Спосіб визначення концентрації пероксинітрит-аніону в біологічному матеріалі

Реферат: Спосіб визначення концентрації пероксинітрит-аніону в біологічному матеріалі включає визначення концентрацію пероксинітрит-аніону спектрофотометричним методом за допомогою ортофенілендіаміну. UA 77328 U (12) UA 77328 U UA 77328 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини і біохімії та може застосовуватися для визначення концентрації пероксинітрит-аніону в біологічному матеріалі як одного з метаболітів обміну оксиду азоту (NO). Оксид азоту безперервно продукується ферментативним шляхом в організмах тварин і людини, виконуючи функцію одного з універсальних регуляторів метаболізму. Зокрема, приймає участь у реалізації багатьох фізіологічних функцій, таких як вазодилатація, нейротрансмісія, зниження агрегації тромбоцитів, сповільнення реакції імунної системи та регуляції тонусу гладких м'язів, стану пам'яті тощо. Наявність одного електрона з неспареним спіном надає молекулі NО високу реакційну здатність, при взаємодії з іншими вільними радикалами він утворює ковалентні зв'язки. Оксид азоту в клітині виступає в ролі як цитопатогенного, так і цитопротекторного агента. Раніше вважалося, що нітрати і нітрити попадають в організм виключно з їжею. Однак на початку 80-х років було встановлено, що їжа не єдине і основне джерело нітратів в організмі. Нітрати і нітрити утворюються в результаті окиснення відновлених форм азоту, в результаті яких як проміжний продукт утворюється NО. Фактором розслаблення судин в організмі виступає оксид азоту. Такий процес має місце в фізіологічних умовах, коли виділені локально невеликі кількості оксиду азоту інактивуються оксидною реакцією за рахунок переходу в нітрит (NO2 ) або нітрат (NO3 ) іони, кожен з них не є вазодилататором. Цитотоксичний і цитостатичний ефекти макрофагів здійснюються за допомогою NО. В організмі людини NО утворюється із амінокислоти L-аргініну в результаті реакції, яка каталізується ферментом NO-синтетазою: L-arginin+NADPH2+О2→ NO+L-citrullin. NO є аутокринним і паракринним медіатором, тому що, будучи синтезованим у будь-яких клітинах, він здатний впливати на метаболічні процеси як у них, так і в розташованих посусідству. Позитивна чи негативна дія NO на клітини залежить від його окисно-відновного + статусу. Окисна форма (NO ) здатна інактивувати глутаматні рецептори, знижуючи токсичність ексайтотоксичних амінокислот, тоді як відновлена форма (NO) здатна утворювати пероксинітрит - аніон - потужний цитотоксин. Досягаючи високих значень, NO-радикал взаємодіє з цистеїном і глутатіоном з утворенням динітрозильних комплексів, що активують пероксидне окиснення ліпідів, окиснення сульфгідрильних груп білків та мононітрозильних комплексів, які нейтралізують ці деструктивні процеси. Крім того, NO може реагувати з молекулами, що мають неспарені електрони, утворюючи різновиди вільних радикалів, які здатні порушувати структуру і метаболізм ліпідів та білків у клітині, що призводить до дисбалансу механізмів сигнальної трансдукції та целюлярної токсичності. Так NO реагуючи з супероксидом-аніоном (О2 ) утворює пероксинітрит (ONOO ) - потужний оксидант із токсичними ефектами на різні молекули людського організму, включаючи ДНК, і здатний пригнічувати мітохондріальне дихання та індукувати клітинну смерть. Пероксинітрит-аніон (ONOO ) in vivo утворюється в результаті взаємодії супероксид-аніону та оксиду азоту: O2 +NO→ONOO . Пероксинітрит-аніон є сильним окиснювачем. Завдяки своїм властивостям він здатний викликати пошкодження широкого спектру молекул у клітині, в тому числі ДНК та білків, запускати каскадні механізми оксидативного і нітрозативного стресів. Пероксинiтрит-аніон є прямим метаболітом оксиду азоту (II) і проявляє цитотоксичну дію. Розробка зручного та дешевого методу