Спосіб отримання моношару культивованих клітин рогівки на внутрішній поверхні м’яких контактних лінз

Реферат: Спосіб отримання моношару культивованих клітин рогівки на внутрішній поверхні м'яких контактних лінз, який включає ферментативне виділення первинної культури, визначення клітин рогівки, причому лімбальні клітини виділяють з зон палісадів Фогта, визначають в їх складі стовбурові клітини, культивування яких здійснюють на внутрішній поверхні силікон-гідрогелевих м'яких контактних лінзах з високою кисневою проникністю. UA 86892 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ МОНОШАРУ КУЛЬТИВОВАНИХ КЛІТИН РОГІВКИ НА ВНУТРІШНІЙ ПОВЕРХНІ М'ЯКИХ КОНТАКТНИХ ЛІНЗ UA 86892 U UA 86892 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до клітинної терапії, і може бути використана для отримання моношару культивованих клітин рогівки на внутрішній поверхні силікон-гідрогелевих м'яких контактних лінз. Є відомий спосіб отримання моношару культивованих клітин, який включає ферментативне виділення фетальних фібробластів, які наносять на внутрішню поверхню м'якої контактної лінзи у вигляді моношару. Як джерело первинної культури фібробластів використана тканина шкіри людини [1]. Недоліком цього способу є використання фетальних клітин, які на відміну від стовбурових не здатні замістити втрачені клітини в організмі хворого або секретувати біологічно активні речовини, які допомагають скорегувати порушені захворюванням функції. Найближчим аналогом є відомий спосіб отримання моношару культивованих клітин, визначення в їх складі клітин рогівки, у якому здійснюють культивування первинної культури епітеліальних, стромальних та ендотеліальних клітин рогівки 20 тижневого ембріона у вигляді моношару на внутрішній поверхні м'яких контактних лінз [2], прототип. Недоліком цього способу є використання гетерогенної клітинної культури рогівки, у складі якої не містяться стовбурові клітини рогівки, що знижує термін використання лінзи і довговічність рогівки. У основу корисної моделі покладено задачу удосконалення відомого способу шляхом використання таких операцій і в такій послідовності, які створюють оптимальні умови для зберігання максимальних властивостей лімбальних стовбурових клітин рогівки, їх проліферації та диференціювання, для забезпечення довговічності рогівки і терміну використання лінзи. Поставлена задача вирішується тим, що у способі отримання моношару культивованих клітин рогівки, який включає ферментативне виділення первинної культури, визначення клітин рогівки, відповідно до корисної моделі, лімбальні клітини виділяють з зон палісадів Фогта, визначають в їх складі стовбурові лімбальні клітини, культивування яких здійснюють на внутрішній поверхні силікон-гідрогелевих м'яких контактних лінзах із високою кисневою проникністю. Наслідком використання первинної культури лімбальних клітин, у складі якої містяться стовбурові, при культивування лімбальних клітин рогівки на внутрішній поверхні м'яких контактних лінз є отримання необхідної кількості клітинного матеріалу, з високим проліферативним потенціалом, який має високу спроможність до міграції, адгезії, формування стимулюючої дії стовбурових клітин, що містять велику кількість ростових факторів і цитокінів. Спосіб застосовують таким чином: для культивування використовують силікон-гідрогелеві м'які контактні лінзи з високою кисневою проникністю Air Optix Night & Day (CUBA Vision). Необхідну кількість лінз промивають у фосфатно-буферному розчині, поміщають в 24-лункове плато, заповнюючи живильним середовищем по краю лінзи. Внутрішню поверхню лінзи не занурюють у рідину. Для культивування використовують первинну культуру лімбальних стовбурових клітин, попередньо протестовану до збудників інфекцій. На внутрішню поверхню лінзи поміщають суспензію в кількості 300 тис. клітин в 400 мкл живильного середовища, залишають на 40 хвилин для досягнення адгезії. Клітини мимовільно розташовуються на поверхні лінзи у вигляді моношару. Потім додають 500 мкл живильного середовища DMEM/F12 1:1 ("Sigma", США), що містить 10 % ETC, L-глутамін ("Sigma", США), пеніцилін 100 од / мл ("Дарниця", Україна), стрептоміцин 100 од / мл ("Дарниця", Україна), епідермальний і фактор росту фібробластів 10 нг / мл ("Sigma", США), інсулін 5 мкг / мл ("Sigma", США), трансферин 5 мкг / мл ("Sigma", США), ізопротерінол 5 мкг / мл ("Sigma", США), гідрокортизон 5 мкг / мл ("Sigma", США). Культивування здійснювали у СО 2-інкубаторі з температурою повітря 37 °C, 5 % вмістом СО2 та 95 % вологістю. Зміну середовища проводили кожні 72 години в перебігу 10-12 днів культивування. Протягом цього періоду спостерігали за зміною активності проліферації клітин, їх морфологією. Візуалізацію здійснювали за допомогою інвертовного світлового мікроскопа Leika PMIL, робочої станції з обробкою зображення LEIKA QWIN 500 Standart, відеокамери JVC-3 1380, світлового мікроскопа Olympus AX 50 і відеокамерою Olympus DR 70. Після досягнення конфлуентного лімбального моношару на поверхні лінзи, проводили фарбування на гемотоксилін і еозин, забарвлення за Романовським і імуногістохімію на специфічні маркери (Р63, цитокератин 19, цитокератин 3/12). Саме це кількість клітин необхідна для створення на поверхні м'якої контактної лінзи моношару протягом двох тижнів, з міцними міжклітинними взаємозв'язками і зв'язком з поверхнею лінзи. Джерела інформації: 1. Ченцова Є.В., Сухих Г.Т., Фоміна І.О. Патент Росії №2189206 A61F9/00-20.09.2002. Спосіб лікування дефектів рогівки. 2. Ченцова Є.В., Гундорова Р.А., Макаров П.В., Васильєв А.В., 1 UA 86892 U Терських В.В., та ін. Клінічний досвід алотрансплантації фетальних клітин рогівки в офтальмології // VII З'їзд офтальмологів Росії, 2001. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб отримання моношару культивованих клітин рогівки на внутрішній поверхні м'яких контактних лінз, який включає ферментативне виділення первинної культури, визначення клітин рогівки, який відрізняється тим, що лімбальні клітини виділяють з зон палісадів Фогта, визначають в їх складі стовбурові клітини, культивування яких здійснюють на внутрішній поверхні силікон-гідрогелевих м'яких контактних лінзах з високою кисневою проникністю. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2