Спосіб визначення забруднення оточуючого середовища металами

1. Спосіб визначення забруднення навколишнього середовища металами, який полягає в тому, що відбирають пробу, готують тверде поживне середовище на основі проби, вирощують бактерії на поживному середовищі, виявляють присутність металів шляхом візуального дослідження впливу металів на показники життєдіяльності бактерій, який відрізняється тим, що як індикаторні мікроорганізми використовують пігментоутворюючі бактерії Pseudomonas fluorescens sp., Pseudomonas fluorescens var. pseudo-iodinum, Serratia marcescens, як поживне середовище використовують м'ясо-пептонний агар, який готують на основі води з певним вмістом металів, а присутність металів виявляють за втратою пігментоутворення та за відсутністю росту. 2. Спосіб за пунктом 1, який відрізняється тим, що присутність металів виявляють шляхом візуального порівняння інтенсивності пігментоутворення та росту після 16-годинної інкубації мікроорганізмів. UA (21) 20040706208 (22) 26.07.2004 (24) 17.04.2006 (46) 17.04.2006, Бюл. № 4, 2006 р. (72) Рильський Олександр Федорович, Гвоздяк Петро Ілліч, Шевчук Ірина Анатоліївна (73) Запорізький державний університет (56) RU 2225000 C1, 27.02.2004 Базеляк В.Л., Мишнаевский М.С. Использование культур морских бактерий для биоиндикации соединений тяжелых металлов. Всес. конф. Методология экологического нормирования. Харьков. 16-20 апр.- 1990.- Тез докл.- ч.2.- секц.2.- с.74, реферат Туманов А.А., Крестьянинов П.А. Биологический метод анализа: состояние и перспективы // Журнал аналитической химии. - 2002. - т.57. - №5. с.454-459 Furman C., Owusu V., Tsang J. Inhibitory effect of some transition metal ions on growth and pigment formation of Serratia marcescens // Microbios. 1984; 40(159) : 45-51 Hassen A., Saidi N., Cherif M., Boudabous A. Effects of heavy metals on Pseudomonas aeruginosa and C2 2 (19) 1 3 75513 4 Спільними з прототипом ознаками є відбір основі води з певним вмістом металів, викорипроб, використання мікроорганізмів для визначенстання як біосенсорів пігментоутворюючих ня вмісту металів, використання твердого поживбактерій, засів поживного середовища суцільним ного середовища для вирощування газоном бактерій, інкубування при температурі 36мікроорганізмів, візуальне визначення результатів 37°С протягом 16 годин, тестування результатів. аналізу. Відмінними від прототипу ознаками є викориІнша група - біосенсори на основі інтактних стання МПА як поживного середовища, що готуклітин мікроорганізмів, що здатні фізіологічне реають на воді з певним вмістом важких металів, вигувати на присутність певних металів (та/або інших користання пігментоутворюючих мікроорганізмів, а хімічних агентів) у природних об'єктах, у тому числі також інкубація протягом 16 годин при 36-37°С. водах. Для вирішення поставленого завдання запроСаме до цієї групи належить найбільш близьпоновано спосіб вимірювання забруднення отокий до винаходу за технічною суттю спосіб, що чуючого середовища металами, що базується на описаний у роботі [Грузина Т. Г., Степура Л. Г., ефектові втрати пігментоутворюючими бактеріями Балакина М. Н., Карамушка В. И., Ульберг З. Р. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluoresБактериальные биосенсоры в оценке степени заcens sp., Pseudomonas fluorescens var. pseudoгрязнения природных объектов тяжелыми металiodinum, Serratia marcescens при рості на лами. Химия и технология воды, 2000; - Т. 22; традиційному, загальновживаному твердому по№5; - С. 556-557]. Суть способу полягає у живному середовищі, а саме МПА, здатності синвикористанні чутливих бактеріальних штамів як тезувати пігменти, якщо у середовищі присутні біосенсорів для визначення ступеня забруднення важкі метали певних концентраційних рівнів. При природних об'єктів важкими металами. Чутливі до цьому втрата пігменту не супроводжується загиважких металів штами культур Bacillus subtilis В беллю клітин, тому що концентрації кожного з 1232, Bacillus subtilis sp. та Bacillus subtilis trp 169 металів (Ni, Cu, Cr, Pb, Zn), що інгібують відбирали шляхом скринінгу штамів колекції. При пігментоутворення, є меншими від летальних для цьому бактерії вирощуються та тестуються на даної культури концентрацій цих металів. чутливість до важких металів