Штам бактерій bradyrhizobium japonicum для одержання бактеріального добрива під сою

Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за номером IMB В-7200, призначений для виготовлення бактеріального добрива під сою. Винахід відноситься до сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікробних засобів підвищення урожаю бобових культур і призначений для виробництва бактеріальних препаратів під сою. Відомо, що штами бульбочкових бактерій виду Bradyrhizobium japonicum є основними компонентами низки мікробних препаратів[1-3]. Відомий штам Bradyrhizobium japonicum 24108, який пропонується для виробництва біодобрив під сою, але його азотфіксувальна активність та ефективність за умов високої щільності ґрунтових популяцій ризобій сої вивчені недостатньо [4]. Відомо застосування штаму Bradyrhizobium japonicum KH10 як біоагенту препаратів під сою, але він в основному пристосований до нових ранньостиглих сортів сої [5]. Відомий конкурентоздатний, технологічний, активний штам Bradyrhizobium japonicum M-8. Однак ефективність цього штаму в основному перевіряли в південних регіонах України на зрошуваному чорноземі [6]. Найбільш близьким до запропонованого винаходу є штам-прототип Bradyrhizobium japonicum 6346, який є ефективним симбіотичним азотфіксатором і використовується як стандартний штам у наукових дослідженнях та для виробництва біо препаратів. Але цей штам поступається пропонованому штаму за здатністю підвищувати урожай надземної маси та зерна сої. В основу вина ходу поставлено завдання отримати новий високоефективний штам бульбочкових бактерій сої, який відрізнявся б широким спектром корисної дії на рослини і, як біоагент бактеріальних препаратів, забезпечував стабільно високий урожай зерна сої різних сортів. Поставлене завдання вирішується завдяки одержанню нового штаму Bradyrhi zobium japonicum, який здатний комплексно впливати на розвиток ! сої: посилювати процеси фотосинтезу та симбіотичної азотфіксації, проявляти високу захисну дію проти бактеріальних і грибних хвороб, суттєво підвищувати зернову продуктивність. Штам Bradyrhizobium japonicum виділений з бульбочок сої сорту Київська 27, яка вирощувалася на сірому лісовому середньосуглинковому ґрунті з наступними агрохімічними показниками: рН сольове грунту - 5,2-5,4; вміст гумусу - 1,8-2,1%; азоту, що легко гідролізується - 72,0-78,0мг; Р2О5 98,0-102,0мг; К2О - 126,0-136,0мг на 1кг грунту. Пропонований штам Bradyrhizobium japonicum ідентифікований за визначником Берджі [7] і йому привласнений №46. (19) UA (11) 85943 (13) C2 (21) a200707156 (22) 25.06.2007 (24) 10.03.2009 (46) 10.03.2009, Бюл.№ 5, 2009 р. (72) КОВАЛЕВСЬКА ТАМАРА МИ ХАЙЛІВНА, UA, НАДКЕРНИЧНА ОЛЕНА ВОЛОДИ МИРІВНА, UA, КРУТИЛО ДМИТРО ВАЛЕРІЙОВИЧ, UA, ГОРБАНЬ ВІРА ПЕТРІВН А, U A (73) ІНСТИТУТ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ МІКРОБІОЛОГІЇ УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК, U A (56) SU 1034358 A, 07.04.1984 SU 939547, 30.06.1982 SU 874723, 23.10.1981 3 85943 Штам депонований у Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України (м.Київ) 14 лютого 2007 року під номером 1MB В-7200. Він також зберігається в колекції корисних ґрунтови х мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН під реєстраційним номером 23. Морфолого-кудьтуральні властивості штаму. Штам Bradyrhizobium japonicum 46 добре росте при температурі 26-28°С на твердому живильному середовищі такого складу, г/л: К 2НРО4 - 0,5; КН2РО4 - 0,5; MgSO 4 - 0,2; NaCl - 0,2; CaSO4 -0,1; (NH4)2MoO 4 - сліди; манніт - 20,0; люпиновий відвар - 100,0; агар-агар - 20,0; рН 6,5 - 7,0. Стерилізація середовища 1,0атм 30хв. Культура бактерій повільноросла (на твердому середовищі колонії з'я вляються на 5-7 добу), неспороутворююча. Клітини мають форму злегка зігнутих паличок, грамнегативні. Розмір клітин 810-добової культури на бобовому (люпиновому) твердому середовищі 0,6x2,5-3,0мкм. Палички у віці 1-3х діб р ухливі, монотрихи. Штри х на люпиновому агарі слизистий, білуватий, опуклий. На 810 добу росту колонії на люпиновому агарі округлої форми, непрозорі, білуваті, блискучі, діаметр колоній не більше 1,0-1,5мм. Оптимальна температура росту - 28°С, рН = 6,5-7,0. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Аероб. Молоко з лакмусом не пептонізує, підвищує рН середовища до лужного. Желатину не розріджує. Відношення до джерел вуглецю. Штам добре росте на середовищах з глюкозою, галактозою, арабінозою та маннітом, помірно використовує рамнозу, мальтозу і сахарозу, дуже слабо - ксилозу. Не засвоює дульцит, сорбіт та рафінозу. Відношення до джерел азоту. Штам добре росте на середовищах з амонійними солями, азотнокислим калієм, гліцином та тирозином. Переважно використовує відновлені форми азоту. На м'ясопептонному агарі та м'ясо-пептонному бульйоні не росте. Штам резистентний до більшості досліджених антибіотиків (норфлоксацину, еритроміцину, тетрацикліну, лінкоміцину, поліміксину, ципрофлоксацину, олеандоміцину, левоміцетину, бензилпеніциліну, оксациліну), але чутливий до канаміцину та цефотаксиму. Ознаки штаму стійкі. Штам патогенних властивостей не має (належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи теплокровних тварин). Штам пересівається один раз в 6 місяців і зберігається в лабораторних умовах на твердому бобовому (люпиновому) середовищі при 4-5°С. Ефективність штаму Bradyrhizobium japonicum 46 перевіряли у вегетаційному та польових дослідах. Приклади конкретного застосування штаму. Прикладі. У вегетаційному досліді вивчали вплив бактеризації насіння сої сорту Устя на симбіотичні показники, інтенсивність фотосинтезу (вміст фотосинтетичних пігментів в біомасі листя) та вміст сухої речовини в надземній масі рослин (табл.1). 4 Наведені в таблиці 1 дані свідчать, що новий штам Bradyrhizobium japonicum 46 за впливом на показники активності симбіозу переважає штампрототип. Інокуляція насіння сої запропонованим штамом активізує процеси фіксації молекулярного азоту та синтезу хлорофілу. У варіанті з бактеризацією новим штамом нітрогеназна активність бульбочок в 2,1 рази вища ніж у варіанті із стандартним штамом Bradyrhizobium japonicum 6346. Вміст хлорофілів а та b в біомасі листя зростає відповідно в 2,8 і 4,4 рази порівняно до контролю та на 8,2% і 7,4% порівняно до штаму-прототипу. Приклад 2. Польовий дослід було проведено в 2006 році на дерново-підзолистому супіщаному ґрунті на фоні численної популяції бульбочкових бактерій сої. В досліді використовували сою сорту Устя. Як видно з даних таблиці 2, новий штам Bradyrhizobium japonicum 46 активно фіксує азот з повітря і достовірно на 15,1% збільшує урожай зерна сої порівняно до існуючого виробничого штаму-прототипу 6346. Приклад 3. Здатність штаму Brad yrhizobium japonicum 46 підвищувати стійкість сої до бактеріозів (пустульна і кутаста плямистість) та пероноспорозу досліджували у польовому досліді в ґрунтово-кліматичних умовах північного Лісостепу України. Тип ґрунту - темно-сірий опідзолений. Сорт сої - Устя. Результати досліду наведені в таблиці 3. Отримані дані свідчать, що штам Bradyrhizobium japonicum 46 проявляє високу захисну дію проти зазначених хвороб сої. За інокуляції насіння сої штамом Bradyrhizobium japonicum 46 відсутня ураженість рослин пероноспорозом, тоді як в контрольному варіанті кількість хворих рослин становить 14,7%, а ступінь розвитку хвороби досягає 7,1%. Штам значно стримує розвиток бактеріозів сої, ефективність дії його становить 72,3%, що майже у два рази перевищує біологічну ефективність фундазолу - 36,2%. Штам сприяє підвищенню урожайності сої на 26,7% у порівнянні з контролем (без інокуляції насіння) та на 8,3% у порівнянні з фундазолом. Приклад 4. Ефективність запропонованого штаму 46 як біоагенту торф'яного препарату перевіряли у виробничому досліді в ґрунтовокліматичних умовах