Спосіб ідентифікації статі у райдужної форелі (onchorhynchus mykiss)

Реферат: Спосіб ідентифікації статі у райдужної форелі (Onchorhynchus mykiss) передбачає відбір біологічного матеріалу з подальшою його обробкою та дослідженням. Як біологічний матеріал використовують будь-яку тканину райдужної форелі, з якого здійснюють екстракцію загальної ДНК та ампліфікують фрагмент послідовності статевого ДНК-маркера використовуючи специфічні олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю: правий праймер 5'CGATTAGAAAGGCCTGTTCG-3' та лівий праймер 5'-GTTCATATGCCAGGCCAACT-3', причому оцінку результатів реакції проводять методом гель-електрофорезу в 2 % агарозі. UA 86900 U (54) СПОСІБ ІДЕНТИФІКАЦІЇ СТАТІ У РАЙДУЖНОЇ ФОРЕЛІ (ONCHORHYNCHUS MYKISS) UA 86900 U UA 86900 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біології та рибництва, а саме до способу ідентифікацій статі у райдужної форелі і може бути використана в діагностиці статі у мальків райдужної форелі з метою контролю кількісного статевого співвідношення популяції або культивування одностатевого стада. Відомий спосіб ідентифікації статі у райдужної форелі на ранніх етапах онтогенезу методом гістологічних зрізів гонад, при якому проводиться розтин черевної порожнини риби, фіксування зразків в парафіні, приготування зрізів на мікротомі, фарбування та мікроскопіювання [Вопросы рыбного хозяйства Беларуси, 2008, Вып. 24, с. 143-150.]. Недоліком вищевказаного способу є довга тривалість постановки методу та загибель досліджуваної риби. Як найближчий аналог вибрано спосіб ідентифікації статі у райдужної форелі методом флуоресцентної гібридизації in situ (FISH-метод) [Aquaculture, 2005, Vol. 247, p. 35-43.]. Недоліком даного способу є відсутність високоспецифічних олігонуклеотидних праймерів до статевих ДНК-маркерів, що унеможливлює швидку ідентифікацію методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та передбачає роботу з обмеженою кількістю біологічного матеріалу. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу ідентифікації статі у райдужної форелі (Onchorhynchus mykiss), який би забезпечив швидку прижиттєву ідентифікацію статі. Позитивних результатів досягають шляхом ПЛР з використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів, що дає можливість проводити високочутливу ідентифікацію статі у райдужної форелі на ранніх етапах онтогенезу. Спосіб здійснюється наступним чином. Як об'єкт використовують будь-який біологічний матеріал райдужної форелі, з якого здійснюють екстракцію загальної ДНК та ампліфікують фрагмент послідовності статевого ДНК-маркера використовуючи специфічні олігонуклеотидні праймери. Оцінку результатів реакції проводять методом гель-електрофорезу в агарозі. На основі даних про нуклеотидну послідовність Y-хромосоми самців райдужної форелі обирають специфічну ділянку ДНК, яка неідентична відповідній послідовності Х-хромосомі самок. Потім синтезують комплементарні до цієї ділянки ДНК олігонуклеотиди і досліджують їх праймерну активність в полімеразній ланцюговій реакції. З біологічного матеріалу райдужної форелі здійснюють екстракцію загальної ДНК. В мікропробірку для ПЛР додають стандартні компоненти реакції, виділену ДНК та підібрані олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю: правий праймер 5'-CGATTAGAAAGGCCTGTTCG-3' та лівий праймер 5'GTTCATATGCCAGGCCAACT-3'. Під час реакції праймери комплементарно приєднуються до послідовності ДНК статевого ДНК-маркера, який знаходиться в Y-хромосомі самців, де і відбувається ампліфікація специфічного фрагменту. Оцінку результатів реакції проводять методом гель-електрофорезу в 2 % агарозі. З цією метою після реакції вміст мікропробірки змішують з барвником та переносять в лунки агарозного гелю. По закінченні електрофорезу гель фарбують бромистим етидієм 2-3 хвилини та спостерігають результати під ультрафіолетовим трансілюмінатором. Наявність специфічного фрагмента статевого ДНКмаркера та його розмір оцінюють в присутності маркера визначеної довжини. Висока точність та швидкість методу дозволяє ідентифікувати самців серед мальків райдужної форелі, поступово збільшуючи в ході реакції кількість специфічних фрагментів статевого ДНК-маркера. Специфічні фрагменти характерні лише самцям. В зразках, де ці фрагменти відсутні, автоматично ідентифікуються самки райдужної форелі. Приклад. Для досліджень використовували плавники самців та самок райдужної форелі. В стандартні мікропробірки для ПЛР вносили 12,5 мкл реакційної суміші, 2 мкл специфічних олігонуклеотидів, 1 мкл екстрагованої ДНК та доводили суміш до загального об'єму 25 мкл стерильною деіонізованою водою. Ці пробірки поміщали в термоциклер та проводили реакцію ампліфікації. Параметри реакції включали попередній цикл денатурації ДНК при 94 °C 3 хвилин з наступними 30 циклами ампліфікації при температурі денатурацію ДНК 94 °C 30 секунд, віджигу специфічних праймерів при 60 °C 30 секунд та синтезу фрагментів ДНК при 72 °C 1 хвилин. Оцінку результатів реакції проводили методом гель-електрофорезу в 2 % агарозі. Як показали результати проведених досліджень, застосування підібраних специфічних олігонуклеотидних праймерів дозволяє проводити ідентифікацію статі райдужної форелі методом ПЛР. Розмір ампліконів, як і передбачалось, становив близько 800 пар нуклеотидів. Отже, заявлений нами спосіб дозволяє проводити високочутливу ідентифікацію статі у райдужної форелі на ранніх етапах онтогенезу, коли зовнішні статеві ознаки ще відсутні, при цьому досліджувана риба зазнає мінімальної шкоди та залишається живою. 1 UA 86900 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб ідентифікації статі у райдужної форелі (Onchorhynchus mykiss), що передбачає відбір біологічного матеріалу з подальшою його обробкою та дослідженням, який відрізняється тим, що як біологічний матеріал використовують будь-яку тканину райдужної форелі, з якого здійснюють екстракцію загальної ДНК та ампліфікують фрагмент послідовності статевого ДНКмаркера використовуючи специфічні олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю: правий праймер 5'-CGATTAGAAAGGCCTGTTCG-3' та лівий праймер 5'GTTCATATGCCAGGCCAACT-3', причому оцінку результатів реакції проводять методом гельелектрофорезу в 2 % агарозі. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2