Спосіб хроматографічного визначення концентрації окремих класів ліпідів у біологічному матеріалі

Спосіб хроматографічного визначення концентрації окремих класів ліпідів у біологічному матеріалі, який включає використання скляних пластинок з тонким шаром силікагелю, хроматографічної системи: петролейний ефір-діетиловий ефіроцтова кислота, проявлення пластинок у парах йоду, біхроматне визначення вмісту окремих фракцій ліпідів і калібрування отриманих результатів методом внутрішнього стандарту за який викорис 3 50870 4 Спосіб хроматографічного визначення концентраНст - оптична густина внутрішнього стандарту ції окремих класів ліпідів у біологічному матеріалі. (фракція неетерифікованого - вільного холестероМПК8 G01N30/00 - 30/96; 33/483; В01D15/00. Заявлу); ка держпатенту України № u 200910523 від 16.10. Р - наважка досліджуваного матеріалу, г або 2009 [Текст]: / Й.Ф. Рівіс, А.В. Шелевач, М.І. Храбмл. ко, О.М. Фріштак, М.М. Цап, І.І. Саранчук). При необхідності наведений вище показник Спосіб ґрунтується на тому, що із біологічного легко може бути перерахований в молярні одиниматеріалу (рослинних і тваринних тканин і рідин) ці. екстрагують ліпіди. Далі, ліпіди хроматографічно При проведенні патентно-інформаційного порозділяють на окремі фракції (фосфоліпіди, неешуку авторами і заявником знайдено технічне рітерифікований холестерол, неетерифіковані жирні шення (Рівіс Й.Ф. Спосіб хроматографічного викислоти, моноацилгліцероли, диацилгліцероли, значення концентрації окремих класів ліпідів у триацилгліцероли і етерифікований холестерол). біологічному матеріалі. МПК8 G01N30/00 -30/96; Розділення екстрагованих ліпідів проводять на 33/483; В01D15/00. Заявка держпатенту України пластинках з тонким шаром силікагелю за допомо№u200910523 від 16.10.2009 [Текст]: / Й.Ф. Рівіс, гою системи петролейний ефір - діетиловий ефір А.В. Шелевач, М.І. Храбко, О.М. Фріштак, М.М. оцтова кислота. Пластинки з фракціями ліпідів Цап, I.I. Саранчук), який містить суттєві ознаки, проявляють у парах йоду. Концентрацію окремих спільні із заявленим рішенням - використання фракцій ліпідів визначають біохроматним метоскляних пластинок з тонким шаром силікагелю, дом. Кількісні дані отримують за рахунок калібрухроматографічної системи петролейний ефір вання, яке проводять методом внутрішнього нордіетиловий ефір - оцтова кислота, проявлення мування. пластинок у парах йоду, біхроматне визначення Недоліком цього способу є те, що він не дає вмісту окремих фракцій ліпідів і калібрування змоги визначати концентрацію окремих фракцій отриманих результатів. Але наявність зазначених ліпідів (фосфоліпідів, неетерифікованого холестеознак, спільних з прототипом, не забезпечує техніролу, неетерифікованих жирних кислот, моноацилчний результат, що досягається заявленим спосогліцеролів, діацилгліцеролів, триацилгліцеролів і бом. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак етерифікованого холестеролу) в абсолютних одиповністю співпадали із заявленим - не виявлено. ницях. Це дозволяє зробити висновок про відповідність Спосіб, що заявляється, усуває недоліки прозаявленого технічного рішення критерію винаходу тотипу та забезпечує, шляхом використання мето"Новизна". ду внутрішнього стандарту, отримання результатів У патентній і науково-технічній інформації не хроматографічного визначення концентрації фосзнайдено технічних рішень, в яких були б описані фоліпідів, неетерифікованого та етерифікованого відомості про ознаки, що відрізняють заявлений холестеролу, неетерифікованих жирних кислот, спосіб від прототипу та забезпечують досягнення моно-, ди- і триацилгліцеролів у біологічному матехнічного результату (кількісного - в абсолютних теріалі (рослинних і тваринних тканинах і рідинах) одиницях - хроматографічного визначення конценв абсолютних одиницях (г/кг або л). трації фосфоліпідів, неетерифікованого холестеВ основу корисної моделі покладено завдання ролу, неетерифікованих жирних кислот, моноацилзнайти точний, придатний для використання в лагліцеролів, диацилгліцеролів, триацилгліцеролів і бораторній практиці, спосіб хроматографічного етерифікованого холестеролу в біологічному мавизначення концентрації фосфоліпідів, неетерифітеріалі). Отже, заявлене технічне рішення не викованого та етерифікованого холестеролу, неетепливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє рифікованих жирних кислот, моно-, ди- і триацилгзробити висновок про відповідність його критерію ліцеролів у біологічному матеріалі (рослинних і "винахідницький рівень". тваринних тканинах і рідинах). Заявлений спосіб