Відтворена поверхнево-активна речовина, спосіб її отримання та застосування в терапії

1. Відтворена поверхнево-активна речовина, яка складається із суміші штучного пептиду і фосфоліпідів, яка відрізняється тим, що штучним пептидом є аналог SP-C формули (І) FeGf IPZZPVHLKR(XaB)n (XbB)n (XcB)m XdGALLWGL , (I) де: Х - амінокислота, відібрана з групи, яка складається з І, L, nL (норлейцину); В - амінокислота, відібрана з групи, яка складається з K, W, F, Y, орнітину; Z - S, як варіант, заміщена ацилгрупами, які мають 12-22 атомів карбону, з'єднаних з побічним ланцюгом естерним зв'язком; W - амінокислота, відібрана з групи, яка складається з М, І, L, nL; a - ціле число від 1 до 19; b - ціле число від 1 до 19; c - ціле число від 1 до 21; d - ціле число від 0 до 20; e - 0 або 1; f – 0 aбo1; n - 0 або 1; m - 0 або 1; 2 (19) 1 3 79609 4 9. Відтворена поверхнево-активна речовина за будь-яким з пп. 1-7 у формі розчину, дисперсії, суспензії або сухого порошку. 10. Відтворена поверхнево-активна речовина за будь-яким з пп. 1-7 для виробництва медикаменту для лікування захворювання, пов'язаного з дисфункцією легеневої поверхнево-активної речовини. 11. Відтворена поверхнево-активна речовина за п. 10, яка відрізняється тим, що захворюванням є респіраторний дистрес-синдром (РДС). Представлений винахід стосується відтворених поверхнево-активних речовин, які складаються з фосфоліпідів і штучни х пептидів, що здатні знижувати поверхневий натяг на межі розділу повітря-рідина. Зокрема, винахід стосується відтворених поверхнево-активних речовин, які містять особливі фосфоліпідні суміші і штучні пептиди, які є аналогами природної поверхнево-активної речовини білку SP-C для лікування респіраторного дистрес-синдрому (РДС) і інших захворювань, які мають відношення до дисфункцій легеневих поверхнево-активних речовин. Легенева поверхнево-активна речовина знижує поверхневий натяг, який виникає на межі розділу повітря-рідина внутрішньої альвеолярної стінки, таким чином уберігаючи легені від колапсу наприкінці видиху. Недостачею поверхневоактивної речовини є дисфункція, яка зазвичай впливає на недоношених дітей і викликає РДС, захворювання, яке можна ефективно вилікувати за допомогою природних поверхнево-активних речовин, видалених з легень тварин. Основними компонентами таких препаратів поверхнево-активних речовин є такі фосфоліпіди, як 1,2-дипалмітоїл-злгліцеро-3-фосфохолін, відомий як ди-палмітоїлфосфа тидил-холін (ДПФХ), фосфа тидилгліцер (ФГ) і поверхнево-активні гідрофобні білки В і С (SP-B I SP-C). Гідрофільні поверхнево-активні білки SP-A I SP-D, якими є колагенові лектини С-типу (Са2+-залежні) і які, як вважають, діють головним чином у захисній системі хазяїна, звичайно не залучені до препаратів поверхнево-активних речовин внаслідок застосованих способів екстракції органічним розчинником. Модифіковані препарати поверхнево-активних речовин, отримані з тваринних тканин, застосовують в сучасній терапевтичній практиці. Ці препарати звичайно складаються з вищезгаданих . компонентів, за виключенням гідрофільних білків, які усуваються при екстракції органічними розчинниками. Внаслідок таких недоліків препаратів поверхнево-активних речовин з тваринних тканин, як складність процесів виготовлення і стерилізації та можливої індукції імунних реакцій, були здійснені спроби виготовити штучні поверхнево-активні речовини. В буквальному смислі слова, штучними поверхнево-активними речовинами є суміші тільки фосфоліпідів або суміші фосфоліпідів і інших синтетичних ліпідів. Відтвореними поверхнево-активними речовинами є штучні поверхнево-активні речовини з додаванням гідрофобних білків або окремо від тваринних тканин, або отриманих рекомбінантними способами або синтетичних пептидних похідних таких білків. Властивості і дія відтворених поверхневоактивних речовин сильно залежать від білкових/пептидних компонент, але також від складу фосфоліпідної суміші. Було встановлено, що дипалмітоїл фосфатидилхолін (ДПФХ) к суміші зі специфічними палмітоїл-олеїл-фосфоліпідами є ідеальним розчинником для штучни х пептидів, які як правило застосовують у відтворених поверхнево-активних речовинах як аналоги природних поверхневоактивних білків SP-C і/або SP-B. Зокрема, було встановлено, що