Склад, що активує репродукцію вірусу в культурі клітин

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной вирусологии и может быть использовано для активации репродукции вируса в перевиваемых монослойных клеточных культура х, используемых для повышения выхода биомассы микроорганизма при диагностике вирусных инфекций и в биотехнологии получения противовирусных вакцин. Известны вещества, введение которых в культуральные Ъреды усиливает размножение вирусов в культуре клеток. Например, введение в культуральную среду антител ан-тиинтерферона-бета облегчает экспрессию и размножение вируса, вызывающего рассеянный склероз (заявка Франции № 2689520). Состав, включающий диметилсульфок-сид и раствор трипсина, используют в качестве активатора при культивировании респираторно-синцитиального вируса (авт.св. СССР № 1655983). Наиболее близким к заявляемому составу, активирующему репродукцию вируса в культуре клеток, является состав, вводимый в поддерживающую среду Игла, включающий координационное соединение платины с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты, хлорид натрия, цитрат натрия в виде водного раствора. Оптимальное соотношение активирующего состава и среды обеспечивает через 48 ч культивирования повышение концентрации вируса в 15000 раз, и эти показатели исчерпывают возможности данного состава (авт.св. СССР № 1830943). В основу изобретения положена задача создания состава, активирующего репродукцию вирусов в культуре клеток, который за счет введения дополнительных компонентов в активирующий состав обеспечивает повышение концентрации культивируемого в различных клеточных культурах вир уса, а также сокращение сроков культивирования вирусов. Состав, активирующий репродукцию вируса в культуре клеток, включающий водный раствор координационного соединения платины с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты (Pt-ДНК), хлорида натрия и цитрата натрия, в соответствии с изобретением, дополнительно содержит хлорид аммония, L-цистин и L-глутамин при следующем соотношении компонентов, г/л: Активирующий состав готовили следующим образом: в водном растворе хлорида и цитрата натрия соответствующей концентрации проводили реакцию между комплексом цисдихлородиамминплатины и дезоксирибонуклеиновой кислотой из селезенки крупного рогатого скота, приводящую к получению соединения Pt-ДНК и хлорида аммония в соответствующи х концентрациях. Непосредственно перед употреблением к реакционной смеси добавляли соответствующее количество L-цистина и L-глутами-на. Из зависимости между дозой активирующего состава, введенного в культурзльную среду, и вы ходом вирусной массы было определено оптимальное соотношение между составом, активирующим репродукцию вируса, и к ультуральной средой, которая составила в мас.% активирующий состав -1 ,7; культуральная среда остальное. Репродукцию вируса и время его культивирования определяли при оптимальном соотношении активирующего состава и поддерживающей среды в пяти-восьми повторах. Количественное содержание вирусных частиц в единице объема диагностируемого материала устанавливали стандартными методами титрования по эффекту бяяшкообразования, цитопатическому действию (ЦПД50) или с помощью серологических реакций, например, по титру вирусного антигена в реакции непрямой гемагглютинации (ΡΗΓΑ). Время культивирования определяли как время учета результатов. Степень воздействия активирующего состава на урожай вируса и скорость выхода вируса определяли следующим образом. Πример1.1). Культур у клеток VERO С концентрацией 200000-300000 кл/мл высевали в стерильные матрасы емкостью 1,5 л в 150 л питательной среды Игла, содержащей 10% сыворотки теленка, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина. Клетки выращивали при 37°С в термостате в течение 24 часов до образования монослоя. Затем среду роста сливали, клеточный пласт промывали раствором Хенкса и заливали 50 мл поддерживающей среды Игла, содержащей 2 % сыворотки теленка и дополнительно активирующий состав при следующем соотношении компонентов, г/л: Через два часа среду с активирующим составом удаляли, монослой промывали раствором Хенкса, заливали поддерживающей средой, инфицировали вирусом Коксаки В6 в дозе 0,05 бляшкообразующих единиц на клетку и инкубировали при 37°С до полного разрушения монослоя. 2). Опыт проводили, как описано в пункте 1, только культуру клеток VERO приводили в контакт с материалом, содержащим вирус полиомиелита Η типа. 3). Опыт проводили, как описано в пункте 1, только в качестве культивируемых клеток использовали клетки НЕР-2 и их приводили в контакт с материалом, содержащим вирус везикулярного стоматита штата Индиана (ВВС). 4). Опыт проводили, как описано в пункте 1, только в качестве культивируемых клеток использовали клетки СПЭВ, в качестве питательной среды смесь 1:1 среды Игла и среды 199, а клетки вводили в контакт с трипсинизированным рота вирусом обезьян SMI. Πример 2. Опыты проводили, как описано в примере 1, в пунктах 1-4, с использованием активирующего состава при следующем соотношении компонентов, г/л: Пример 3. Опыты проводили, как описано в примере 1, в пунктах 1-4, с использованием активирующего состава при следующем соотношении компонентов, г/л: Πример 4. Опыты проводили, как описано в примере 1, в пунктах 1-4, только в качестве активирующего состава, использовали состав, включающий хлорид аммония. L-цистин и L-глутамин при следующем соотношении компонентов, г/л: Πример 5. Контрольные опыты проводили, как описано в примере 1, в пунктах 1-4, только в качестве активирующего состава использовали известный состав, включающий соединение Pt-ДНК, хлорид натрия и цитрат натрия при следующем соотношении компонентов, г/л: Пример 6. Опыты с интактными клетками проводили, как описано в примере 1, в пунктах 1-4, только перед введением клеток в контакт с вируссодержащим материалом их активирующим составом не обрабатывали. Данные, характеризующие репродуктивную активность вирусов в культуре клеток, инкубированных в питательной среде, обработанной предлагаемым активирующим составом, в сравнении с контролем и интактными клетками, обработанными составом, включающим хлорид аммония, L-глутамин и L-цистин, представлены в таблице. Полученные результаты показывают неоспоримое преимущество заявляемого активирующего состава, способного стимулировать репродукцию вирусов и сокращать время культивирования с 48 до 24 часов. Из таблицы видно, что урожай вирусов в культура х клеток, обработанных заявляемым активирующим составом, значительно превышает урожай вирусов в контроле, т.е. в культуре клеток, обработанных известным активирующим составом (пример 5), который в свою очередь на два-четыре порядка выше, чем урожай вирусов в культуре интактных клеток (пример 6) или клеток, обработанных составом, включающим хлорид аммония, L-глутамин и L-цистин (пример 4). По сравнению с контролем заявляемый активирующий состав сокращает сроки культивирования вируса β два раза и повышает репродукцию ротавируса обезьяны SA-I1 в 9 раз, вируса Коксаки В6- в 13,5 раза, вируса везикулярного стоматита- в 15,6 раз, вируса полиомиелита - в 19 раз. По сравнению с активирующим составом, включающим хлорид аммония, L-цистин и L-глутамин, заявляемый активирующий состав повышает урожай рот», вируса обезьян SA-II - в 50-60 тыс.раз, вируса Коксаки В6 - в 1,0-1,7 млн. раз, вируса везикулярного стоматита - в 1,0-1,4 тыс. раз, вируса полиомиелита - в 16,7-25,0 тыс. раз, при этом сроки культивирования всех вирусов сокращаются в 3 раза. Таким образом, при введении заявляемого активирующего состава в среду поддержания культивируемых клеток, зараженных вирусами, имеет место не суммарный, а синергетический эффект, возникающий при смешивании соединения Pt-ДНК в растворе хлорида натрия, цитрата натрия с хлоридом аммония, L-цистином и L-глутамином.