Штам симбіотичних бактерій rhizobium trifolii 20 для приготування препарату для підвищення продуктивності конюшини

Штам симбіотичних бактерій Rhizobium trifolii 20 для приготування препарату для підвищення продуктивності конюшини, який зареєстрований за номером 1MB В-7109 в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України. Корисна модель стосується сільськогосподарської мікробіології, зокрема, бактерій, які використовують для покращання азотного живлення і підвищення продуктивності конюшини за рахунок активізації фіксації молекулярного азоту атмосфери симбіотичною фітобактеріальною системою. Широке застосування хімічних засобів підвищення продуктивності культурних рослин призводить до накопичення залишків шкідливих сполук і міграції їх в системі атмосфера-рослина-грунтвода і т.д. Наслідком таких міграцій є забруднення продукції рослинництва і тваринництва з подальшим потраплянням шкідливих речовин в організм людини [1]. Альтернативою надлишкової хімізації сільськогосподарського виробництва є створення біопрепаратів на основі мікроорганізмів з агрономічно корисними властивостями, зокрема, азотфіксуючих бульбочкових бактерій бобових культур. В Україні такі біопрепарати створені для більшості бобових культур і мають загальну назву Ризобофіт з вказівкою саме якої бобової культури він містить бульбочкові бактерії [4]. Але активного конкурентноспроможного штаму бульбочкових бактерій конюшини ще не було селекційовано, адже конюшина є традиційною культурою для нашого регіону і диких представників цього виду багато у ґрунті [2]. Проте ґрунтові бульбочкові бактерії не завжди є активними азотфіксаторами, тому селекція штамів Rhizobium trifolii з високим рівнем нітрогеназної активності (характеризує інтенсивність азотфіксації) і, основне, конкурентноспроможних щодо ґрунтових ризобій дуже складне і важливе завдання, яке вдалося вирішити. Прототипу Rhizobium trifolii штаму 20 не зареє стровано, тому ефективність його дії на продуктивність рослин порівнювали з ефективністю спонтанній інокуляції бульбочковими бактеріями конюшини (вид Rhizobium trifolii), які містяться у ґрунті. У польовому досліді насіння конюшини лучної обробляли суспензією штаму Rhizobium trifolii 20, а контролем слугувало насіння, оброблене водою. Порівнювали кількість бульбочок, що утворились на коренях конюшини інокульованої штамом Rhizobium trifolii 20, з кількістю бульбочок, що утворились на коренях конюшини інокульованої "дикими" штамами Rh. trifolii, які існують в ґрунті (фон спонтанної інокуляції). Задачею корисної моделі було одержання штамів Rhizobium trifolii конкурентоспроможних щодо ґрунтових симбіотичних азотфіксуючих бульбочкових бактерій конюшини (вид Rhizobium trifolii), які мають високу нодулюючу (бульбочкоутворюючу) здатність і високий рівень нітрогеназної активності. З цією метою було проведено виділення штамів з бульбочок конюшини лучної і визначена їх нодулююча здатність і нітрогеназна активність на фоні спонтанної інокуляції ґрунтовими ризобіями. Технічним результатом корисної моделі, що заявляється, є вища ефективність позитивної дії на продуктивність конюшини виділеного штаму Rhizobium trifolii 20, порівняно з сапрофітно живучими у ґрунті бульбочковими бактеріями, що досягається більш активною фіксацією атмосферного азоту штамом Rhizobium trifolii 20 у симбіозі з рослинами конюшини. Корисна модель відноситься до роду Rhizobium, виду Rhizobium trifolii. Штам Rhizobium trifolii 20 задепоновано в Ін ю О) оГ 7954 ституті мікробіології і вірусології НАН України під номером 1MB №Б - 7109. Штам 20 виділено на агаризованому манітнодріжджовому середовищі 18.06.2003р. зі стерильно розтертих бульбочок конюшини лучної, вирощуваної на полях с. Ставчани, Пустомитівського рну, Львівської обл. Склад середовища: маніт -10г, дріжджовий екстракт - 1г, калію фосфат двозаміщений - 0,5г, магнію сульфат - 0,2г, вода - до 1л, рН7,2. Культурально-морфологічні ознаки. В однодобовій культурі бактерії мають паличкоподібну форму розміром 0,6- 1,0х 1,2-2,5мкм. Спор не утворюють. Рухомі завдяки наявності полярного джгутика. Грамнегативні. Аероби, але здатні рости й в мікроаерофільних умовах. Оптимальна температура для розвитку культури в діапазоні 2530С°, рН7,0-7,5. На поверхні агаризованого манітнодріжджового середовища штам утворює колонії округлі, випуклі, підняті в центрі, білуваті, напівпрозорі, слизисті, діаметром до 5мм. Зростання біомаси бактерій при посіві штрихом на гороховому агарі інтенсивне, штрих блискучий, слизький. Фізіолого-біохімічні властивості. Хемоорганотрофи. Використовують в якості джерела вуглецю широке коло різних вуглеводів, солі органічних кислот. Целюлозу і крохмаль не засвоюють. Газ не утворюють. Підкислюють середовище з мінеральними солями і манітом чи іншими вуглеводами