Процес моделювання нефропатії

Процес моделювання нефропатії, що полягає у здійсненні патологічного впливу на експериментальних тварин, який відрізняється тим, що вплив здійснюють під дією чинників, що формують порушення функціонування судинної та ендокринної систем, для цього експериментальних тварин Корисна модель відноситься до експериментальної медицини і може бути використана в експериментальній нефрології для вивчення патогенезу нефропатії і визначення морфофункцюнальних змін і пошкоджень судин та нирок, та у фармакології для вивчення ефективності лікарських препаратів для лікування даного захворювання До теперішнього часу існує ряд суперечних та недостатньо вивчених аспектів у проблемі виникнення нефропатій В основному нефропатії є неодмінним атрибутом клініко-морфолопчної характеристики більшості системних захворювань (порушеннях метаболізму, захворюваннях ендокринної та серцевосудинної систем, імунній патологи) У даний час немає адекватного способу моделювання нефропатії з відтворенням хронізацп патологічного процесу Відомий спосіб моделювання нефропатії, у якому патологічний вплив на експериментальних тварин здійснюють шляхом нефротоксичного втручання, а саме щурам вводять 0,1%-го розчину HgCb підшкірне дозою 5 мг/кг одноразово з проведенням дослідження через 72 години Результати дослідження показали початок розвитку ранньої поліуричної стадії гострої ниркової недостатності [Пішак В П , Роговий Ю Є , Бойчук Т М Стан клубочково-канальцевого та канальцевоканальцевого балансу в ранній період поліуричної стадії сулемової нефропатії // Досягнення біологи та медицини - 2003 - №2 - с 21-24] Відомий також 'Спосіб моделювання нефропатії" [Див а с №1605278 А1, СРСР МПК G 09 В 23/28, автори Ю М Єселевський, М А Пальцев, А Г Уфімцева, Е С Северпна, А А Іванова, опубл 07 11 90, Бюл №41], обраний за прототип Нефропатію у цьому способі моделюють шляхом патологічного впливу, а саме хірургічного втручання безпосередньо в структуру нирки експериментальної тварини і формування обструктивного порушення відтоку сечі Для цього проводять задньо-поперечну ПІЄЛОТОМІЮ та вводять в ниркову миску за допомогою пінцета шовкову нитку, попередньо зав'язаної у вузлик Загальним недоліком відомих способів є те, що - нефропатію викликають при безпосередньому хірургічному або нефротоксичному втручанні в структуру нирки, що не є природним, - створені моделі не відображають хронічного перебігу захворювання та за етюпатогенезом не адекватні патологи, що спостерігається в КЛІНІЦІ, Це обумовлено тим, що не відтворюється взаємозв'язок розвитку даної патологи з порушеннями в інших системах організму (ендокринній та судинній) При моделюванні нефропатії тільки за допомогою безпосереднього хірургічного або нефротоксичного втручання в структуру органу визначаються слабо виражені склеротичні ураження капілярів, осередкові зміни дистрофічного та некробютичного характеру в канальцях з лейкоцитар утримують на холестериновій ДІЄТІ (200 мг кри сталічного холестерину на кг ваги) на тлі формування постійно діючого стресового впливу, як стресовий вплив застосовують цілодобове освітлення (вдень - звичайне сонячне світло, вночі - електричне освітлення) ю о г* о> 7075 ною та плазмо-цитарною інфільтрацією, що в більшій мірі характеризує гострий процес ураження нирок, але не відтворює його хронізацію. В основу корисної моделі покладено завдання створити таку модель нефропатії, яка по клінікоморфологічним ознакам була б близькою до захворювання людини, а вибір у моделі патологічних чинників для формування судинної патології та порушень функціонування ендокринної системи, у сполученні, дозволить здійснити більш адекватне відтворення системності та хронізації патологічного процесу і визначити нові терапевтичні підходи до лікування нефропатіи. Це завдання вирішується у процесі моделювання нефропатії, який полягає у здійсненні патологічного впливу на експериментальних тварин. Ознаками, що відрізняють корисну модель від прототипу, є такі: - вплив здійснюють під дією чинників, що формують порушення функціонування судинної та ендокринної систем; - для