Спосіб оцінки генотоксичності водного середовища

1. Спосіб оцінки генотоксичності водного середовища, який включає введення в досліджуване середовище тест-організму і визначення генотоксичності водного середовища, який відрізняється 3 67315 4 Винахід спрямований на вирішення задачі щодосить міцні, за допомогою стандартних методів до підвищення чутливості способу, проведення не вдалося. Наприклад, фіксатор Кларка - станприжиттєвого мікроядерного аналізу на клітинах дартний для каріологічних досліджень надмірно хвостового плавця риб, збереження риб живими і ущільнював матеріал. А мацеруючий розчин, 45% можливості їхнього періодичного використання в оцтова кислота, який використовується для експериментах, здешевлення способу розділення тканини на окремі клітини, руйнував біотестування. клітинну стінку. В результаті аналізу різних У способі, що заявляється, пропонується фіксуючих розчинів, була відібрана оцтоводосліджувати частоту клітин з мікроядрами in vivo, гліцеринова суміш: 10% розчин оцтової кислоти на що утворюються в досліджуваному середовищі, і 10% розчині гліцерину. Ця суміш є одночасно і використовувати як джерело клітинного матеріалу фіксатором, і мацератором. Вона м'яко фіксує ткамітотично інертну тканину - плавець. нину і розділяє її на окремі клітини, при цьому До цього часу дана тканина не використовуваотримуємо суспензію цілих клітин, з якої легко прилась з цією метою тому, що вона не є мітотично готувати цитологічний препарат. активною, тобто поділ клітин в ній практично не Свого вирішення потребувала і проблема вивідбувається. В той час як мікроядерний тест бору оптимального барвника для клітин хвостовопередбачає фіксацію порушень, що відбуваються го плавця. Для забарвлення клітин використовусаме під час мітозу, активного поділу клітин. Для вали не оцтові барвники (ацетокармін чи вирішення цієї проблеми, тобто стимулювання ацетоорсеїн), а стандартний розчин азуреозину за поділу клітин тканини й одержання такої кількості Романовським. Даний метод також покращує клітин на стадії мітозу, що є достатньою для проякість цитологічних препаратів приготовлених з ведення мікроядерного тесту, тканина плавця на клітин зябер. початку експерименту механічно ушкоджується Запропонований спосіб дослідження якості (відрізається смужка кайми плавця по всій його водних проб за допомогою мікроядерного аналізу довжині на глибину 2-3 мм). Регенерація на клітинах хвостового плавця риб дозволяє проушкодженої тканини відбувається в водити прижиттєву діагностику генотоксичності досліджуваному розчині, тобто утворення нових водного середовища на одному і тому ж тестклітин відбувається в умовах аналізованого організмі. На початку експерименту (перед посадзовнішнього впливу. Для цитологічного аналізу кою риби в дослідний розчин), відрізається смужка використовується знов утворена, регенерована хвостового плавця шириною 2-3мм. Риба тканина, на клітинах якої проводять мікроядерний залишається в експериментальному розчині на 3-5 аналіз на генотоксичність. діб. За цей час наростає достатня для аналізу Дослідження проводяться на тканині, а, отже, і кількість регенерованої тканини. клітинах, що контактують безпосередньо з В способі для проведення біотестування досліджуваним водним зразком; на відміну від використовується нова тканина, мітотична клітин внутрішніх органів, де відбувається активність клітин тканини досягається шляхом її біотрансформація досліджуваної речовини в механічного ушкодження, а висока чутливість спорезультаті її взаємодії з організмом. Нижче по тексобу шляхом регенерації тканини в сту наводиться приклад із хлоралгідратом, що досліджуваному розчині, а також безпосереднім руйнується в живому організмі, тому на клітинах контактом клітин плавця з розчинними речовинакрові не спостерігається ніяких генотоксичних ми. наслідків, а на клітинах плавця, як і на клітинах Приклад виконання способу зябер, що безпосередньо контактують з водним Риба за добу до початку експерименту - для розчином, ці ефекти фіксуються - це значно адаптації - переноситься з культуральних підвищує чутливість заявляємого способу. акваріумів (об'ємом 33 або 100л) у скляні 3-х Відмінністю способу є збереження риб живими літрові акваріуми з контрольною водою. Вода пов ході експерименту, їх можна використовувати винна бути тієї ж температури і добре насичена багаторазово на відміну від прототипу, де тварин киснем. На початку експерименту у риб потрібно забивати. відрізається частина хвостового плавця (це нульоЗаявляємий спосіб підвищує ефективність і ва відмітка експерименту). Далі у воду додають і вірогідність отриманих результатів, зменшує