Спосіб поєднаного виявлення гемомікроциркуляторного русла та паренхімо-стромально-нейро-вазальних співвідношень у органах шляхом ін’єкції судин та імуногістохімічної ідентифікації integrin b1 і synaptophysin із

Реферат: Спосіб поєднаного виявлення гемомікроциркуляторного русла та паренхімо-стромально-нейровазальних співвідношень у органах полягає в ін'єктуванні кровоносних судин із наступним забарвленням виготовлених зрізів. Проводиться тонка ін'єкція кровоносних судин хлороформною сумішшю дрібнодисперсної фарби "Парижская синяя" з наступною імуногістохімічною ідентифікацією Integrin В1 і Synaptophysin (маркери синапсів, нервових сплетень) та дозабарвленням гематоксиліном Маєра. UA 68799 U (12) UA 68799 U UA 68799 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної медицини, а саме до імуногістоморфологічних методів досліджень, і може бути використана для дослідження паренхімо-стромально-нейро-вазальних співвідношень у різноманітних органах. Створення зазначеної моделі зумовлене тим, що на сьогоднішній день у сучасній морфології практично відсутні методики, при використанні яких у достатній мірі можна було б вивчати нейро-, гісто- та ангіоструктуру одночасно. Використання даної методики дозволить не тільки паралельно вивчати будову гемомікроциркуляторного русла (ГМЦР) та структурних особливостей органів і тканин, їх нервових елементів, а й паренхімо-стромально-нейро-вазальні співвідношення. Прототипами до заявленої корисної моделі є методика поєднаного виявлення гемомікроциркуляторного русла та паренхіми тканин шляхом ін'єкції судин та фарбування гематоксиліном і еозином [Пат. 91377 Україна МПК А61В 10/00 G01N 1/30. Спосіб поєднаного виявлення гемомікроциркуляторного русла та паренхіми тканин шляхом ін'єкції судин та фарбування гематоксиліном і еозином / В. А. Левицький, О. Г. Попадинець, Т. В. КнязевичЧорна, Я. О. Колінко; заявник та патентовласник Івано-Франківський національний медичний університет. - № а200804032; заявл. 31.03.08; опубл. 26.07.10, Бюл. № 14], а також метод імуногістохімічного дослідження іннервації серця [Чумасов Е. И. Иннервация сердца крысы (иммуногистохимическое исследование) / Е. И. Чумасов, Е. С. Петрова, Д. Э. Коржевский // Морфология.-2009. - Т. 135, № 2. - С. 33-37]. Недоліками першої методики є відсутність можливості візуалізувати нервові елементи, а другої - інтраорганні кровоносні судини. В основу корисної моделі поставлено задачу створити методику шляхом ін'єкування кровоносних судин хлороформною сумішшю дрібнодисперсної фарби "Парижская синяя" з наступною імуногістохімічною ідентифікацією на гістологічних зрізах Integrin B1 і Synaptophysin (маркери синапсів, нервових сплетень) та дозабарвленням гематоксиліном Маєра, забезпечити не тільки одночасне вивчення будови ГМЦР та структурних особливостей органів і тканин, їх нервових елементів, а й паренхімо-стромально-нейро-вазальні співвідношення і зміну його в процесі онтогенезу та під впливом дії різних пошкоджуючих факторів. Поставлена задача корисної моделі вирішується тим, що спосіб поєднаного виявлення гемомікроциркуляторного русла та паренхімо-стромально-нейро-вазальних співвідношень у органах, згідно з корисною моделлю, проводиться шляхом тонкої ін'єкції кровоносних судин хлороформною сумішшю дрібнодисперсної фарби "Парижская синяя" з наступною імуногістохімічною ідентифікацією Integrin B1 і Synaptophysin (маркери синапсів, нервових сплетень) та дозабарвленням гематоксиліном Маєра, що дозволяє на гістологічному препараті вивчати топографію й архітектоніку гемомікроциркуляторного русла, нервових сплетень, клітинну будову досліджуваного органа та їх співвідношення. Принцип дії та хід процесу Після умертвіння піддослідної тварини проводять тонку ін'єкцію судин. Даний метод можна застосовувати не пізніше 6 годин після смерті тварини через грудну аорту чи інші магістральні судини ізольованих органів. Ін'єктування проводиться хлороформною суспензією художньої дрібнодисперсної ескізної фарби "Парижская синяя" в співвідношенні 5-10 г на 100 г розчину. Суспензія вводиться в кров'яне русло протягом 10-15 хв. за допомогою шприца одноразово під тиском. Ін'єкцію зупиняють при інтенсивному посинінні шкірних покривів та слизових оболонок. Труп тварини накривають зволоженою марлею і залишають на добу для того, щоб дати можливість хлороформу випаруватися. Матеріал фіксують шляхом занурення його в 10 % розчин нейтрального формаліну (рН 7,0) на 24 години. Для виготовлення нейтрального формаліну використовують одно- та двозаміщений фосфат натрію. рН розчину вимірюють