цього експериментальних тварин утримують на холестериновій дієті (200 мг кристалічного холестерину на кг ваги) на тлі формування постійно діючого стресового впливу; - у якості стресового впливу застосовують цілодобове освітлення (вдень - звичайне сонячне світло, вночі - електричне освітлення). Незважаючи на поліморфізм цієї патології, нефропатії в основному супроводжуються порушенням функціонування таких систем, як ендокринна та серцево-судинна або є їх результатом. В патогенезі нефропатіи можна виділити такі основні моменти: розвиток склеротичного процесу, що характеризується накопиченням компонентів екстрацелюлярного матриксу в клубочках, канальцях та інтерстиції; неодмінне ураження судинних структур - клубочкових капілярів, артеріол, артерій малого калібру; явища запалення в тканинах нирок. Вивчення патоморфологічних порушень в тканинах нирок при нефропатії та їх взаємозв'язку з іншими органами й системами є важливим та актуальним у світлі розуміння патогенезу цього захворювання та правильного підходу до його лікування. В зв'язку з цим виникає необхідність створення моделі з вибором відповідних патологічних чинників. Годування експериментальних тварин кристалічним холестерином у кількості 200 мг на 1 кг ваги сприяє досягненню стабільної гіперхолестеринемії, що призводить до виникнення вогнищ ліпоїдозу в інтимі аорти та дистрофічних змін епітелію канальців нирок. Формування постійно діючого стресового впливу шляхом утримування експериментальних тварин при цілодобовому освітленні за морфологічними показниками приводить до розвитку хронічного психоемоційного, а потім гуморального стресу. Це обумовлене тим, що тривале цілодобове освітлення викликає пригнічення мелатонінутворюючої функції пінеальної залози і призводить до функціонального гіпопінеалізму, який, в свою чергу, забезпечує пусковий механізм розвитку порушень ендокринної системи в цілому. Тривале цілодобове освітлення експеримен тальних тварин на тлі холестеринової дієти приводить до формування хронічного стресового стану та до порушень обміну ліпідів, морфологічними ознаками чого є виразні атеросклеротичні ураження судин, а також розвиток дистрофічних і некробіотичних змін в нирках. Моделювання нефропатії, згідно процесу, що заявляється, здійснювали на експериментальних тваринах (всього ЗО тварин) - статевозрілі самці породи "шиншила". Створення патофізіологічних умов з використанням чинників, що діють на організм в цілому, та комплексна оцінка морфологічних змін судинної стінки й нирок дослідних тварин дозволяє в порівнянні з прототипом створити більш адекватну модель нефропатії. Процес, що заявляють, здійснюють в такій послідовності: 1. Процес моделювання нефропатії полягає у здійсненні патологічного впливу на експериментальних тварин (статевозрілі самці кролів породи "шиншила"). 2. Згідно корисної моделі, вплив здійснюють шляхом утримування експериментальних тварин в патоморфологічних умовах, під дією чинників, що впливають на організм в цілому. Для цього експериментальних тварин утримують на холестериновій дієті та формують постійно діючий стресовий вплив протягом 4 місяців. До раціону експериментальним тваринам додають кристалічний холестерин в дозі 200 мг на кг ваги тварини per os за схемою: 5 днів - введення холестерину; 2 дні відпочинок та утримують в приміщенні віварію при кімнатній температурі в умовах тривалого цілодобового освітлення: удень - звичайне сонячне світло, уночі - електричне освітлення з використанням ламп накалювання потужністю 100 Вт (інтенсивність освітлення, визначена за допомогою люксметра-Ю117, складала 20 люкс). 3. Для проведення порівняльного аналізу експериментальних тварин розподіляють на 3 групи: 1 - інтактні (10 тварин); 2 - кролі, які отримували холестерин (10 тварин); 3 - кролі, які утримувались в умовах постійного цілодобового освітлення і додатково до цього отримували холестерин (10 тварин); 4. Здійснюють оцінку патоморфологічних порушень в судинах та нирках експериментальних тварин, яких виводять під наркозом з експерименту. 