Спосіб оцінки реакції бластної трансформації лімфоцитів у культурі клітин

Спосіб оцінки реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) у культурі клітин, що включає забір крові, вилучення лімфоцитів, постановку культури, розподіл отриманої культури на два зразки, стимулювання одного зразка антигенами або мітогенами, інкубацію зразків, визначення ступеня РБТЛ, який відрізняється тим, що інкубацію проводять протягом доби, готують адгезивні відбитки з наступною їх фіксацією, флуорохромуванням акридиновим оранжевим, опроміненням в Винахід відноситься до біологи та медицини, а саме до імунологічних методів дослідження і стосується визначення імунореактивності лімфоцитів у пробірці (in vitro) Відомий спосіб оцінки реакції бластної трансформації лімфоцитів ( РБТЛ ) у культурі клітин за морфологічними ознаками (Чернушенко Е Ф Унифицированные иммунологические методы обследования больных на стационарном и амбулаторном этапах лечения Метод рекомендации -Киев, 1988-18 с- С 10-11), який включає забір крови, вилучення лімфоцитів із крові, постановку культури клітин, розподіл отриманої культури на два Зразки, стимулювання одного зразка антигенами або мітогенами, інкубацію протягом 72 годин при температурі 37 ± 0,5 °С , приготування мазків на предметному склі, фарбування їх за Гімза, вивчення під світловим мікроскопом морфології 300 лімфоцитів і визначення ступеня реакції бластної трансформації лімфоцитів за відсотком з них трансформованих (бластних клітин та митозів) Ознаками, спільними з винаходом, що заявляється, є забір крові, вилучення лімфоцитів із крові, постановка культури клітин, розподіл отриманої культури на два зразки, стимулювання одного зразка антигенами або мітогенами, інкубація при тем ультрафіолетовому спектрі, визначенням інтенсивності люмінесценції в умовних одиницях при довжині хвилі 640нм в стимульованому та нестимульованому зразках, вирахуванням індексу стимулювання за формулою у о 640нМНестим -1) 1 00% ІС640нм=(Іу о 640нМ С і за рівнем ІСб40нн оцінюють реакцію бластної трансформації, Де ІСб40нн - індекс стимулювання культури лімфоцитів, у відсотках, Іуо640нмСтин - інтенсивність люмінесценції стимульованого зразка при довжині хвилі 640нм, в умовних одиницях, Іуо640нмнестин- інтенсивність люмінесценції нестимульованого зразка при довжині хвилі 640нм, в умовних одиницях пературі 37 ± 0,5 °С , приготування препаратів, їх фарбування та вивчення під мікроскопом, визначення ступеня РБТЛ Недоліками способу є низька точність результатів Причинами, що перешкоджають досягненню результату, є тривалий термін культивування для виявлення морфологічно різних ознак РБТЛ, що збільшує термін аналізу, а також сприяє появленню культуральних артефактів ( апоптотична загибель клітин, вторинні мітози), великий суб'єктивізм при диференціюванні нетрансформованих (середніх та великих лімфоцитів) від трансформованих, особливо малих бластів, що потребує високої кваліфікації гематолога імунолога, мала КІЛЬКІСТЬ клітин, які вивчаються, обмежена фізичними можливостями дослідника, що зменшує репрезентативність вибірки, а отже, і точність визначення, нерівномірний розподіл клітин у мазку (баластні клітини розташовуються переважно по краях препарату і в його КІНЦІ " вусиках ") - знижує об'єктивність дослідження Відомий спосіб визначення РБТЛ за включенням клітиною радіометричної мітки Н3 - тимідину ю ^00 00 48845 (Иммунологические методы /Под ред ГФримеля Пер с нем-М Мир-1987-472с - С-9), який включає забір крові, вилучення лімфоцитів, постановку культури, розподіл отриманої культури на два зразки, стимулювання одного зразка антигенами або мітогенами, інкубацію зразків при температурі 37±0,5 °С протягом 48-72 годин, додавання в них Н3 - тимідину за 4 години до кінця культивування, вилучення ДНК з клітин на фільтрі , визначення рівня радіації на сцинтиляційному лічильнику і по відношенню числа розпадів у стимульованій та нестимульованій культурах визначають ступінь РБТЛ Загальними ознаками з рішенням , що заявляється, є забір крові, вилучення лімфоцитів, постановка культури, розподіл отриманої культури на два зразки, стимулювання одного зразка антигенами або мітогенами, інкубацію