поверхнево-активні речовини, які містять SP-C аналоги, описані в [патенті WO 00/47623], у поєднанні з ДПФХ і палмітоїл-олеїлфосфоліпідом - переважно відібраним з палмітоїлолеїл-фосфатидилгліцерину (ПОФГ) або суміші ПОФГ з палмітоїл-олеїл-фосфатидилхоліном (ПОФХ) - у масових співвідношеннях від 80:20 до 60:40, знижують поверхневий натяг і в'язкість препаратів, отриманих таким чином. На противагу тому, що викладено в літературі, було неочікувано встановлено, що додавання пальмітинової кислоти (ПК) не є корисним і, більше того, в деяких випадках може знизити активність поверхневоактивної речовини in vivo. Таким чином, представлений винахід стосується відтворених поверхнево-активних речовин, які містять суміші, що по суті складаються з дипалмітоїл фосфатидилхоліну (ДПФХ) і палмітоїлолеїл-фосфатидилглицерину (ПОФГ) або його суміші з палмітоїл-олеїл-фосфатидилхоліном (ПОФХ) у масових співвідношеннях від 80:20 до 60:40 і штучни х пептидів, аналогічних природним поверхнево-активним білкам SP-C і/або SP-B. Поверхнево-активна речовина винаходу позбавлена пальмітинової кислоти. Масові співвідношення між ДПФХ і ПОФГ коливаються від 75:25 до 65:35. і є більш переважно 68:31. У випадку сумішей ДПФХ:ПОФГ:ПОФХ, фосфоліпіди переважно застосовують у масових співвідношеннях 60:20:20 або 68:15:16. Будь-який штучний пептид, аналогічний природним поверхнево-активним білкам SP-C і/або SP-B, може переважно бути застосований, так як ті, які описані в [патентах WO 89/06657, WO 92/22315 і WO 95/32992]. Переважним є застосування аналогів SP-C, які мають наступну загальну формулу (І), де амінокислоти представлені однолітерним кодом, де: X - амінокислота, відібрана з групи, яка складається з І, L, nl (норлейцину); 5 79609 В - амінокислота, відібрана з групи, яка складається з К, W, F, Y, орнітину; Z - S, як варіант, заміщена ацилгрупами, які мають 12-22 атомів карбону, з'єднаних з побічним ланцюгом через естерний зв'язок; W - амінокислота, відібрана з групи, яка складається з М, І, L, n L; а - ціле число від 1 до 19; b - ціле число від 1 до 19; с - ціле число від 1 до 21; d - ціле число від 0 до 20; е - 0 або 1; f - 0 або 1; n - 0 або 1; m - 0 або 1; за таких умов: - n+m>0; - f³e; (XaB)(XbB)n(XcB) mXd - це послідовність, яка містить максимум 22 амінокислоти, переважно від 10 до 22. Навіть більш переважним є застосування пептидів формули (II) де Q - це амінокислота, відібрана з групи з М, І, L, nL і де серин може бути додатково ацилований, наприклад, палмітоїлом. Далі описаний пептид (SP-C33) в неацилованій формі є найбільш переважним у згідно з винаходом, ІPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (SP- C33) Пептиди формули (І) можна виготовити звичайним пептидним синтезом або рекомбінантними способами, як описано в [патенті WO 00/47623]. Ациловані пептиди переважно синтезують реакцією пептидів з ацилхлоридом у чистій трифлуороцтовій кислоті протягом 10 годин за кімнатної температури, а потім гасінням 80% водним етанолом. Дію відтворених поверхнево-активних речовин згідно з винаходом стосовно зменшення поверхневого натягу оцінювали як in vitro, так і in vivo. Зокрема, результати in vivo чітко показують, що поверхнево-активні речовини згідно з представленим винаходом здатні підвищувати об'єм вдиху який в свою чергу є показником ємності легенів - у значно більшій мірі, ніж поверхнево-активні речовини, отримані з сумішами ДПФХ, ФГ і ПК, які звичайно застосовують у сучасному рівні те хніки. Відтворені поверхнево-активні речовини згідно з винаходом можуть містити SP-B або поліміксини, особливо поліміксин В, як аналоги SP-B. Поверхнево-активну речовину можна виготовити змішуванням розчинів або суспензій пептидів і фосфоліпідів і потім висушуванням суміші. Якщо необхідно, висушену суміш можна ресуспендувати, диспергувати або застосовувати як таку до особи, що потребує лікування при недостачі поверхнево-активної речовини. У випадку аерозольного застосування, буде необхідно скомбінувати малі частинки • поверхнево-активної речовини з придатним інертним пропелентом (газом-витискачем). 