5. Для цього виділяють та досліджують гістологічні зрізи нирок та судин за відомою методикою [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. // Микроскопическая техника // Руководство. М., Медицина, 1996г. - 544 стр.]. Для цього роблять розтин черевної порожнини, виділяють нирку та кусочки дуги й першого сегменту грудного відділу аорти. Зрізи нирки та судин фарбують гематоксиліном і еозином та за ван Гізон і досліджують в світловому мікроскопі "Біо-лам". Ступінь атеросклеротичних уражень аорти визначають після пофарбування судин Суданом IV. Морфометричне дослідження проводиться за допомогою програми Olympus DP-Soft (Version 3.1). Можливість здійснення способу моделювання нефропатії підтверджується прикладами: 7075 Приклад 1. Кроля самця масою 2030 г утримують в приміщенні віварію при кімнатній температурі в умовах звичайного освітлення. На протязі 4 місяців кріль отримує стандартний раціон віварію й кристалічний холестерин в дозі 200 мг на кг ваги тварини per os за схемою: 5 днів - введення холестерину; 2 дні - відпочинок. Під наркозом тварину виводять з експерименту. Для оцінки атеросклеротичних ушкоджень досліджують біологічні зразки експериментальної тварини. Для цього здійснюють розтин черевної порожнини та виділяють аорту й нирки. Беруть кусочки дуги та першого сегмента грудного відділу аорти для гістологічного і мікроскопічного дослідження на світловому мікроскопі. Для цього аорту відділяють від клапанів до біфуркації на клубові артерії, відмивають від крові в фізіологічному розчині, розсікають по довжині, звільняють від адвентиції і перед фіксацією розправляють на картоні люмінальною поверхнею догори. Аорту фіксують 9% розчином формаліну для подальшого гістологічного дослідження. Фрагменти нирок піддають фіксації в 10% розчині формаліну, проводять через спирти наростаючої концентрації та заливають в парафін, після чого виготовляють зрізи товщиною 5мкм, які фарбують гематоксиліном і еозином, за ван Пзон та за Рего, [див. п. 5]. Морфометричне дослідження проводиться за допомогою програми Olympus DPSoft (Version 3.1). Результати дослідження аорти: В грудному відділі аорти визначаються вогнища ліпоїдозу, які в нижній частині аорти зливаються в крупні ліпідні плями, витягнуті по осі судини. Морфологічний аналіз ділянок ліпоїдозу інтими аорти визначає помірні дистрофічні і некробіотичні зміни як в інтимі, так і в середній оболонці аорти. Процес трансформації гладком'язових клітин у пінисті клітини супроводжується значним нагромадженням в інтимі судини екстрацелюлярних ліпідів, формуванням атероматозного ядра, що свідчить про активне прогресування патологічного процесу передусім за рахунок накопичення ліпідів. Результати дослідження нирок: Жирова капсула нирки добре виражена, фіброзна капсула легко відокремлюється, оголюючи гладку поверхню. Нирки трохи збільшені в розмірах, тканина на розрізі помірковано ціанотична з жовтуватим відтінком. На розрізі спостерігається зменшення порожнини ниркової миски за рахунок збільшення в розмірах пірамід. Рисунок мозкової речовини трохи стушований, границя між корковим і мозковим шарами нечітка. В нирках відзначається повнокров'я судин та поява компенсаторне гіпертрофованих клубочків, місцями зустрічаються клубочки зі склерозом капілярної мережі. Епітелій канальців призматичної будови, в цитоплазмі неф-роцитів дрібнокрапельна жирова дистрофія. Просвіт канальців звужений, що вказує на їх дисфункцію. У інтерстиції пірамід помірно виражений набряк та незначна круглоклітинна інфільтрація. Результати експерименту свідчать, що холестеринова дієта призводить до розвитку значних ліпідних уражень аорти з осередковими дис трофічними змінами як в інтимі, так і в середній оболонці, а на препаратах нирок мають місце ознаки жирової інфільтрації і розростання сполучної тканини. Приклад 2. Кроля-самця масою 1940 г утримують в приміщенні віварію при кімнатній температурі в умовах тривалого цілодобового освітлення: удень - звичайне сонячне світло, уночі - електричне освітлення з використанням ламп накалювання потужністю 100 Вт (інтенсивність освітлення, визначена за допомогою люксметраЮ117, складала 20 люкс). На протязі 4 місяців кріль отримує