належить до галузі біологічТехнічний результат при проведенні хроматоних наук, зокрема до біохімії, а саме до способів графічних досліджень фосфоліпідів, неетерифікохроматографічного визначення концентрації фосваного холестеролу, неетерифікованих жирних фоліпідів, неетерифікованого та етерифікованого кислот, моноацилгліцеролів, диацилгліцеролів, холестеролу, неетерифікованих жирних кислот, триацилгліцеролів і етерифікованого холестеролу моно-, ди- і триацилгліцеролів у біологічному мадосягають шляхом визначення концентрації дослітеріалі (рослинних і тваринних тканинах і рідинах) і джуваних фракцій в абсолютних одиницях (г/кг або може бути використаний в лабораторних досліл) за формулою: дженнях, а тому відповідає критерію "Промислова придатність". С / ст 100 , г / кг або л Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький де Х - концентрація досліджуваної фракції ліпідів, рівень, тобто відповідає всім умовам патентог/кг або л; спроможності винаходу згідно статті 7 розділу II Н - оптична густина досліджуваної фракції лізакону України "Про охорону прав на винаходи і підів; корисні моделі" № 1771-III. С - кількість внутрішнього стандарту (неетеРеалізацію заявленого винаходу здійснюють рифікованого - вільного холестеролу), мг; наступним чином. Спочатку до певної кількості К - поправочний коефіцієнт для досліджуваної досліджуваного біологічного матеріалу (рослинних фракції ліпідів; і тваринних тканин і рідин) в флаконі додають аліквотну кількість внутрішнього стандарту (неетери 5 50870 6 фікованого - вільного холестеролу). Далі, із досліПластинки з нанесеними на неї ліпідами ставджуваного матеріалу екстрагують ліпіди. Згодом, лять під невеликим кутом до стінки камери з таким ліпіди хроматографічно розділяють на окремі фрарозрахунком, щоб стартова лінія ліпідів не торкакції (фосфоліпіди, неетерифікований холестерол, лася налитої в неї хроматографічної системи. Данеетерифіковані жирні кислоти, моноацилгліцеролі, камеру накривають притертим склом. Хроматоли, диацилгліцероли, триацилгліцероли і етерифіграфія ліпідів у камері, залежно від кімнатної кований холестерол). Розділення екстрагованих температури, триває 40-60хв. Час завершення ліпідів проводять на пластинці з тонким шаром хроматографії визначається верхньою межею підсилікагелю за допомогою системи петролейний няття системи на пластинках. Вона не повинна ефір - діетиловий ефір -оцтова кислота. Пластинку бути меншою 1см від верхнього краю пластинки. з фракціями ліпідів проявляють у парах йоду. КонОдночасно готують ексикатор для прояву пластицентрацію окремих фракцій ліпідів визначають нок у парах йоду. Для цього на його дно насипабіхроматним методом. Результати досліджень ють близько 2г кристалічного йоду. Згодом ексикакалібрують. тор накривають притертою скляною кришкою. Досліджували концентрацію фосфоліпідів, неПісля цього пластинки виймають із хроматогетерифікованого холестеролу, неетерифікованих рафічної камери та звільняють від залишків сисжирних кислот, моно- та диацилгліцеролів, триатеми шляхом висушування при кімнатній темперацилгліцеролів і етерифікованого холестеролу в турі. Далі, пластинки з розділеними ліпідами скелетних м'язах гусей. Для цього, до першого ставлять на 20-30хв. в насичений парами йоду флакону з кольорового скла додають 1г тканини та ексикатор. Після цього, пластинки із ексикатора 20мл хлороформ-метанольної суміші (2:1 за об'євиймають та обводять голкою проявлені плями мом), а до другого -1г тканини, 0,25мг неетерифіліпідних фракцій. Згодом, плями, що містять ліпікованого - вільного холестеролу та 20мл хлороди, переносять в термостійкі пробірки, до яких доформ-метанольної суміші. Флакони закривають ливають 0,25мл IN K2Cr2O7 і 0,4мл концентрованої притертим поліетиленовим корком і ставлять на H2SO4. Останню доливають безпосередньо перед шуттель-аппарат, на якому протягом 2-х годин їх електричною банею. Далі, пробірки на 20хв. ставвмістиме інтенсивно перемішується. Далі, до вміслять в електричну баню при температурі 160°С. тимого флаконів доливають 7мл дистильованої Під час цього через кожні 5хв. вмістиме пробірок води. Після розділення вмістимого флаконів водоперемішують. Після закінчення термостатування струминною помпою відбирають верхній воднопробірки охолоджують шляхом опускання у баню з метанольний шар і відкидають, а нижній - піпеткою протічною водопровідною водою. Далі, до пробірок переносять на паперові фільтри з синьою смужкою доливають 1,2мл дистильованої води та його вміст та фільтрують у попередньо зважені пробірки розперемішують. Через 1-2 години, необхідних