 1). Таблиця 1 Кількість гомо- та гетерозиготних материнських рослин та кількість гетерозиготних зародків насіння, що вони продукують, частка гетерозиготного насіння у популяції сосни кедрової європейської за даними ізоферментних локусів Локус Adh-1 Генотипи мате- Кількість генотипів материнських Загальна кількість Частка гетерозиготного ринських росрослин, шт. гетерозиготних зароднасіння, % лин ків насіння, шт. Загальна що має гетерозиготні зародки насіння AB 9 9 37 51,4 BB 30 24 52 24,8 ВС 2 2 6 37,5 BD 9 9 39 54,2 CD 1 1 3 37,5 5 65366 6 Продовження таблиці 1 Локус Fdh Gdh Mdh-2 Mdh-4 Pgm-1 Генотипи мате- Кількість генотипів материнських Загальна кількість Частка гетерозиготного ринських росрослин, шт. гетерозиготних зароднасіння, % лин ків насіння, шт. Загальна що має гетерозиготні зародки насіння AA 49 13 16 4,1 AB 2 2 8 50,0 AA 49 3 3 0,8 AB 2 2 9 56,3 AB 5 5 14 35,0 BB 46 5 11 2,9 AA 7 7 24 42,9 AB 22 22 89 50,6 BB 22 22 51 28,9 AB 10 10 37 46,3 BB 38 17 20 6,6 ВС 3 3 11 45,8 Примітка. Латинськими літерами умовно позначено гени. Гомозиготні рослини позначено однаковими літерами, гетерозиготні - різними. Встановлено, що за більшістю досліджуваних нами локусів (Adh-1, Fdh, Gdh, Mdh-2 i Pgm-1) переважна кількість генотипів дерев гомозиготні, і не всі вони формують гетерозиготне потомство. Цим зумовлена в цілому невелика частка гетерозиготного насіння, що продукують гомозиготні дерева в популяціях сосни кедрової європейської. Усі гетерозиготні рослини продукують гетерозиготне потомство, тому його частка у гетерозиготних дерев більша, ніж у гомозиготних. Слід зазначити, що серед усіх гетерозиготних рослин дерева з генотиАВ пом Mdh-4 продукують переважну частку гетерозиготного потомства (див. табл. 1). Крім того, дерева з цим генотипом були найбільш чисельними (22 дерево з загальної кількості 51) у порівнянні з гетерозиготними рослинами за іншими локусами (див. табл. 1, табл. 2). Але окрім гетерозиготних генотипів дерев за локусом Mdh-4 у популяціях сосни кедрової європейської встановлено наявність у значній кількості альтернативних гомозиготних рослин (22 і 7 дерев відповідно з генотипами BB AA Mdh-4 і Mdh-4 ) (див. табл. 1, 2), тобто дерев, гомозиготних за різними алелями цього локусу. Тому гетерозиготне потомство за локусом Mdh-4 могло утворитися не безпосередньо від гетерозиготних материнських дерев, а від перехресного запилення альтернативних гомозиготних рослин. Через це ізоферментний локус Mdh-4 не доцільно використовувати в якості маркерного для відбору дерев при створенні лісонасіннєвих плантацій сосни кедрової європейської. Таблиця 2 Кількість гетерозиготних зародків насіння та їх співвідношення з гетерозиготними материнськими рослинами у популяції сосни кедрової європейської за даними ізоферментних локусів Локус Adh-1 Fdh Gdh Mdh-2 Mdh-4 Pgm-1 Кількість материнських рослин, шт. Кількість гетерозигот- Співвідношення кількості гетерозиготгетерозиготних альтернативних них зародків насіння, них зародків насіння до гетерозиготних шт. материнських рослин гомозиготних 21 0 137 6,5 2 0 24 12 2 0 12 6 5 0 25 5 22 22/7 164 7 13 0 68 5,2 Примітка. Через дріб наведено кількість альтернативних гомозиготних материнських рослин. Велику кількість гетерозиготних дерев (21) встановлено також за локусом Adh-1 (див. табл. 2). Але на відміну від локусу Mdh-4, вони предстаАВ влені не одним генотипом, а чотирма: Adh-1 , ВС BD CD Adh-1 , Adh-1 і Adh-1 (див. табл. 1). Серед АВ BD них дерева з генотипами Adh-1 і Adh-1 присутні у більшості та частка гетерозиготного насіння, що вони продукують, перевищувала 50 %. Подібну картину відмічено і для локусу Pgm-1. ГетерозигоAB тних дерев з генотипом Pgm-1 достатня кількість і вони формують 46,3 % гетерозиготного насіння (див. табл. 1, 2). Локуси Adh-1 і Pgm-1 можна використовувати як маркери при відборі дерев сосни кедрової європейської, що продукують гетерозиготне потомство. Насіння гетерозиготних дерев з AB BD AB генотипами Adh-1 , Adh-1 і Pgm-1 дозволить 7 мінімізувати частку гомозиготних проростків у штучних насадженнях. Таким чином, спосіб дозволяє використовувати ізоферментні локуси Adh-1 і Pgm-1 як генетичний маркер для відбору гетерозиготних за ними дерев у популяціях сосни кедрової європейської. Ці дерева, що продукують велику кількість гетерозиготного насіння, необхідно використовувати при створенні лісонасіннєвих плантацій цього корисного лісогосподарського виду. Комп’ютерна верстка М. Ломалова 65366 8 Джерела інформації: 1. А. с. 1517859 СССР МКИ А 01 Н 1/4. Способ идентификации родительских и гибридных форм кукурузы / Крестников И.С, Ступа Л.Я. - 1989. 2. А. с. 1281216 СССР МКИ А 01 Н 1/4, А 01 G 23/00. Способ отбора сеянцев хвойных растений / Духарев В.А., Животовский Л.А. - 1987 (найближчий аналог). Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601