Спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці

Реферат: Спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці, що включає накопичення бактеріальної маси мікоплазм, інактивацію, центрифугування, ресуспендування, крім того як виробничий штам використовують штам Mycoplasma gallisepticum S6, для накопичення бактеріальної маси застосовують "Середовище рідке поживне для ізоляції та культивування мікоплазм від тварин та птиці", інактивацію проводять мертиолятом та додатково проводять детергенцію ДСН (додецилсульфат натрію). UA 80666 U (54) СПОСІБ ВИГОТОВЛЕННЯ АНТИГЕНУ ДЛЯ СЕРОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ РЕСПІРАТОРНОГО МІКОПЛАЗМОЗУ ПТИЦІ UA 80666 U UA 80666 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної імунології та мікробіології, зокрема до способу виготовлення антигену для серологічної діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці. Існує спосіб отримання антигену із штаму Mycoplasma gallisepticum для використання його в серологічних реакціях (Sensitivity and specificity of Mycoplasma gallisepticum agglutination antigens prepared from medium with artificial liposomes substituting for serum, [text] /І. Ahmad [et all] // Avian Dis. - 1988. - Vol. 32, № 3. - P. 519-526). Спосіб включає накопичення бакмаси мікоплазм на специфічному середовищі Фрея з додаванням 12 % сироватки крові свиней та штучних ліпосом, стандартизацію клітин. Недоліком цього способу є неможливість стандартизації вмісту ліпосом у поживному середовищі, внаслідок чого не можливо спрогнозувати кількість отриманої бакмаси мікоплазм. Також існує спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики мікоплазмозів за методом Bordier (J. Bio. Chem. - 1981. - Vol. 256. -P. 1604-1606). Спосіб включає накопичення бакмаси мікоплазм на середовищі Фрея, ресуспендування бакмаси мікоплазм фосфатним буферним розчином і додавання до бакмаси Triton Х-114 з розрахунку 2 мг на 1 мг білка. Оброблений матеріал осаджують розчином 80 % етанолу в присутності носія декстрану (молекулярна маса 80000). Антиген збирають шляхом центрифугування при 12000 g. Недоліком цього способу є висока вартість отриманого антигену. Таким чином, цей спосіб є економічно невиправданим. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб виготовлення мікоплазменного антигену для імунологічних реакцій (А.С. № 588237 "Способ изготовления микоплазменного антигена для иммунологических реакций" МПК С12К1/00, А61К39/00 1978 р.). Для виготовлення антигену застосовують мікоплазми, які культивують і накопичують у рідкому поживному середовищі на основі триптичного гідролізату м'яса кроля з додаванням сироватки крові великої рогатої худоби, бакмасу мікоплазм стандартизують та оброблюють 1 %-вим розчином Твін-40 в присутності рівного об'єму етилового ефіру. Це рішення може бути прототипом. Недоліком прототипу є висока вартість препарату, обумовлена потребою у більшій кількості середовища для отримання бактерійної маси штаму, а також те, що етиловий ефір є прекурсором. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці, що включає накопичення бактеріальної маси мікоплазм, інактивацію, центрифугування, ресуспендування, шляхом використання як виробничий штам Mycoplasma gallisepticum S6., застосування для накопичення бактеріальної маси "Середовища рідкого поживного для ізоляції та культивування мікоплазм від тварин та птиці", інактивації мертиолятом, та додаткового проводення детергенції ДСН (додецилсульфат натрія), щоб забезпечити ефективність способу. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок, що застосування для накопичення мікоплазм "Середовища рідкого поживного для ізоляції та культивування мікоплазм від птиці", розробленого колективом авторів ННЦ "ІЕКВМ" спеціально для культивування Mycoplasma gallisepticum, забезпечує високий вихід бактеріальної маси. Обробка мікоплазм мертіолатом дозволяє досягти повної інактивації збудника, детергенція ДСН та термінальний діаліз дозволяють отримати активний та специфічний антиген для серологічної діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. Спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці включає накопичення бактерійної маси виробничого штаму Mycoplasma gallisepticum S6 у "Середовищі рідкому поживному для ізоляції та культивування мікоплазм від тварин та птиці" (режим інкубації - 5 діб за температури 37,5 °C). Отримана бакмаса піддається інактивації шляхом додавання мертіолату (1:10000) (режим інактивації - 2 доби за температури 37,5 °C). Інактивована бактерійна маса триразово відмивається стерильним фосфатно-буферним фізіологічним розчином шляхом центрифугування за режимом 5 тис. об./хв. протягом 20 хвилин. Клітинна маса мікоплазм ресуспендується стерильним ФБФР у співвідношенні 1:100, піддається детергенції ДСН у співвідношенні 1 мг ДСН на 1 мг білка, режим детергенції: 60 хвилин за температури 37 °C. Оброблений матеріал очищується шляхом діалізу впродовж двох діб за температури 4 °C проти ФБФР із додаванням ЕДТА (кінцева концентрація 0,01 %), 3 стандартизується до концентрації 30 млрд.м.т./см . Отриманий препарат використовується в якості антигену. Приклад 1 З метою вивчення антигенних властивостей були виготовлені 4 експериментальні серії антигенів з бактерійної маси музейного штаму Mycoplasma gallisepticum S6. Серії антигенів (№№ 3 1-2) являли собою інактивовану та стандартизовану до концентрації 30 млрд.м.т./см нативну 1 UA 80666 U 5 10 15 20 25 клітинну масу музейного штаму Mycoplasma gallisepticum S6 та дві серії (№№ 3-4) були виготовлені з музейного штаму Mycoplasma gallisepticum S6 за багатоступеневою методикою, що включає інактивацію, стандартизацію, детергенцію ДСН та термінальний діаліз. Було перевірено їх активність та специфічність у СКРА (сироваткокраплинна реакція аглютинації) із гомо- та гетерологічними сироватками. Встановлено, що всі антигени в СКРА із гомологічними сироватками дають позитивну реакцію на 4-ри хрести, із гетерологічними та негативною сироватками - не реагують. Специфічність сироваток підтверджено реакцією контрольного комерційного антигену - Nobilis MG antigen. Встановлено, що антигени, виготовлені з музейного штаму Mycoplasma gallisepticum S6, проявляли високу активність в розведенні 1:4 незалежно від технології виготовлення. Приклад 2 З метою вивчення антигенних властивостей були виготовлені 4 експериментальні серії антигенів з бактерійної маси музейного штаму Mycoplasma gallisepticum S6. Серії антигенів (№№ 3 1-2) являли собою інактивовану та стандартизовану до концентрації 30 млрд.м.т./см нативну клітинну масу музейного штаму Mycoplasma gallisepticum S6, та дві серії (№№ 3-4) були виготовлені з музейного штаму Mycoplasma gallisepticum S6 за багатоступеневою методикою, що включає інактивацію, стандартизацію, детергенцію ДСН та термінальний діаліз. Було перевірено їх активність та специфічність у ПРА із гомо- та гетерологічними сироватками. Встановлено, що всі антигени в ПРА (пробіркова реакція аглютинації) із гомологічними сироватками дають позитивну реакцію на рівень специфічних антитіл на рівні 3,5 log 2, із гетерологічними та негативною сироватками - не реагують. Специфічність сироваток підтверджено реакцією контрольного комерційного антигену - Nobilis MG antigen. Даний спосіб може бути використаний при серійному біофабричному виготовленні антигену для серологічної діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці або при виготовленні експериментальних серій антигену з науковою метою. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 Спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики респіраторного мікоплазмозу птиці, що включає накопичення бактеріальної маси мікоплазм, інактивацію, центрифугування, ресуспендування, який відрізняється тим, що як виробничий штам використовують штам Mycoplasma gallisepticum S6, для накопичення бактеріальної маси застосовують "Середовище рідке поживне для ізоляції та культивування мікоплазм від тварин та птиці", інактивацію проводять мертиолятом та додатково проводять детергенцію ДСН (додецилсульфат натрію). Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2