6 Інші форми застосування, як-то випарювання або розпилювання стійких розчинів/суспензій поверхнево-активних речовин, також залучено в рамки представленого винаходу. Наступні приклади ілюструють винахід більш детально. Приклади Експериментальний розділ Матеріали 1,2-Дипалмітоїл-sn-гліцеро-3-фосфо холін (ДПФХ), 1-палмітоїл-2-олеїл-sn-гліцеро-3фосфо холін (ПОФХ), 1-палмітоїл-2-олеїл-snгліцеро-3-фосфогліцерин (ПОФГ), фосфатидилгліцерин яєць (ФГ), пальмітинова кислота (ПК), і поліміксину В (ПВС) сульфат застосовували для виготовлення наступних ліпідних сумішей з масовими співвідношеннями: ДПФХ/ФГ/ПК, 68:22:9; ДПФХ/ПОФГ/ПК, 68:22:9; ДПФХ/ПОФХ/ПОФГ, 60:20:20; ДПФХ/ПОФГ/ПОФХ/ПК, 57:19:19:5; ДПФХ/ПОФХ/ПОФГ, 68:16:15 і ДПФХ/ПОФГ, 68:31. SP-C33 був синтезований і очищений, як описано в [патенті WO 00/47623]. Виготовлення синтетичних поверхневоактивних речовин SP-C33 і ліпіди у масових співвідношеннях пептид/ліпід 0,02:1 змішували у хлороформі/метанолі 98:2 (за об'ємом), розчинники випарювали і отримані пептидні/ліпідні нитки потім гідратували у 150мМ NaCI повторною обробкою ультразвуком, за концентрації ліпідів 80 або 35мг/мл. Зразки поверхнево-активної речовини, які застосовують для аналізів у пухирцевому сурфактометрі, розбавляли розчином солі до робочих концентрацій (10мг/мл поверхнево-активної речовини). В деяких експериментах ПВС відповідав кінцевій концентрації в 2мас% від концентрації ліпідів. Поверхневоактивна речовина, яка містила SP-C33 у ДПФХ/ФГ/ПК (68:22:9) забезпечувала дуже в'язкі суспензії при 80мг/мл і була важкою для застосування на експериментальних тваринах. Дві добре відомі модифіковані природні поверхнево-активні речовини, Curosurf (Chiesi Farmaceutici) I Survanta (Abbott) були застосовані згідно з інструкціями виробника. Curosurf суспендували при 80 мг/мл і застосовували при 2.5мл/кг маси тіла; Survanta суспендували при 25мг/мл і і застосовували при 4мл/кг маси тіла. Експерименти на пухирцевому сурфактометрі Динамічні поверхневі властивості поверхневоактивних речовин SP-C33 з 2мас% ПВС і без нього визначали на пухирцевому сур фактометрі. Для цих експериментів поверхнево-активну речовину суспендували у соляному розчині з концентрацією 10мг/мл і аналізували за 37°С. Чутливість стосовно інгібування визначали додаванням 40мг/мл альбуміну до суспензії поверхнево-активної речовини. Сполучення пухирця з оточуючим повітрям створювали у пластмасовій тестовій камері, в якій знаходилось близько 20мл зразку рідини. Радіус пухирця коливався при періодичності 40циклів/хв. від максимального 0.55 до мінімального 0.40мм, що відповідає 50% циклічному скороченню поверхні. Значення поверхневого тиску при мінімально 7 79609 му і максимальному розмірі пухирця (Ymm, Ymax) були записані протягом більше 5 хвилин пульсації. Експерименти In vi vo Суміші поверхнево-активних речовин досліджували на недоношених новонароджених кролях, отриманих гістеректомією у гестаційному віці 27 діб (строк: 31 доба). Тварин, трахеотомізованих при народженні, утримували у плетизмографічних боксах за 37°С і паралельно вентилювали 100% киснем з частотою 40 вдихів/хв. і часом вдихання 50%. Обробені тварини отримували 2.5мл/кг або 4мл/кг згаданого препарату поверхнево-активної речовини через трахеальну канюлю. Літермати (Littermates), які не отримували ніякого препарату поверхнево-активної речовини, застосовували для контролю. Після інстиляції поверхнево-активної речовини, піковий тиск спочатку підвищували до 35см Н2О за 1хв., для покращення розповсюдження поверхнево-активної речовини в легенях, потім знижували до 25см Н 2О. Потім тварин вентилювали при піковому тиску 25см Н2О протягом 15хв., після чого тиск знижували спочатку до 20см Н2О на 5хв., потім до 15см Н 2О на 5хв. і підвищували знову до 25см Н2О на 5хв. Об'єми вдиху вимірювали з інтервалом в 5хв. пневмотахографом, приєднаним до кожного плетизмографічноо боксу. Після закінчення періоду встановленої вентиляції, тварин вбивали інтрацеребральною ін'єкцією лідокаїну. їхню черевну порожнину розкривали і Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 8 досліджували місцеположення діафрагми стосовно ознак пневмотораксу. Приклад 1. Поверхнева активність SP-C33 in vitro у суміша х різних ліпідів Динамічні поверхневі властивості 2мас% SPC33 у ДПФХ/ФГ/ПК (68:22:9), ДПФХ/ПОФХ/ПОФГ (60:20:20), ДПФХ/ПОФХ/ПОФГ (68:16:15) і ДПФХ/ПОФГ (68:31) оцінювали на пухирцеврму сур фактометрі, який показав утіП