Спосіб виготовлення антигену для діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці за допомогою іфа

Реферат: Спосіб виготовлення антигену для діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці за допомогою ІФА включає зараження штамом Mycoplasma gallisepticum S6 перещеплюваної культури клітин, культивування, відбір культуральної рідини, центрифугування. Використовують для накопичення мікоплазм первинно-трипсинізовану культуру фібробластів (CEF) та триразове заморожування-відтавання для виготовлення антигену. UA 84006 U (12) UA 84006 U UA 84006 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної біотехнології та мікробіології, зокрема до способів одержання антигенів мікоплазм для серологічних реакцій. Існує спосіб виготовлення антигену за Клінбергером-Нобелем (Мікоплазмози тварин. Под ред. Я.Р. Коваленко. - М.: "Колос", 1976), що включає культивування мікоплазм на рідкому поживному середовищі протягом 5-6 діб, відбір бактерійної маси, фільтрацію через ватномарлевий фільтр, осадження шляхом одноразового центрифугування за 5 тис. об/хв протягом 30 хвилин та стандартизацію ФБФР до необхідної концентрації. Недоліком цього способу є його трудомісткість та той факт, що антиген утримує багато баластних білків з рідкого поживного середовища і тому достовірність результатів діагностичних досліджень істотно знижується. Відомий спосіб одержання антигену (Дададжанова Ю.Х. Проблемы лейкоза и инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. - М., 1988. - С. 129-131), що включає культивування мікоплазм на рідкому поживному середовищі протягом 5-6 діб, відбір бактерійної маси та концентрацію на розподільчих колонках у 20 разів. Недоліком цього способу є замалий об'єм кінцевого продукту, що підвищує його собівартість. Найбільш близьким за технічною суттю до способу, що заявляється, є виготовлення антигену (Неуcтроева В.В. и Горин Л.Г. Клиническая лабораторная диагностика, 2001. - № 10. С. 26), що включає інфікування культурою мікоплазм перещеплюваної культури клітин Vero, інкубування протягом 5 діб, відбір клітинної рідини та триразове відмивання антигену ФБФР (фосфатно-буферний фізіологічний розчин) шляхом центрифугування за 5 тис. об/хв. За цим способом отримують високоспецифічний антиген, що не утримує великої кількості баластних білків. Цей спосіб може бути прототипом. Однак, недоліком цього способу є незначне накопичення бактерійної маси мікоплазм на перещеплюваній культурі клітин Vero. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб виготовлення антигену для діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці за допомогою ІФА, що включає зараження штамом Mycoplasma gallisepticum S6 перещеплюваної культури клітин, інкубування, відбір клітинної рідини, центрифугування шляхом використання для накопичення мікоплазм первиннотрипсинізованої культури фібробластів (CEF) та використання триразового заморожуваннявідтавання для виготовлення антигену, щоб забезпечити ефективність способу. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок, що спосіб, у якому використовують для накопичення мікоплазм первинно-трипсинізовані культури фібробластів (CEF), яка є гомологічною за видовим походженням, ростовим субстратом, що забезпечує високий вихід бактерійної маси та дозволяє отримати активний і специфічний антиген, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. Проводять зараження штамом Mycoplasma gallisepticum S6 первинно-трипсинізованої культури курячих фібробластів (CEF), культивують протягом 5 діб. Після чого проводять відбір культуральної рідини та зняття моношару із подальшим триразовим заморожуванням відтаванням. Відібрану суспензію очищують від клітинного детриту центрифугуванням за 5 тис об/хв. протягом 15 хв. Супернатант відбирають та використовують як антиген. Приклад 1 При постановці ІФА із експериментальною серією антигену, виготовленою за способом, що заявляється, встановлено, що екстинція позитивних контрольних мікоплазменних сироваток перевищувала екстинцію негативної контрольної сироватки в середньому у 2,3 рази при 3 використанні антигену навіть у найменшій концентрації (1 мкг/см ). Результати контролю активності антигену з штаму Mycoplasma gallisepticum S6 в ІФА з позитивними та негативною сироваткою відображені в табл. 1 Приклад 2 При постановці ІФА із експериментальною серією антигену, виготовленою за заявленим способом, встановлено, що екстинція гетерологічних сироваток перевищує екстинцію негативної в середньому у 1,5 рази, тоді як гомологічної (позитивної контрольної) - у 2,3 рази. Це свідчить про високу специфічність отриманого антигену. Результати контролю специфічності антигену з музейного штаму Mycoplasma gallisepticum S6 із гомо- та гетерологічними сироватками відображені в табл. 2 Приклад 3 Для культивування штаму Mycoplasma gallisepticum S6 з подальшим отриманням антигену в 0,5-літровий культуральний флакон з моношаром культури клітин ФЕК вносили мікоплазму, витримували протягом 20 хвилин - "контакт" і додавали підтримуюче поживне культуральне середовище, яке складається з рівних об'ємів середовищ Ігла і 199, та 2 % сироватки крові ВРХ. Культуральні флакони витримували в термостаті за температурою 37-38 °C. 1 UA 84006 U 5 Кожну добу шляхом мікроскопії перевіряли вплив мікоплазм на моношар клітин. Після ураження 70-80 % моношару, його знімали зі скла та піддавали триразовому заморожуваннювідтаванню для руйнування клітинної оболонки та отримання антигену. Спосіб, що заявляється, дозволяє отримати високоспецифічний та активний антиген Mycoplasma gallisepticum для діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці за допомогою ІФА. Таблиця 1 3 А В С 1 мкг/см 0,593±0,002 0,542±0,007 0,254+0,001 3 2 мкг/см 0,639±0,033 0,613±0,002 0,257±0,008 Розведення антигену 3 3 3 мкг/см 4 мкг/см 0,658±0,053 0,678±0,016 0,598±0,004 0,614±0,029 0,274±0,001 0,282±0,004 3 5 мкг/см 0,723±0,050 0,680±0,001 0,290+0,012 3 10 мкг/см 0,724±0,001 0,714±0,001 0,289+0,001 Примітки: 1. А - позитивна сироватка Mycoplasma gallisepticum S6 серія 01.07; 2. В - позитивна сироватка Mycoplasma gallisepticum S6 серія 02.07; 3. С - негативна сироватка. Таблиця 2 3 А В С D 1 мкг/см 0,593±0,002 0,254±0,001 0,384+0,012 0,441±0,010 3 2 мкг/см 0,639±0,033 0,257±0,008 0,390±0,008 0,448±0,022 Розведення антигену 3 3 3 мкг/см 4 мкг/см 0,658±0,053 0,678±0,016 0,274±0,001 0,282±0,004 0,443±0,007 0,444±0,016 0,451±0,010 0,472±0,013 3 5 мкг/см 0,723±0,050 0,290±0,012 0,449±0,008 0,474±0,011 3 10 мкг/см 0,724±0,001 0,289±0,001 0,451±0,003 0,478±0,012 Примітки: 1. А- позитивна сироватка Mycoplasma gallisepticum S6 2. В - негативна сироватка; 3. С - позитивна сироватка щодо інфекційної бурсальної хвороби птиці; 4. D - позитивна сироватка щодо інфекційного бронхіту. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб виготовлення антигену для діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці за допомогою ІФА, що включає зараження штамом Mycoplasma gallisepticum S6 перещеплюваної культури клітин, культивування, відбір культуральної рідини, центрифугування, який відрізняється тим, що використовують для накопичення мікоплазм первинно-трипсинізовану культуру фібробластів (CEF) та триразове заморожування-відтавання для виготовлення антигену. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2