рН-метром рН-150МИ. У подальшому шматочки тканини промивають у водопровідній воді впродовж 10 хвилин і поміщають у висхідну батарею спиртів для дегідратації, у дві порції хлороформу, суміш хлороформ-парафін (1:1) (при температурі 37 °C), дві порції парафіну (при температурі 57 °C). Після парафінової передпідготовки шматочки заливають у парафін (Paraplast). Із кожного парафінового блока на санному мікротомі виконують гістологічні зрізи товщиною 5-6 мкм на предметні скельця з адгезивним покриттям (Super Frost Plus). Депарафінізацію проводять за загальноприйнятою методикою із застосуванням трьох порцій ксилолу та низхідної батареї спиртів. Після регідратації фіксовані на предметних скельцях гістологічні зрізи промивають у дистильованій воді (10 хв.) та TBS-буфері (рН 7,62) - 10 хв. Для відновлення епітопів проводять теплоіндуковане демаскування у відновному розчині (Target Retrieval Solution, рН 9,0) на водяній бані при температурі 95-98 °C упродовж 35 хв. У подальшому посудину з предметними скельцями виймають із водяної бані й охолоджують упродовж 20 хв. при кімнатній температурі; предметні скельця тричі по 3 хв. промивають у TBS-буфері; надлишок буфера навколо зрізів 1 UA 68799 U 5 10 15 20 25 30 видаляють фільтрувальним папером. Блокування ендогенної пероксидази здійснюють за допомогою пероксидазного блока впродовж 15 хв. і в подальшому промивають у TBS-буфері тричі по 3 хв. Надлишок буфера навколо зрізів видаляють фільтрувальним папером. 40 хв. здійснюють інкубацію з робочими розчинами первинних антитіл: Integrin B1, MS X HU-100UL (1:1000) та Synaptophysin MS X-100UL (1:5000). Для приготування робочих розчинів використовують розчинник антитіл (Antibody Diluent, DAKO). В подальшому промивають у TBSбуфері тричі по 3 хв. Надлишок буфера навколо зрізів видаляють фільтрувальним папером. Упродовж 10 хвилин зрізи витримують у підсилювачі проникнення полімеру (системи візуалізації Poly Vue Mouse/Rabbit HPR Kit). У подальшому промивають у TBS-буфері тричі по 3 хв. Надлишок буфера навколо зрізів видаляють фільтрувальним папером. 10 хвилин проводять інкубацію зрізів із кон'югатом анти-мишачих антитіл із полімером та пероксидазою хрону (системи візуалізації Poly Vue Mouse/Rabbit HPR Kit). У подальшому промивають у TBS-буфері тричі по 3 хв. Надлишок буфера навколо зрізів видаляють фільтрувальним папером. 2 хвилини зрізи інкубують у робочому субстратному розчині стабільного ДАБ плюс. Для його приготування до 1 мл буферу для стабільного ДАБ плюс хромогену додають 20 мкл стабільного ДАБ плюс хромогену. Зрізи промивають у 5 свіжих порціях дистильованої води по 1 хв. Гістологічні зрізи забарвлюють гематоксиліном Маєра (DAKO) впродовж 40 сек. Промивають тричі у дистильованій воді по 1 хв. Із метою контрастування 7 сек. зрізи витримують у 36 тМ розчині аміаку. Тричі по 1 хв. промивають у дистильованій воді, після чого скельця витримують при кімнатній температурі до їх повного висихання. На гістозрізи наносять водне заключне середовище (Faramount, Aqueous Mounting Mediun, DAKO) та накривають покривними скельцями. Інтерпретацію отриманих результатів проводять за якісною шкалою: незначна (+), помірна (++) та виражена (+++) експресія антигенів за інтенсивністю забарвлення ДАБ плюс хромогену. На гістологічних зрізах досліджуваної тканини чітко контуруються яскраво-сині контури ГМЦР, темно-коричневого кольору гранули та сплетення синаптофізин-позитивних терміналей (синапси, нервові сплетення), сині ядра клітин, злегка блакитно-сірого кольору цитоплазма. Запропонований спосіб дозволяє не тільки одночасно вивчати структурні особливості органа та його ГМЦР, але й паренхіматозно-стромально-нейро-вазальне співвідношення і зміну його в процесі онтогенезу та під впливом дії різних пошкоджуючих факторів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб поєднаного виявлення гемомікроциркуляторного русла та паренхімо-стромально-нейровазальних співвідношень у органах, який полягає в ін'єктуванні кровоносних судин із наступним забарвленням виготовлених зрізів, який відрізняється тим, що проводиться тонка ін'єкція кровоносних судин хлороформною сумішшю дрібнодисперсної фарби "Парижская синяя" з наступною імуногістохімічною ідентифікацією Integrin В1 і Synaptophysin (маркери синапсів, нервових сплетень) та дозабарвленням гематоксиліном Маєра, що дозволяє на гістологічному препараті вивчати топографію й архітектоніку гемомікроциркуляторного русла, нервових сплетень, клітинну будову досліджуваного органа та їх співвідношення. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2