зразків при температурі 37±0,5°С , оцінка РБТЛ Недоліками способу t недостатня експресність та точність результатів, а також його недоступність для більшості імунологічних лабораторій, Причинами, що перешкоджають досягненню результату, є тривалий термін культивування (48-72 години), що призводить до накопичення артефактів, додавання в культуру Н3 - тимідину за 4 години до кінця інкубування призводить до його включення тільки в ті популяції трансформованих клітин, які знаходяться в даному проміжку часу в S періоді мітототичного циклу, неоднакові за якістю та терміном зберігання серії ізотопу Н - тимідину, сцинтиляційної рідини, знижують достовірність результатів радіометричного способу необхідність забезпечення радюнуклеідного захисту в лабораторії та висока вартість радіометричних ЛІЧИЛЬНИКІВ утруднює доступність даного способу в експериментальній та КЛІНІЧНІЙ імунологи В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб оцінки реакції бластної трансформації лімфоцитів у культурі клітин, який шляхом визначення ранньої деконденсацм одноланцюгових активних ділянок ДНК та синтезу одноланцюгових РИК дозволяє підвищити оперативність, точність, об'єктивність та забезпечити еколопчність і доступність способу Суттєвими ознаками запропонованого рішення є забір крові, вилучення лімфоцитів із крові, постановка культури лімфоцитів, розподіл отриманої культури на два зразки, стимулювання одного зразка мітогенами або антигенами, добова інкубація зразків, приготування адгезивних відбитків, їх фіксація, флуорохромування їх акридиновим - оранжевим , опромінення в ультрафіолетовому спектрі, визначення інтенсивності люмінесценції в умовних одиницях ( у о ) при довжині хвилі 640нм вирахування індексу стимулювання за формулою ІСб40нн- (І у о 640НМ стин І у 0 64ОНМ нестин 1)100%, де І у о 640нм стин - інтенсивність люмінесценції стимульованого зразка при довжині хвилі 640нм, в умовних одиницях, І у о 640нм нестин - інтенсивність люмінесценції нестимульованого зразка при довжині хвилі 640нм, в умовних одиницях, ІСб40нн- індекс стимулювання культури лімфоцитів, у відсотках, оцінка РБТЛ ВІДМІННИМИ ВІД прототипу ознаками є тривалість інкубації 24 години, приготування адгезивних відбитків та їх фіксація, флуорохромування АО, опромінення в ультрафіолетовому спектрі, визначення інтенсивності люмінесценції в умовних одиницях ( у о ) при довжині хвилі 640нм (Іу о 640нм ) в стимульованому та нестимульованому зразках, вирахування індексу стимулювання за формулою Спосіб здійснюють таким чином Проводять забір крові з пальця або вени з антикоагулянтом, з отриманої крові виділяють лімфоцити відомими способами Проводять постановку добової культури лімфоцитів, а потім ділять її на два зразки Один із зразків стимулюють мітогенами або антигенами Культури інкубують у термостаті при температурі 37±0,5°С Готують адгезивні відбитки на предметному склі, на яке наклеєна стрічка , де зроблені лунки з підкладкою для культури лімфоцитів Здійснюють фіксацію відбитків, їх флуорохромування акридиновим оранжевим в цитратно - фосфатному буфері та опромінення у спектрі збудження 436нм Визначають інтенсивність люмінесценції в умовних одиницях ( у о ) при довжині хвилі 640нм Вираховують індекс стимулювання за формулою) і оцінюють РБТЛ Відомо, ЩО В ядрі лімфоцитів у перші хвилини після їх стимулювання мітогенами або антигенами відбуваються зміни третичної структури дезоксирибонуклеїнових кислот ( ДНК ) ( Карнаухов В Н Люминесцентный спектральный анализ клетки -М Наука, 1978-209с -С-83) Ці зміни супроводжуються конденсуванням одних та деконденсуванням інших ділянок ДНК Деконденсування ДНК супроводжується активуванням білок-синтетичної системи клітин розходженням 2 -х ланцюгів ДНК один від одного на ДІЛЯНЦІ активних генів і на одній з них починається синтез ( транскрипція ) одно ланцюгових рибонуклеїнових кислот ( РНК ) рибосомальних (р), транспортних ( т ) , інформаційних (і) Всі ВИДИ РНК ( р, Т, І ) В подальшому виходять із ядра в цитоплазму і беруть участь у синтезі білка ( трансляція ) Розгортання білок-синтетичної системи лімфоциту у вигляді морфологічно ще нерозрізненої реакції бластної трансформації