Спосіб мікроклонального розмноження видів saussurea disckolor (willd.) dc. тa saussurea porcii degen

Спосіб мікроклонального розмноження Saussurea discolor (Willd.) DC. та Saussurea porcii Degen, що включає стерилізацію вихідного рослинного матеріалу, субкультивування експлантів на поживному середовищі та отримання рослинрегенерантів, який відрізняється тим, що вихід 3 65665 індолілацетату (IOК), 1/0,5 мг/л 6-бензамінопурину (БАП) та 60 мг/л цистеїну. Отримання рослинрегенерантів проводять на половинному вмісті мінеральних компонентів за Мурасіге-Скуга у присутності 0,1 мг/л IOК та 0,01 мг/л БАП. Культивування експлантів здійснюють при 16-ти годинному фотоперіоді та температурі 21±2 °C. Форма заліза є лімітуючим фактором при культивуванні S. discolor та S. роrсіі. Тільки за умов 2+ присутності Fe у хелатній формі спостерігається активний ріст і розвиток експлантів, при наявності 3+ у складі поживного середовища Fe відбувається поступова їх загибель. Додавання в поживне середовище 0,1 мг/л IOК та 1 мг/л БАП на перших етапах культивування стимулює утворення конгломерату пагонів і збільшення коефіцієнту його розмноження, в результаті чого збільшується процент виходу пробіркових рослин. Зменшення кількості фітогормонів до 0,05 мг/л IOК та 0,5 мг/л БАП (після 5 пасажу) дозволяє проводити субкультивування S. discolor та S. роrсіі більшою тривалістю без зменшення коефіцієнта розмноження. При культивуванні S. discolor та S. роrсіі потрібно застосовувати як антиоксидант цистеїн у кількості 60 мг/л, що запобігає загибелі експлантів від окислення. Збільшення температурних меж культивування до 25-27 °C призводить до зниження росту експлантів та зменшення коефіцієнта розмноження. Спосіб дозволяє підвищити коефіцієнт розмноження генетично стабільних і вільних від інфекцій рослин. На фігурі 1 наведено ріст експлантів S. discolor (а) та S. роrсіі (б) на середовищах з 0,1 мг/л IOК та 1 мг/л БАП. На фігурі 2 наведено ріст експлантів S. discolor на середовищі з 0,05 мг/л IOК та 0,5 мг/л БАП. На фігурі 3 наведено формування кореневої системи у експлантів S. discolor на середовищі з 0,1 мг/л IOК та 0,01 мг/л БАЛ. На фігурі 4 наведено рослини-регенеранти S. discolor після висадки у перліт. 4 Спосіб здійснюють наступним чином. У вимиті і висушені ємності наливають 20 мл агаризованого середовища, закривають фольгою та автоклавують 35 хв. при 1,1 атм і температурі 121 °C. Стерилізацію вихідного рослинного матеріалу (насіння) проводять послідовно із застосуванням 96 % етанолу, з додаванням TWEEN-80 (2±0,1 хв.) та розчину гіпохлориду натрію, збагаченого активним хлором (промисловий препарат "Білизна", ТУУ605743160.001-93) у співвідношенні 14 (15±0,1 хв.) та відмивають тричі стерильною дистильованою водою. Стерильне насіння висаджують на поживне середовище Мурасіге-Скуга, що містить 0,1 мг/л IOК, 1 мг/л БАП та 60 мг/л цистеїну. Після 5 пасажу експланти пересаджують на поживне середовище, де вдвічі зменшені кількості фітогормонів (0,05 мг/л IOК та 0,5 мг/ БАП). Мікрочеренкування експлантів проводять в ламінар-боксі. Пробіркові рослини з сформованим конгломератом пагонів вилучають із ємності і черенкують на стерильній чашці Петрі. Стимуляція коренеутворення відбувається на середовищі з половинним вмістом мінеральних компонентів за Мурасіге-Скуга та 0,1 мг/л IOК на фоні 0,01 мг/л БАП. На етапі акліматизації рослини вирощують під поліетиленовим ковпаком та раз на тиждень здійснюють їх полив розчином з половинним вмістом мінеральних компонентів за МурасігеСкугом. Культивування проводять в кліматичній кімнаті (21±1 °C, відносна вологість повітря 70 %, інтенсивність освітлення 2000-3000 лк і 16-годинний фотоперіод) при тривалості пасажу 28 днів. Для отримання первинних експлантів насіння стерилізують за загальнопринятою схемою, що включає залучення дитергентів, стерилізуючих агентів та багаторазову промивку у стерильній дистильованій воді. Нами апробовано різні схеми стерилізації, що відрізнялися як за самими стерилізуючими агентами, так і за їх концентрацією, співвідношенням та тривалістю обробки (табл. 1). При застосуванні останньої схеми стерилізації вдається досягти 98 % виходу асептичного матеріалу. Таблиця 1 Схема стерилізації насіння рослин роду Saussurea DC Стерилізуюча речовина 70 % етанол "Білизна" 15 96 % етанол "Білизна" 15 96 % етанол + Tween 80 Н2О2 - 15 % 96 % етанол + Tween 80 "Білизна" 15 Н2О2 - 15 % 96 % етанол + Tween 80 "Білизна" 14 Тривалість обробки 2хв. 10 хв. 2хв 10 хв. 2 хв. 5 хв. 2хв 10 хв. 5 хв. 2 хв. 15 хв. Промивка (15 хв) Результат стерилізації стерильна дистильована вода стерильна дистильована вода стерильна дистильована вода 100 % зараження, потемніння тканин 60 % зараження, потемніння тканин 30 % зараження, потемніння тканин стерильна дистильована вода 30 % потемніння тканин стерильна дистильована вода 98 % вихід життєздатних експлантів 5 65665 Доцільність саме такої тривалості обробки стерилізуючими агентами зумовлена вузькими межами виходу життєздатних асептичних експлантів. В процесі підбору оптимального мінерального складу поживного середовища нами були апробовані середовища Мурасіге-Скуга, Уайта, Гамбурга. Встановлено, що для культивування S. discolor та S. роrсіі лімітуючим фактором є форма заліза, присутня у середовищі. Тільки за умов присутності у ньому двовалентних іонів у хелатній формі (з Nа2ЕДТА) спостерігається активний ріст і розвиток експлантів, тоді як наявність у складі поживного середовища тривалентного заліза призводила до їх поступової загибелі. Тому, за основу приготу 6 вання поживного середовища нами було обране середовище Мурасіге-Скуга, яке є оптимальним для індукції морфогенезу у більшості рослин і містить двовалентні іони заліза. Стерильне насіння висаджують на поживне середовище, що містить макро- і мікроелементи за Мурасіге-Скугом, Fe-хелат, 30 г/л сахарози, вітаміни за Уайтом агар-агар і доповнене 60 мг/л цистеїну та фітогормонами (табл. 2). Появу пагонів S. discolor з двома справжніми листками спостерігали на 20-24 день культивування, тоді як насіння S. роrсіі потребує для проростання тривалішого періоду часу, більшого в середньому на 3-4 дні. Таблиця 2 Гормональний склад поживних середовищ, використаних для культивування S. discolor та S. роrсіі Тип середовища IOК ІМК НОК (прототип) 0,1 мг/л 0,05 мг/л 0,01 мг/л 0,05мг/л 0,01 мг/л 0,05мг/л Культивування на фоні 1 мг/л Кін (прототип) Оптимальний розвиток експлантів Видозміни та пожовтіння експлантів Оптимальний розвиток експлантів Видозміни та пожовтіння експлантів Нормальний розвиток експлантів, пожов- Інтенсивний калусогенез, пожовтіння тіння листків листків Первинний калус, пожовтіння листків Інтенсивний калусогенез Видозміни стебла та листкової пластинки Почорніння та загибель експлантів Видозміни листка та листкової пластинки Загибель експлантів Культивування на фоні 1 мг/л БАП На основі порівняльного аналізу морфометричних показників експлантів впродовж першого пасажу було встановлено недоцільність використання НОК та Кін для культивування in vitro S. discolor та S. роrсіі. Також відмічено, що середовища з підвищеним вмістом ауксинів на фоні 1 мг/л БАП не придатні їх для культивування. Це проявлялося у розвитку ознак порушення гормонального