центрального Лісостепу України. Тип ґрунту - сірий лісовий середньосуглинковий. В ґрунті існ ує місцева популяція ризобій сої з високою щільністю. Сорт сої - Артеміда. Результати досліду наведені в таблиці 4. Штам Bradyrhizobium japonicum 46 ефективний за наявності в ґрунті численної місцевої популяції ризобій сої, що свідчи ть про його конкурентноздатність. В цих умовах інокуляція новим штамом сприяла збільшенню врожайності сої на 0,46т/га порівняно до виробничого штаму Bradyrhizobium japonicum 6346. Таким чином, штам Bradyrhizobium japonicum 46 є активним симбіотичним азотфіксатором, спроможним колонізувати кореневу систему сої за умов наявності в ґрунті різних за щільністю популяцій бульбочкових бактерій сої. Він здатний інтенсифікувати процес хлоропластогенезу, підвищу 5 85943 вати стійкість рослин до бактеріальних та грибних хвороб і відрізняється більш високою ефективністю у порівнянні з існуючим виробничим штамомпрототипом. Штам Bradyrhizobium japonicum 46 забезпечує підвищення урожайності зерна сої на 6 15,1-29,3% порівняно до штаму-прототипу Bradyrhizobium japonicum 6346 і за сукупністю господарчо-цінних ознак може бути використаний як біоагент мікробних препаратів під сою. Таблиця 1 Маса бульбочок, Нітрогеназна акти- Вміст хлорофілів в біовність, мкг масі листя, мг/100г г/рослину N/рослину/год а b Контроль (без інокуляції) 0 0 85,76 21,88 Штам-прототип Bradyrhizobium japonicum 0,51 17,09 225,37 89,52 6346 Новий штам 0,56 35,49 243,92 96,16 Bradyrhizobium japonicum 46 НІР05 0,04 4,30 4,23 8,57 Суха надземна маса, г/рослину Варіанти досліду 0,99 1,51 1,53 0,01 Таблиця 2 Нітрогеназна активність, мкг N/рослину/год. 9,11 Варіант досліду Контроль (без інокуляції) Штам-прототип Bradyrhizobium japonicum 6346 Новий штам Bradyrhizobium japonicum 46 НІР05 Урожай зерна, Прибавка до контрот/га лю, % 3,03 100 25,72 3,17 104,62 29,97 5,28 3,65 0,22 120,46 Таблиця 3 Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Контроль (обробка фундазолом) Новий штам Bradyrhizobium japonicum 46 НІР05 1 16,0 Ураженість хворобами, % бактеріозами пероноспорозом 2 3 1 2 3 4,7 14,7 7,1 Урожайність, т/га 1,95 15,0 3,0 36,2 10,0 5,0 29,6 2,28 4,0 1,3 72,3 0 0 100,0 2,47 0,05 Примітки: 1. поширення хвороби; 2. розвиток хвороби; 3. гальмування розвитку хвороби (ефективність дії), % Таблиця 4 Варіантдосліду Штам-прототип Bradyrhizobium japonicum 6346 Новий штам Bradyrhizobium japonicum 46 Література: 1. Доросинский Л.М. Бактериальные удобрения - дополнительное средство повышения урожая. - М.: Россельхозиздат, 1965. - 315с. 2. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. -М.: Наука, 1973. - 288с. Урожай зерна, т/га Приріст до штаму-прототипу, т/га 1,57 2,03 0,46 3. Бабич А.О. Сучасне виробництво і використання сої. - Київ: Урожай, 1993. - 432с 4. Пат. 3324 С1 Україна, МПК С 05 F 11/08, C°12°N 1/20. Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum для одержання добрив під сою / Скочинська Н.М., Антипчук А.Ф., Рангелова В.М., Канцелярук P.M., Танцюренко О.В., Заявл. 31.07.90; Опубл. 27.12.94., Бюл. №1-6. - 3с 7 85943 5. Пат. 69993 А Україна, МПК С 05 F 11/08, С 12 N1/20. Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum для одержання бактеріального добрива під сою/ Крутило Д.В., Ковалевська Т.М., Заявл. 22.12.03; Опубл. 15.09.04, Бюл. №9. - 3с 6. Пат. 39545 А Україна, МПК С 05 F 11/08, С 12 N1/20. Штам бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum M-8 Kircyner, який вико Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 8 ристовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує урожайність сої/ Толкачов М.З., Патика В.П., Каменева І.О.. Грітчіна Л.Ю., Заявл. 06.10.2000; Опубл. 1.6.06.01, Бюл. №5. - 5с. 7. Определитель бактерий Берджи: В 2т.: Пер. с англ./ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. - М.: Мир, 1997.- Т.1. - 432с. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601