добре розмішують експериментальний маточний вартість процедури аналізу (внаслідок значного розчин, доводячи його до необхідної концентрації. зменшення кількості риб, що використовується у Риб культивують в досліджуваних розчинах протядосліді, суттєвого зменшення об'єму гом 3-5 днів. Вода періодично аерується. Фіксують досліджуваних розчинів, значної економії ті частини хвостового плавця, що відросли (регереактивів і матеріалів, що потребує експеримент), нерували) після їхнього надрізання. відповідає вимогам біоетики. Фіксацію проводять в оцтово-гліцериновому В результаті експериментальних досліджень фіксаторі (10%-ний розчин льодової оцтової кивиявлено, що на 3-5 добу експозиції кількість слоти на 10%-ному водному розчині гліцерину). У регенерованої тканини (смужка шириною 2-3 мм) є цьому розчині тканину залишають не менш ніж на цілком достатньою для приготування цитологічних добу, після чого тканину поміщають на предметне препаратів і подальшого їх аналізу. скло й акуратно, препарувальною голкою перетвоОднією з необхідних умов мікроядерного рюють її в суспензію. З краплі отриманої суспензії аналізу є наявність цілих клітин на препараті для кліток готують мазок, що сушать протягом 30 і чіткої ідентифікації хромосомних порушень. Досягбільше хв. Мазки докрашують розчином азуреозити цього на даній тканині, в якій міжклітинні зв'язки на за Романовським 5хв., після чого мазок покри 5 67315 6 вають покривним склом (по можливості уникаючи том цієї тканини з токсичною речовиною. Тому появи повітряних пухирців), накладають зверху поява клітин з порушеннями мітозу фільтр і придавлюють, відбираючи зайвий барвспостерігається вже на другу добу експерименту. ник. Зниження показника генотоксичності на п'яту добу Проведена апробація мікроядерного тесту на також можна пояснити проліферативною клітинах хвостового плавця риб в порівнянні з активністю даної тканини і її швидкою іншими, стандартними для цитогенетичних оновлюваністю. досліджень, тканинами. Аналіз проводили на На клітинах хвостового плавця впродовж всьоклітинах крові, зябер та клітинах хвостового плавго експерименту значно зростав рівень клітин з ця. В якості експериментального розчину викорипорушеннями мітозу, починаючи вже з 2 доби стовували розчин відомої своїми генотоксичними (Таблиця 1). На відміну від клітин зябер значення властивостями речовини хлоралгідрату даного показника залишалося високим впродовж (Сl3ССН(ОН)2). Хлоралгідрат є аналогом всього експерименту. Вже після двох діб дії снодійного транквілізатора, його вплив на хлоралгідрату рівень клітин з мікроядрами в плавмітотично-активні клітини тварин і рослин був опицях підвищився до 10,67% у порівнянні з 4%о в саний ще на початку XX ст. Концентрація контролі. Після 3, 4 та 5 діб частота мікроядер на хлоралгідрату - 0,04% була відібрана спираючись клітинах хвостового плавця продовжувала зростана літературні дані та попередні експерименти, що ти до 14,0%, 18,67% та 20,0% відповідно (Таблиця проводились на клітинах рослин та хвостового 1). Рівень двоядерних клітин також підвищувався плавця карася. Саме ця концентрація виявилась впродовж експерименту: від 1,33% в контролі до такою, що повністю не гальмувала мітоз. 6,67% після 5 діб експозиції з хлоралгідратом. Забій риб та фіксацію матеріалу проводили Таким чином, на клітинах зябер та клітинах через 2, 3, 4 та 5 діб після початку експерименту. хвостового плавця було зафіксовано гострий геноРезультати дослідження генотоксичності розчину токсичний вплив розчину хлоралгідрату. Тобто хлоралгідрату на різних тканинах карася найбільший генотоксичний ефект хлоралгідрат представлені в Таблиці. проявляє в тому випадку, коли безпосередньо В крові загальний рівень клітин з порушеннями контактує з клітинами, на яких проводиться мітозу під час експерименту достовірно не цитологічний аналіз. Клітини плавця були відрізнявся від контрольного (Таблиця 1), тільки на найбільш придатною для аналізу тканиною, тому 4 добу експерименту спостерігаємо достовірне що доля клітин з мікроядрами зростала найбільш збільшення даного показника від 1,33% в контролі суттєво і впродовж всього експерименту. Вже чедо 5,33% в розчині хлоралгідрату. Якщо окремо рез 2 доби дії токсичної речовини спостерігався розглядати зміну рівня еритроцитів з мікроядрами майже триразовий ріст порушень мітозу в клітинах та двоядерних еритроцитів (Таблиця 1), то бачицієї тканини. мо, що клітини з мікроядрами з'являлись в крові Отже запропоновано оригінальний спосіб лише на 4 добу дії хлоралгідрату. Рівень двоядербіотестування генотоксичності водного середовиних клітин на 4 добу зріс на 2% (Р