при культивуванні. Джерелом азоту можуть служити солі амонію, нітрати і амінокислоти. Спостерігається дуже слабкий ріст на м'ясопептонному агарі. Агар не гідролізують. При рості в рідкому середовищі з перемішуванням культури досягають значної щільності через 2 доби інкубації. Штам не патогенний. Зберігається штам на скошеному гороховому середовищі з манітом або глюкозою (10%-ний відвар гороху - ЮОмл, маніт або глюкоза 2г, агар - 2г, вода до л., рН7,2) при 5-7С°. Періодичність пересівів 3 місяці. Ознаки штаму стійкі. Біотехнологічна характеристика: Здатні проникати в коріння конюшини і викликати утворення кореневих бульбочок (нодулююча здатність), в середині яких бактерії присутні як внутріклітинні симбіонти. В кореневих бульбочках з бактерій утворюються бактероїди, тобто структури, які за допомогою ферменту нітрогенази здійснюють фіксацію молекулярного азоту повітря і трансформують його в аміачну форму, доступну для використання рослинами конюшини. Які, у свою чергу, забезпечують бульбочкові бактерії вуглецем у вигляді продуктів фотосинтезу. Отже симбіоз оснований на постачанні бактеріями рослинам доступних сполук азоту, а рослинами бактеріям - вуглецю. В польовому досліді штам Rh. trifolii 20 виявився конкурентноспроможним, тобто утворив більшу кількість бульбочок на коренях конюшини, ніж ґрунтові бульбочкові бактерії. В таблиці показана нодулююча (бульбочкоутворююча) здатність нових штамів Rhizobium trifolii та азотфіксуюча активність бульбочок. За даних таблиці кількість бульбочок утворених на коренях інокульованих рослин майже в 2 рази переважає кількість бульбочок на коренях рослин (без інокуляції Rhizobium trifolii 20). Визначення накопичення сухої фітомаси конюшини сортів Спарта і Анітра, також показало перевагу інокуляції штамом 20, який забезпечив її приріст, відповідно, на 98 і 151 мг в середньому на 1 рослину порівняно з контролем (інокуляція ґрунтовими ризобіями). Нітрогеназна активність рослин конюшини лучної сортів Спарта і Анітра оброблених штамом Rhizobium trifolii 20 була вища на 1,5 і 2,7мкмоль відновленого етилену за 1 годину в середньому на 1 рослину порівняно з контролем. Азотфіксуюча активність симбіотичної системи Rhizobium trifolii -Trifolium pretense (бульбочкових бактерій конюшини і конюшини лучної) визначається за активністю ферменту нітрогенази методом ацетиленредукції Р. Харді [5]. Все вищезазначене дає підставу вважати, що штам Rhizobium trifolii 20 може бути використаний як біоагент препарату Ризобофіт для покращання азотного живлення і підвищення продуктивності конюшини. Склад виробничих середовищ для культивування бульбочкових бактерій і виготовлення препарату Ризобофіт на їх основі [3] придатний і для штаму Rhizobium trifolii 20: Маточна культура (г/л): Горох (відвар) - 70,0; Сахароза -10,0; (NH 4 ) 2 SO 4 - 1,0; КН2РО4-ЗН2О -0,5; К2НРО4 - 0,5; MgSO4-7H2O -0,2; СаСОз -1,0; Інокуляційне середовище (г/л): Кукурудзяний екстракт 7-10.0; Меляса бурякова 20; (NH 4 ) 2 SO 4 1,0; КН 2 РО 4 -ЗН 2 О 0,5; К2НРО4 0,5; MgSO4-7H2O 0,2; СаСОз 1,0; Вода водопровідна рН довести рідким склом до 7,0-7,2. Культивування на качалці при 220об/хв при температурі 28-30°С. Загальний титр 3-х добової культури - 5-10млрд/мл. Таким чином, штам симбіотичних азотфіксуючих бульбочкових бактерій конюшини виду Rhizobium trifolii 20 є господарсько цінним штамом для покращання азотного живлення і підвищення продуктивності конюшини, може застосовуватись як біоагент препарату під конюшину Ризобофіту у практиці сільського господарства. Список літератури 1. Агроэкология /Под ред. В.А. Черникова и А.И. Черкеса. -М.: Колос, 2000. -536с. 2. Толкачов М.З. Ефективне використання симбіотичної азотфіксації в сучасному землеробстві України проблеми і перспективи //Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм: Матеріали міжнародної конференції. -Тернопіль, 2001. -С.142-146. 3. Хотянович А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и 7954 применения препаратов на их основе. -Ленинград. -1991.-60с] 4. Шерстобоєва О.В. Роль мікробіологічних препаратів у підвищенні продуктивності рослин екологічно безпечними засобами //Физиология и биохимия культ, растений. 2004. Т.36. №3, С.229 238. 5. Hardy R., Holsten R., Jackson E. The acetylene-etylene assay for N fixacion: laboratory and field evaluation /Plant Physiology. -1968. -Vol. 43, N6. P. 1185-1207. Таблиця Варіант Кількість бульбочок на 1 рослину Контроль Rh. tnfoln 20 9,3±0,4 16,4±0,5 Контроль Rh. trifoln 20 15,1 ±0,9 9,8±0,7 Комп'ютерна верстка Л Литвиненко Суха маса 1 рослини, мг Сорт Анітра 254±12,7 405+30,4 Сорт Спарта Нітрогеназна активність, мкмоль С2Н4/ годину/рослину 254 ±1,4 352±19,1 1,0±0,22 2,5±0,08 Підписне 1,3±0,04 4,0±0,26 Тираж 28 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ -42,01601