стандартний раціон віварію й кристалічний холестерин в дозі 200 мг на кг ваги тварини per os за схемою: 5 днів - введення холестерину; 2 дні - відпочинок. Під наркозом експериментальну тварину виводять із експерименту, роблять розтин черевної порожнини і виділяють аорту та нирки. Беруть кусочки дуги та першого сегмента грудного відділу аорти для гістологічного дослідження. Для цього аорту відділяють від клапанів до біфуркації на клубові артерії, відмивають від крові в фізіологічному розчині, розсікають по довжині, звільняють від адвентиції і розправляють на картоні люмінальною поверхнею догори. Частину аорт фіксують 9% розчином формаліну для фарбування Суданом червоним на ліпіди. З частини аорт виготовляють гістологічні зрізи та фарбують їх гематоксиліном і еозином та за ван Гізон і досліджують в світловому мікроскопі "Біолам". Фрагменти нирок піддають фіксації в 10% розчині формаліну, проводять через спирти наростаючої концентрації та заливають в парафін, після чого виготовляють зрізи товщиною 5мкм, які фарбують гематоксиліном і еозином, за ван Пзон, та за Рего [див. п. 5]. Морфометричне дослідження проводиться за допомогою програми Olympus DP-Soft (Version 3.1). Результати дослідження аорти: В аорті відзначаються вогнища ліпідної інфільтрації, які за характером-та топографічне не відрізняються від ліпідних уражень аорти тварин, що утримувались на холестериновій дієті та при звичайному освітленні, але мають більш виражену інтенсивність. Морфологічний аналіз ділянок ліпоїдозу інтими аорти виявив глибокі дистрофічні і некробіотичні зміни як в інтимі, так і в середній оболонці аорти. Основну масу клітинних елементів у вогнищах ліпоїдозу складали пінисті клітини гладком'язового походження. Процес трансформації гладком'язових клітин у пінисті клітини супроводжувався значним нагромадженням в інтимі судини екстрацелюлярних ліпідів, формуванням атероматозного ядра, що свідчить про активне прогресування патологічного процесу. Результати дослідження нирок: Нирки кролів, що утримувались на холестериновій дієті в умовах цілодобового освітлення, звичайних розмірів. При знятті фіброзної капсули поверхня органу гладка. Рисунок ниркової паренхіми дещо стушований. Спостерігається збільшення коркового слою, набряк ниркових пірамід. При мікроскопічному дослідженні в нирках ви 7075 являються дифузні пара-некробютичні зміни, значне розростання сполучної тканини як у корковому, так і в мозковому шарі В дрібних кровоносних судинах відзначається ущільнення стінок завдяки палинізаци, внаслідок чого їх просвіт звужується Ближче до пірамід виявляється тромбоз капілярів клубочків нирки з крововиливами Просвіт канальців нирки розширений Епітелій канальців нирки в стані балонної дистрофії, місцями відсутній У просвіті канальців білкова рідина, клітини злущеного епітелію, місцями просвіт канальців містить палинові циліндри В інтерстици пірамід різко виражений набряк із крововиливами, спостерігається фіброз та склероз із лейкоцитарною інфільтрацією Висновки* Таким чином, моделювання нефропатії шляхом холестеринової дієти та формування постійного стресового стану за допомогою цілодобового освітлення експериментальних тва Комп'ютерна верстка М Кпюкін 8 рин призводить до розвитку значних ЛІПІДНИХ уражень аорти з глибокими некробютичними та дистрофічними змінами як в ІНТИМІ, так і в середній оболонці, а на препаратах нирок мають місце ознаки жирової інфільтрації і розростання сполучної тканини Крім того до специфічних порушень з боку нирок слід віднести і появу осередкових кортикальних некрозів коркового шару з розвитком запалення в інтерстици пірамід Вище означені зміни та порушення в повній мірі відповідають картині, що спостерігається при нефропатії у людини Технічний результат Моделювання нефропатії за процесом, що заявляють, у порівнянні з прототипом, дозволяє здійснити більш адекватну модель патології з відтворенням системності та хронізацн патологічного процесу і визначити нові підходи для розробки способів медикаментозного лікування нефропатії. Підписне Тираж 28 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601