для міром 8х160мм. Хлороформ із пробірок випаровуосадження силікагелю, в 1см кюветах вимірюють ють у вакуумній шафі. Згодом, пробірки з ліпідами оптичну густину вмістимого пробірок на електрозважують та визначають їх масу. Після цього ліпіфотоколориметрі при довжині хвилі 615нм. ди в пробірках розчиняють в 1мл кількості гексану. Для отримання кількісних даних (в абсолютних Поряд з наведеним вище на дві скляні пластиодиницях) результати хроматографічних дослінки розміром 9x12см наносять 6мл водної суспенджень калібрують. Останнє проводять методом зії силікагелю з гіпсом. Для цього до 12г силікагевнутрішнього нормування. За норму приймають лю марки L 5x40мк (Chemapol) додають 6г оптичну густину фракції неетерифіковарюго холесилікагелю марки LC 5x40 мк (Chemapol) та долистеролу. До неї прирівнюють оптичну густину фравають 45 мл дистильованої води. Пластинки з накцій фосфоліпідів, неетерифікованих жирних киснесеною на неї водною суспензією силікагелю з лот, моноацилгліцеролів, диацилгліцеролів, гіпсом висушують при кімнатній температурі та триацилгліцеролів і етерифікованого холестеролу. ставлять в сушильну шафу для активації. Остання Для калібрування використовують суміші хімітриває 30хв. при температурі 110°С. Після цього чно чистого фосфатидилхоліну (лецитину), хімічно пластинки виймають та ставлять в ексикатор для чистого неетерифікованого (вільного) холестероохолодження. лу, хімічно чистих моно- та диацилгліцеролу (паАліквотну частину гексанового розчину, який льмітату та пальмітоолеату в відношенні 1:1), хімімістить біля 10мг ліпідів, за допомогою скляної чно чистих неетерифікованих жирних кислот піпетки з відтягнутим носиком наносять на пласти(пальмітинової, олеїнової та лінолевої в відношеннки з активованим і охолодженим тонким шаром ні 1:1:1), хімічно чистого триацилгліцеролу (пальсилікагелю. Нанесення проводять у вигляді лінії на мітоолеатолінолеату), хімічно чистого етерифіковідстані 1,5см від нижнього краю пластинки. Після ваного холестеролу (з пальмітиновою кислотою). цього гексан із пластинок випаровують в вакуумній Перед тим як розрахувати концентрацію (в абшафі. солютних одиницях) окремої ліпідної фракції з Поряд з цим готують хроматографічну камеру оптичної густини фракції неетерифікованого - віз прозорого скла. Дно та стінки хроматографічної льного холестеролу вираховують ту частку густикамери вистилають фільтрувальним папером. Дани, яка припадає на добавлений холестерол. Це лі, в камеру вливають хроматографічну систему, роблять із співвідношень. В першому флаконі, до яка складається з петролейного ефіру якого не добавляли неетерифікований - вільний діетилового ефіру - оцтової кислоти (70:30:1 по холестерол оптична густина цієї фракції до оптичоб'єму). Система не повинна бути мутною. Крім ної густини фракції фосфоліпідів становила Y. В того, використовують петролейний ефір марки другому флаконі, в який добавляли неетерифіко40x70°С. ваний - вільний холестерол оптична густина цієї 7 50870 8 фракції до оптичної густини фракції фосфоліпідів К - поправочний коефіцієнт для досліджуваної становила Z. Далі, з величини Z вираховують вефракції ліпідів; личину Y. Отримане значення (Нст.) використовуНст - оптична густина внутрішнього стандарту ють в наступній формулі: (фракція неетерифікованого - вільного холестеролу); С / ст 100 , г / кг або л Р - наважка досліджуваного матеріалу, г або мл. де X - концентрація досліджуваної фракції ліпідів, При необхідності наведений вище показник г/кг або л; легко може бути перерахований в молярні одиниН - оптична густина досліджуваної фракції ліці. підів; Способом прототипу та заявленим способом С - кількість внутрішнього стандарту (неетехроматографії в тонкому шарі силікагелю визначарифікованого - вільного холестеролу), мг; ли концентрацію ліпідних фракцій в скелетних м'язах гусей. Результати досліджень показані в табл. Таблиця Концентрація ліпідних фракцій в скелетних м'язах гусей Спосіб визначення Ліпідні фракції прототип, % 23,49 6,14 9,57 4,64 26,12 30,04 Фосфоліпіди Неетерифікований холестерол Моно- та диацилгліцероли Неетерифіковані жирні кислоти Триацилгліцероли Етерифікований холестерол Отримані експериментальні дані вказують на те, що заявлений спосіб, порівняно зі способом прототипу, дає більш інформативні дані. З резуль Комп’ютерна верстка В. Мацело заявлений спосіб, г/кг 5,24 1,37 2,14 1,04 5,82 6,70 татів досліджень, отриманих заявленим способом, розрахунковим шляхом можна отримати дані, які визначаються за способом прототипу. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601