починається в перші години після стимулювання лімфоцитів і вже через 15-18 годин настає S-перюд мітотичного циклу, коли відбувається редуплікація ДНК і підготовка клітини до мітозу ( Козинец Г И , Котельников В М , Гольдберг В Е Цитофотометрия гемопоэтических клеток-Томск, 1986,- 215с С 78) Тому, запропонований спосіб дозволяє об'єктивно реєструвати ранню деконденсацію одноланцюгових активних ділянок ДНК та синтез одноланцюгових РНК флуорохромом акридиновим оранжевим ( АО ), ВІДПОВІДНО до своїх фізичних власти 48845 востей, димери АО вибірково штеркалірують з одноланцюговими нуклеїновими кислотами ( НК) і при опромінюванні в ультрафіолетовому спектрі ЛЮМІНІСЦІЮЮТЬ у максимумі спектру 640 нм ( чер воне світло ) Лімфоцити гетерогенні за вступом в мітотичний цикл, але через 24 години більшість мітоген або антиген-позитивних лімфоцитів активуються і стають доступними для їх люмінесцентного реєстрування з використанням АО, що дозволило значно підвищити оперативність визначення ступеня РБТЛ Екологічна безпека в порівнянні з прототипом досягається за рахунок радіологічної безпеки АО ЕКОНОМІЧНІСТЬ та доступність способу дозволяє використовувати його в звичайних експериментальних і КЛІНІЧНИХ лабораторіях, тоді як, згідно з прототипом, дослідження проводяться в спеціально обладнаній радіометричній лабораторії з використанням дорогих приладів і реактивів За об'єктивністю та точністю запропонований спосіб перевищує прототип, завдяки використанню відбитків (в одному відбитку аналізують до 20тис лімфоцитів ) та можливості сканування більшої КІЛЬКОСТІ полів зору за рахунок трьох і більш повторів Приклад конкретного виконання Проводили забір крові з вени на антикоагулянті (гепарин, 20од/мл) у 35 обстежених 3 отриманої крові виділяли лімфоцити за методом Boyum А на градієнті ЩІЛЬНОСТІ фіколл-верографін (ЩІЛЬНІСТЬ 1,077г/мл) Поставили культуру лімфоцитів Розділили отриману культуру на два зразки Один із зразків розділили на три частини і провели стимулювання мітогеном -фітогемагглютиншом Р (ФГАР) за стандартною методикою у концентрації 20мкг/мл Отримані нестимульовану і стимульовані культури шкубували одну добу у термостаті при 37 ± 0,5°С з насиченням СО25% 3 культур готували на предметних стеклах адгезивні відбитки, для чого в лунки діаметром 0,5см із стрічки Parafilm "М" з підкладкою із полізину розкопували отриману суспензію лімфоцитів, яку потім висушували на повітрі Адгезивні відбитки фіксували у суміші абсолютного етилового спирту і ацетону у співвідношенні 1 1 , проводили через спирти понижуючої концентрації 96° - 15хв, 60° - Юхв, 30° - 5хв , сполоскували у дистильованій воді Зафіксовані адгезивні відбитки поміщали у цитратнофосфатний буфер з рН 6,0 і проводили 10хвилинне флуорохромування у розчині акридинового оранжевого (АО) 1 20 000, приготовленому на тому ж буфері, ДВІЧІ промивали у цитратнофосфатному буфері з рН 6,0 від АО, який не прореагував, накривали покроєним склом і окантовували від висихання 30%-м розчином полістиролу Потім проводили опромінення пофарбованих АО відбитків в ультрафіолетовому спектрі (спектрі збудження 436 нм) та визначали інтенсивність люмінесценції в умовних одиницях ( І у о) при довжині хвилі 640нм при знятому зонді і збільшенні об 40 х, ок 7 х десяти полів зору кожного відбитка Вираховуємо середній показник для повторів стимульованих відбитків Іу 0 640нм Стим) та І у о640нм нестим Таким чином, 2000 лімфоцитів відбитка, що вивчаються, у одному полі зору х 10 полів зору однієї культури х 3 повтори стимульованої культури лімфоцитів, що дозволяє враховувати інтенсивність люмінесценції бОтис лімфоцитів у одному адгезивному відбитку Потім згідно з формулою вираховували ІСб40нн і за його рівнем оцінювали РБТЛ При ІСб40нн до 50% РБТЛ визначають як слабку , 50-100% -середню , > 100% - сильну Таким чином, реакція БТЛ свідчить про потенціальну проліферативну реакцію лімфоцитів при імуногенезі та ступінь сенсибілізації організму до даного антигену Даний спосіб оцінки реакції бластної трансформації лімфоцитів був перевірений для мітогену ФГА та для тканинних антигенів — мозкового та тимічного ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71