визначення пероксинітрит-аніону в біологічному матеріалі має важливе наукове та практичне значення, оскільки гіперпродукція пероксинітританіону залучена в патогенетичні механізми серцево-судинних, нейродегенеративних, автоімунних, онкологічних та інших захворювань. Найближчим аналогом запропонованої корисної моделі вибрано спосіб визначення вмісту метаболітів оксиду азоту, зокрема, нітритів та нітратів у біологічному матеріалі, який передбачає визначення концентрації іонів NO2 та NO3 спектрофотометричним методом на основі кольорової реакції з реактивом Грісса [1]. Однак концентрацію прямого метаболіту оксиду (II) -пероксинітрит-аніону - цим способом безпосередньо визначити неможливо. В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб визначення концентрації пероксинітрит-аніону в біологічному матеріалі спектрофотометричним методом. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення концентрації пероксинітританіону в біологічному матеріалі, що включає використання спектрофотометричного методу, 1 UA 77328 U 5 згідно з корисною моделлю, концентрацію пероксинітрит-аніону визначають спектрофотометричним методом за допомогою ортофенілендіаміну. Пероксинітрит-аніон у кислому середовищі (рН 2,0-4,0) швидко окиснює орто-фенілендiамін з утворенням 3-діамінофеназину, який проявляє максимум поглинання у діапазоні довжин хвиль 417-500 нм: NH2 NH2 10 15 20 25 30 35 ONOO- + H+ N H2O2 NH2 N NH2 . Відомо, що для довжини хвилі 440 нм мілімолярний коефіцієнт поглинання становить 13 000 -1 -1 cм /М [2]. Спосіб визначення концентрації пероксинітрит-аніону здійснюють наступним чином. У дослідну пробірку додають 2,97 мл 4,8 ммоль/л розчину ортофенілендіаміну в 0,2 моль/л КСl-НСl буфері, рН 2,0. До реакційного середовища додають 30 мкл сироватки крові або гомогенату тканини. Реакційну суміш інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Потім рН реакційної суміші доводять до 1,0 за допомогою 12 н НСl. Оптичну густину розчину вимірюють при довжині хвилі 440 нм в ультрафіолетовому спектрі. -7 -6 У діапазоні концентрацій пероксинiтрит-аніону від 4,410 до 8,010 моль/л залежність оптичної густини кінцевої реакційної суміші від концентрації пероксинітрит-аніону є лінійною [3]. Розрахунок концентрації пероксинітрит-аніону проводять за формулою: E  P X 13000  a  b , де Е - зміна оптичної густини проби при довжині хвилі 440 нм; Р - кінцевий об'єм проби в кюветі, мл; -1 -1 13000 cм /M - молярний коефіцієнт поглинання оптичної густини 2,3-діамінофеназину при довжині хвилі 440 нм [3]; а - концентрація білка в пробі, г/л; b - кількість внесеного екстракту, мл. Концентрацію пероксинітрит-аніону виражають у ммоль/л. Запропоноване використання спектрофотометричного методу з реагентом ортофенілендіаміном дозволяє достовірно та безпосередньо визначати концентрацію пероксинітрит-аніону в біологічних матеріалах. Джерела інформації: 15 1. Green L.C., David A.W. Analysis of nitrate, nitrite, and [ N] nitrate in biological fluids// Anal. Biochem.-1982. - Vol. 126. - P. 131-138. 2. Patty K.-L. Fu, Sonia Abuzakhm and Claudia Turro. Photoinduced DNA Cleavage and Cellular Damage in Human Dermal Fibroblasts by 2,3-Diaminophenazine// Photochemistry and Photobiology.2005. - Vol.81. - P. 89-95. 3. De-Jia Li, Li-Lin Wang, Xuan Zeng, Guo-Lin Zou. Spectrophotometric Determination of Peroxynitrite Using o-Phenylenediamine as a Probe// Analytical Letters.-2004. - Vol.37. - P.29492963. 40 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 Спосіб визначення концентрації пероксинітрит-аніону в біологічному матеріалі, що включає використання спектрофотометричного методу, який відрізняється тим, що концентрацію пероксинітрит-аніону визначають спектрофотометричним методом за допомогою ортофенілендіаміну. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2