чашковим методом Запропонований спосіб простий у реалізації, визначенням числа життєздатних клітин, які утвоекономічний, тому що не потребує спеціальних рюють колонії на багатому Luria-Bertani багатих поживних середовищ для вирощування середовищі, що містить в 1 дм3: 10 г бактотриптомікроорганізмів, дає інформацію про концентрацію ну, 5 г дріжджового екстракту, 5 г NaCl, 1 г глюкометалів, при якій спостерігається зміна зи, 30 мг цистеїну, 10 г агару (рН 7,0) та задану пігментоутворення, дозволяє вказати кількість металу. Відібрані штами вирощують у концентрацію металів, що впливає на фізіологію чашках Петрі на агаризованому багатому Luriaбактерій, задовго до летальної концентрації. Bertani середовищі, метал у різних концентраціях Спосіб здійснюють таким чином: вносять у вигляді агаризованих дисків зверху Оцінці підлягали водні розчини, які містили культури бактерій, що засіяна газоном. Інкубація такі метали: Ni, Cu, Cr, Pb, Zn, Ag, у концентраціях здійснюється 18 год. у термостаті при температурі 20, 30, 50, 70, 100, 150 мг/л. На основі води з пев28°С, після чого вимірюються величини зон ним вмістом важких металів готували тверде поінгібування. живне середовище МПА. Як випливає з технічної суті відомого методу, Оцінці підлягають водні розчини, які містили його основним недоліком є необхідність у такі метали: Ni, Cu, Cr, Pb, Zn, Ag, у концентраціях спеціальному багатому Luria-Bertani середовищі 20, 30, 50, 70, 100, 150 мг/л. На основі води з певдля вирощування мікроорганізмів. Слід також ним вмістом важких металів готують тверде повідмітити, що даним методом можливе тестування живне середовище МЛА. Для приготування сереважких металів тільки у концентраціях, які довища, на якому культивували вказані в заявці повністю пригнічують ріст бактерій. Тобто відомий штами, використовують води, які мають певний метод показує вміст металу, за якого клітини або вміст важких металів. Для цього, беруть: ростуть, або не ростуть. Це свідчить про відносну - дистильовану воду, на якій готують розчини нечутливість методу. конкретних металів; Спільними з прототипом ознаками є відбір - природні води; проб, використання мікроорганізмів для визначен- витяжки з грунтів, які забруднені важкими меня вмісту металів, використання твердого поживталами; ного середовища для вирощування - стічні води гальванічних виробництв мікроорганізмів, виявлення присутності металів машинобудівних заводів, зокрема стічні води, що шляхом візуального дослідження впливу важких містять переважно Cr(VI), Zn2+, Cd2+, а також вометалів на показники життєдіяльності бактерій. ди, які містять комплекс важких металів Cr(VI), В основу винаходу поставлено задачу розроZn2+, Cd2+, Cu2+, Ni2+, Pb2+. бити спосіб визначення забруднення оточуючого При використанні природних вод втрата середовища металами, який шляхом вирощування пігментів бактерій не спостерігалась, тому що в пігментоутворюючих бактерій дозволяє підвищити цих водах концентраційні рівні металів були дуже чутливість способу та спростити його. низькими. Суттєвими ознаками винаходу є відбір проб, В експериментах, де готують середовище з приготування поживного середовища на основі забруднювачами, що містить комплекс металів, проби, використання як поживного середовища втрату пігментсинтезуючої здатності бактерій м'ясо-пептонного агару (МПА), який готують на спостерігають при концентраціях на 13 - 20 % ниж 5 75513 6 чих за концентрацію в експериментах, де викориfluorescens, Pseudomonas fluorescens var. pseudoстовують окремі метали. iodinum, Serratia marcescens. Інкубують протягом Таким чином, спосіб, що заявляється, 16 годин у термостаті при 36-37°С та візуально дозволяє досить точно та наглядно визначати запорівнюють інтенсивність пігментоутворення у бруднення оточуючого середовища металами. досліді та контролі, для якого поживне середовиПоживне середовище у чашках Петрі ще готують на дистильованій воді. засівають газоном таких колекційних Приклад 1. Вплив важких металів на ріст та пігментоутворюючих тест-культур: Pseudomonas пігментоутворення Pseudomonas fluorescens Таблиця 1 Концентрація металів, мг/мл 20 30 40 50 70 100 150 Cu Ріст Cr Пігмент ++++ +++ ++ ++ + ++++ ++++ +++ ++ + + Ріст +++ ++ ++ + Ni Пігмент + Ріст Пігмент ++++ ++++ +++ +++ ++ ++ + Інтенсивність росту: ++++ - суцільний +++ - добрий ++ - помірний + - слабкий - - відсутній Pb ++++ +++ +++ +++ + Ріст Пігмент ++++ ++++ +++ +++ +++ +++ ++ ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ + Інтенсивність пігментоутворення: ++++ - інтенсивне +++ - добре ++ - помірне + - слабке - - відсутнє Пігментоутворюючу бактерію Pseudomonas fluorescens, що синтезує синьо-зелений пігмент, засівали суцільним газоном у чашки Петрі з МПА, в який попередньо були внесені різні концентрації металів: Cu, Cr, Ni, Pb. Концентраційний ряд кожного з металів готували від 20 мг/л до 150 мг/л (табл. 1). За ростом культур та пігментоутворенням спостерігали через 16 год. вирощування. З табл. 1 видно, що інгібування здатності до пігментоутворення бактерії Pseudomonas fluorescens під дією Cr (VI) відбувається при меншій концентрації важких металів (при 40 мг/л), ніж припинення росту культури (70 мг/л); Cu та Ni блокують синтез пігменту при 100 мг/л, а ріст припиняється при 150 мг/л; Pb виявився найменш токсичним, проте і він пригнічує процес пігментоутворення за нижчих концентрацій, ніж інгібує ріст культури. Ці дані вказують на те, що застосування способу, який пропонується, дозволяє суттєво розширити інформативні уявлення про концентрації металів, з яких починається токсичний вплив кожного металу на важливі процеси життєдіяльності клітин, а також встановлює концентрацію цієї дії ще до повного інгібування росту культури. Контрастність чашок Петрі з культурою, де пігмент уже втрачений, та чашок, де він ще утворюється, значно покращує індикаторні особливості даного методу. Приклад 2. Вплив металів на ріст та пігментоутворення Pseudomonas aeruginosa Таблиця 2 Концентрація металів,мг/мл 20 30 40 50 70 100 150 Cu Ріст ++++ ++ ++ + + + Cr Пігмент ++++ + + + Інтенсивність росту: ++++ - суцільний +++ - добрий ++ - помірний + - слабкий - - відсутній Ріст +++ ++ ++ + Ni Пігмент + Ріст ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ + Pb Пігмент ++++ +++ +++ +++ ++ + Ріст ++++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ Інтенсивність пігментоутворення: ++++ - інтенсивне +++ - добре ++ - помірне + - слабке - - відсутнє Пігмент ++++ +++ +++ +++ ++ ++ + 7 75513 З табл. 2 видно, що культура Pseudomonas aeruginosa втрачає пігмент під дією Сг (VI) в концентрації 30 мг/л, ріст культури продовжується до концентрації 50 мг/л. Найменш чутлива культура до Рb, оскільки помірний ріст та слабке 8 пігментоутворення спостерігається до концентрації свинцю 150 мг/л. Приклад 3. Вплив металів на ріст та пігментоутворення Pseudomonas fluorescens var. pseudo-iodinum Таблиця 3 Концентрація металів, мг/мл 20 30 50 70 100 150 Сu Cr РЬ Ni Ріст Пігмент Ріст Пігмент Ріст Пігмент Ріст Пігмент ++++ +++ + + ++++ + + +++ ++ + + +++ + ++++ ++++ +++ + +++ +++ + ++++ +++ +++ ++ + ++++ +++ ++ + Інтенсивність росту: ++++ - суцільний +++ - добрий ++ - помірний + - слабкий - - відсутній Інтенсивність пігментоутворення: ++++ - інтенсивне +++ - добре ++ - помірне + - слабке - - відсутнє Як видно з табл. 3, культура виявилась найбільш чутливою до іонів Сu, Сг (VI), які викликали втрату пігментоутворення при концентраціях 70 мг/л та 50 мг/л, відповідно, та припинення росту при 100 мг/л. По відношенню до даної культури токсична дія Рb проявилась при менш низьких концентраціях (100 мг/л), ніж по відношенню до інших культур. Приклад 4. Вплив металів на ріст та пігментоутворення Serratia marcescens. Таблиця 4 Концентрація металів, мг/мл 20 30 40 50 70 100 150 Сu Cr Рb Ni Ріст Пігмент Ріст Пігмент Ріст Пігмент Ріст Пігмент ++++ ++++ +++ ++ + ++++ ++++ +++ ++ ++++ ++++ ++ ++++ +++ ++++ ++++ +++ +++ +++ +++ + ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ ++++ ++++ +++ ++ ++ ++ ++ ++++ ++++ ++ + + + + Інтенсивність росту: ++++ - суцільний +++ - добрий ++ - помірний + - слабкий - - відсутній Інтенсивність пігментоутворення: ++++ - інтенсивне +++ - добре ++ - помірне + - слабке - - відсутнє Таким чином, запропонований метод дозволяє досить швидко візуально оцінити забруднення металами природних об'єктів за допомогою ефекКомп’ютерна верстка М. Клюкін ту втрати пігментоутворюючими здатності до пігментоутворення. Підписне бактеріями Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601