балансу: скручення листків в трубочку, вітрифікація експлантів та поява первинного калусу. За умов культивування з 0,1 мг/л IOК чи 0,01 мг/л ІМК на фоні БАП подібні зміни практично не виникали (фіг. 1). Впродовж першого пасажу висаджені експланти формували конгломерат пагонів. Частота регенерації рослин на цих середовищах становила 100 %. Наприкінці першого пасажу коефіцієнт розмноження експлантів S. discolor та S. роrсіі, культивованих на поживних середовищах з 0,1 мг/л IOК на фоні 1 мг/л БАП зафіксований у межах 3 (табл. 3). Таблиця 3 Коефіцієнт розмноження експлантів видів роду Saussurea DC. (M±m, n=6, p0,05) Вміст фітогормонів 0,1 мг/л IOК 1 мг/л БАП Тривалість культивування 1 пассаж 3 пассаж S. discolor 3,7±0,28 8,5±0,64* S. porcii 2,8±0,19 6,7±0,49* Примітка: 1) не менше 15 рослин на кожному середовищі в одному досліді, 2) * - достовірна різниця відносно 1 пасажу До кінця третього пасажу всі рослини кожного окремо взятого досліду досягають практично однакових розмірів. Тобто, відмінності, пов'язані з різницею у тривалості проростання насіння, зникають. Для всіх експлантів, культивованих на оптимальних середовищах, у подальшому відмічене різке зростання коефіцієнту розмноження, який наприкінці третього пасажу достовірно збільшувався і становив близько 8. При тривалому культивування S. discolor та S. роrсіі (більше 5 пасажів), існує потреба у зменшенні кількості фітогормонів в складі поживного середовища, що підтверджено комплексом біохімічних досліджень. Враховуючи отримані біохімічні показники та морфологічну характеристику культивованих експлантів субоптимальним для тривалого культивування S. discolor та S. роrсіі виявилося середовище, що містило удвічі менші кількості 7 фітогормонів (0,05 мг/л IOК та 0,5 мг/л БАЛ) (фіг. 2). Із урахуванням виснаження середовища та накопичення в ньому фенольних сполук та з метою усунення окислення рослинного матеріалу у поживне середовище необхідно додавати цистеїн у концентрації 60 мг/л. Стабільність культивованого матеріалу підтверджена ізоензимним аналізом експлантів із залученням ізоформ пероксидаз та естераз. У процесі підбору середовища для вкоріння головна увага була звернена на особливості формування кореневої системи. Додавання IOК у концентрації 0,1 мг/л на фоні 0,01 мг/л БАЛ стимулювало процес коренеутворення, причому розвитку калуса на зрізі пагонів не відбувалося (фіг. 3). Для запобігання зневодненню і в'яненню рослин-регенерантів на етапі адаптації ми використовували попередню висадку вкоріненнях рослин в стерильний перліт, який прикривали поліетиленовим ковпаком чи плівкою (фіг. 4). Підживлення Комп’ютерна верстка М. Ломалова 65665 8 рослин, що вирощувались на перліті, здійснювали щотижня розчином, що містив ½ неорганічних солей за Мурасіге-Скугом. За умови успішного адаптування рослин (поява нових листків) проводили поступове їх загартування. При встановленні стабільного пристосування захисний ковпак знімали остаточно. Отримані рослини-регенеранти S. discolor та S. роrсіі з обширною кореневою системою, добре розвинутими листками при висадці в ґрунтові суміші легко адаптуються до умов in vivo, що забезпечує їх високе приживлення до 80 %. Джерела інформації: 1. CN 101473790 (А), А01Н4/00, 07.08.2009. Clump seedling of tissue culture of Saussurea involucrata Kar. et Kin. and large scale successive transfer culture method thereof. 2. Joshi M, Dhar U. In vitro propagation of Saussurea obvallata (DC.) Edgew. - an endangered ethnoreligious medicinal herb of Himalaya // Plant Cell Rep. - 2003. -V. 21 (10).-P. 933-939. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601