Спосіб отримання культивованих лімбальних стовбурових клітин та клітин плоского епітелію рогівки на амніотичній оболонці

Реферат: Спосіб отримання культивованих лімбальних стовбурових клітин та клітин плоского епітелію на амніотичній оболонці, який включає культивування клітин на амніотичній оболонці, первинне виділення лімбальних клітин з зон палісадів Фогта, визначення в їх складі стовбурових клітин, первинне виділення клітин плоского епітелію рогівки, причому здійснюють пошарове культивування лімбальних стовбурових клітин та клітин плоского епітелію на стромальній стороні замороженої амніотичної оболонки у поживному середовищі. UA 87174 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ КУЛЬТИВОВАНИХ ЛІМБАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН ТА КЛІТИН ПЛОСКОГО ЕПІТЕЛІЮ РОГІВКИ НА АМНІОТИЧНІЙ ОБОЛОНЦІ UA 87174 U UA 87174 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до клітинної терапії, і може бути використана для отримання культивованих лімбальних стовбурових клітин та клітин плоского епітелію рогівки на амніотичній оболонці. Існують різні методи отримання культивованих лімбальних стовбурових клітин, епітеліальних клітин та заготовлення амніотичної оболонки. Koizumi N. (2001), який пропонує з метою отримання культивованих лімбальних клітин, використовуючи свіжу амніотичну оболонку як носій культивованих стовбурових клітин рогівки [1]. Недоліком цього методу є те, що свіжа амніотична оболонка, на відміну від інших способів заготовлення, містить живі клітини, які не потрібні для культивування лімбальних стовбурових клітин, які надалі погіршують властивості трансплантату. Є відомий спосіб культивування лімбальних стовбурових клітин, вибраний як прототип, при якому отримують один моношар, використовуючи заморожену амніотичну оболонку як носій культивованих лімбальних стовбурових клітин рогівки [2]. Однак одержана відомим способом рогівка людини недостатньо довговічна, через те, що культивують тільки один моношар. У основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення відомого способу шляхом використання таких операцій, які створюють оптимальні умови для зберігання максимальних властивостей клітин рогівки, їх проліферації та диференціювання, для забезпечення довговічності рогівки. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який включає використання амніотичної оболонки, первинне виділення лімбальних клітин з зон палісадів Фогта, визначення в їх складі стовбурових, первинне виділення клітин плоского епітелію рогівки, відповідно до корисної моделі, здійснюють пошарове культивування лімбальних стовбурових клітин та клітин плоского епітелію рогівки на стромальну сторону замороженої амніотичної оболонки у поживному середовищі. Наслідком використання замороженої амніотичної оболонки, позбавленої клітинного складу, є усунення ризику виникнення клітин, які не потрібні для культивування лімбальних стовбурових та клітин плоского епітелію, котрі надалі погіршують властивості трансплантату. Наслідком пошарового культивування лімбальних стовбурвих та клітин плоского епітелію на замороженій амніотичній оболонці, позбавленій клітинного складу, є формування оптимальних умов для зберігання максимальних властивостей стовбурових клітин, їх проліферації та диференціювання, що дозволяє підвищити довговічність. Спосіб застосовують таким чином: заморожену амніотичну оболонку витримують в антимікробному середовищі, промивають декілька разів фосфатно-буферним розчином, розрізають амніон на шматочки 5  5 см та вкладають у кріопробірки, заморожують за допомогою кріоконсерванту у рідкому азоті. Первинні культури лімбальних стовбурових та клітин плоского епітелію отримують з рогівки. За допомогою фазово-контрастної мікроскопії в процесі культивування були виділені дві субпопуляції клітин рогівки: лімбальна стовбурова та клітин плоского епітелію рогівки. Клітинні культури були протестовані на контамінацію до збудників інфекцій. Ідентифікація двох субпопуляцій підтверджували імуногістохімічними фарбуваннями на специфічні маркери (Р63-маркер недиференційованих стовбурових клітин, цитокератин 19, цитокератин 3/12-маркер диференційованих стовбурових клітин, віментин, -SMA, кератин сульфат). Для культивування амніотичну оболонку розморожували до кімнатної температури, тричі промивали у фосфатнобуферному розчині, після цього ретельно розправляли на стерильній фользі і розрізали на 2 невеликі шматочки розміром 11 см . У 4-лункове плато (μ-Slide 8 well, IBIDI, Gmbh) поміщали зразки стромальною стороною догори. Розміщали на поверхні оболонки по 10 тис. лімбальних стовбурових клітин в 200 мкл живильного середовища DMEM/F12 1:1 ("Sigma", США), що містить 10 % ETC, L-глутамін ("Sigma", США), пеніцилін 100 од / мл ("Дарниця", Україна), стрептоміцин 100 од / мл ("Дарниця", Україна), епідермальний і фактор росту фібробластів 10 нг / мл ("Sigma", США), інсулін 5 мкг / мл ("Sigma", США), трансферин 5 мкг / мл ("Sigma", США), ізопротерінол 5 мкг / мл ("Sigma", США), гідрокортизон 5 мкг / мл ("Sigma", США). Культивування здійснювали у СО2-інкубаторі з температурою повітря 37 °C, 5 % вмістом СО2 та 95 % вологістю. Зміну середовищ проводили кожні 48 годин протягом 5-7 діб. Протягом цього періоду спостерігали за зміною активності проліфірації клітин, їх морфологією. Після досягнення конфлуентного лімбального моношару на поверхні оболонки розміщували 10 тис. клітин плоского епітелію у 200 мкл живильного середовища і культивували протягом 5-7 днів. Візуалізацію клітинних ліній на амніоні здійснювали за допомогою інвертованого світлового мікроскопа Leika PMIL, робочої станції з обробкою зображення LEIKA QWIN 500 Standart, відеокамери JVC-3 1380, світлового мікроскопа Olympus AX 50 і відеокамерою Olympus DR 70. 1 UA 87174 U 5 10 Менша кількість клітин призводить до уповільнення процесу формування міжклітинних взаємозв'язків та проростання клітин на поверхні носія. Пошарове культивування здійснювали протягом двох тижнів, що дозволяє клітинам створити на поверхні субстрату моношари, міцні міжклітинні взаємозв'язки та зв'язок з носієм. Для оцінки морфологічної структури амніотичної оболонки і пошарово культивованих клітин рогівки використовували імуногістохімію з фарбуванням специфічних маркерів. Джерела інформації: 1. Koizumi N., Inatomi Т., Suzuki Т. Cultivated epithetial stem cell transplantation in ocular surface disorders // Ophthalmology. - 2001. -Vol. 108 (9).-P. 1569-1574. 2. Гринь В.К., Попандопуло А.Г., Кавеліна Г.С., Пасєчникова Н.В., Віт В.В., Дрожжина Г.І., Іванова О.М., Патент України №65506 A61F 9/00-12.12.2011, Бюл. №23, 2011 Способ отримання трансплантата лімбальних клітин на амніотичній оболонці, прототип. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб отримання культивованих лімбальних стовбурових клітин та клітин плоского епітелію на амніотичній оболонці, який включає культивування клітин на амніотичній оболонці, первинне виділення лімбальних клітин з зон палісадів Фогта, визначення в їх складі стовбурових клітин, первинне виділення клітин плоского епітелію рогівки, який відрізняється тим, що здійснюють пошарове культивування лімбальних стовбурових клітин та клітин плоского епітелію на стромальній стороні замороженої амніотичної оболонки у поживному середовищі. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2