Спосіб лікування ран шкіри при цукровому діабеті і типу

Реферат: Спосіб лікування ран шкіри при цукровому діабеті І типу, при якому використовують трансгенний IGF-1, вбудований в промотор кератиноцитів K14/mIGF-1 лінії мишей FVB. UA 92620 U (54) СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РАН ШКІРИ ПРИ ЦУКРОВОМУ ДІАБЕТІ І ТИПУ UA 92620 U UA 92620 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, зокрема до імунології та ендокринології. Цукровий діабет (ЦД) негативно впливає на процеси загоєння ран, в тому числі на гемостаз, запалення та ангіогенез. Ці порушення присутні в найрізноманітніших тканинах, в тому числі шкірі, міокарді, скелетних м'язах та нервах. При пошкодженнях шкіри у хворих на цукровий діабет було показано зміни кровообігу, порушення антимікробної активності нейтрофілів і дисфункціональний стан запалення, пов'язаний з аномальною дією хемокінів. Загоєння ран, реепітелізація, уповільнена у хворих на цукровий діабет. Цікавим об'єктом для дослідження є інсуліноподібний фактор росту першого типу, IGF-1. Так зниження рівня IGF-1 при цукровому діабеті негативно впливає на загоєння ран шкіри діабетичних осіб при старінні. Для IGF-1, як лікувального засобу, також був продемонстрований ефект прискорення загоєння ран шкіри шляхом стимуляції впливу фібробластів на синтез колагену на додачу до свого мітогенного впливу на кератиноцити і фібробласти. На молекулярному рівні підвищення рівня mIGF-1 може значно скоротити активність прозапальних цитокінів, таких як фактор некрозу пухлин альфа, TNFα, та інтерлейкіну 1 бета, IL-1β, і скоригувати вплив СС-хемокіна, який бере участь у привабленні моноцитів/макрофагів. Основними етапами місцевого лікування діабетичної виразки є обробка виразки після оцінки її характеру, промивання рідкими розчинами, антисептиком і/або фізіологічним розчином, накладення власне пов'язки з лікувальним засобом або ранового покриття. На різних фазах перебігу ранового дефекту застосовуються різні підходи і засоби місцевого лікування. Головним чинником вдалого лікування є вибір препарату для лікування. Відомий спосіб генної терапії захворювань, що потребують стимуляції регенеративних процесів, включаючи пошкодження тканин різної етіології на основі синтетичного модифікованого гена IGF-1, інсуліноподібного фактора росту першого типу, шляхом введення вектора з плазмідної ДНК, що містить модифікований ген IGF-1. "Фармацевтическая композиция для генной терапии заболеваний, требующих стимуляции регенераторных процессов, включая повреждения тканей человека различной этиологии, на основе синтетического модифицированного гена инсулиноподобного фактора роста человека первого типа (ифр-1, igf1)" - заявка РФ № 2007124538/15. Недолік способу полягає в затратному і складному методі отримання плазмідного вектора, синтетичного аналога гена IGF-1, складному контролі активності введеного гена, що призводить до значного підвищення вартості лікування. Найближчим прототипом заявленого способу є застосування комбінації TGFP та IGF-1 для загоєння ран, "Wound healing composition of IGF-I and TGF-β", патент США № 4983581 А. На рани експериментальних тварин наносили композитний гель з вмістом фракцій очищених білків IGF-I та TGF-β. Суттєвим недоліком методу є його затратність на отримання чистих фракцій білків IGF-1 та TGF-β. В основу запропонованої моделі поставлена задача створення способу лікування ран шкіри при ЦД І типу за рахунок використання трансгенного IGF-1, вбудованого в промотор кератиноцитів K14/mIGF-1 лінії мишей FVB. Спосіб здійснюється наступним чином. Експериментальних тварин, мишей, розподілено на 4 групи: дика лінія FVB-1; трансгенні K14m/IGF1 миші - 2; дикі миші з діабетом - 3; трансгенні K14m/IGF1 миші з діабетом - 4. У тварин 3 та 4 групи моделюють експериментальний ЦД І типу шляхом введення стрептозотоцину. Тваринам внутрішньобрюшинно вводять стрептозотоцин, Sigma, 50 мг/кг, протягом 5 днів поспіль. Для експерименту беруть тварин з рівнем глюкози > 15 ммоль/л. На спинній ділянці тварин хутро видаляють голінням, шкіру промивають 70 % етанолом і наносять чотири рани на всю товщину шкіри, 5 мм в діаметрі. На період загоєння тварин розміщують індивідуально. На 5 та 8 день після травми, під кетаміновим наркозом, у дослідних тварин вирізають рану та 3 мм оточуючої шкіри. Рани розрізають навпіл, у напрямку росту хутра. Одна половина зразку обробляють для морфологічного дослідження. Іншу заморожують і зберігають при -80 °C до виділення РНК. Зовнішню частину рани та гранульомну тканину зберігають і обробляють окремо. Зразки шкіри/рани переводять в парафін для отримання зрізів товщиною 7 мкм. Потім за допомогою ксилолу регідратують в етанол. Зрізи аналізують після фарбування по Масону, трикольорове забарвлення, Sigma-Aldrich. Для проведення імуногістохімії, зрізи інкубують в 3 % Н2О2 з метою інактивації ендогенних пероксидів. Потім інкубують з первинними антитілами: а маркер клітинної проліферації Ki67 кролячий IgG1K клон В56, BD Biosciences; b - маркер проліферації клітин для ендотеліальних клітин кроля CD31, Abeam; с - маркер для гранулоцитів Gr1 щурячий IgG2b/K, BD Biosciences; d - маркер для макрофагів CD11b/Mac1 щурячий DA IgG2b/K, BD Biosciences. Вторинні антитіла: козячі анти-кролячі-HRP та козячі анти-щурячі-HRP, Vector Laboratories. Для забарвлення зрізи інкубують з субстратом пероксидази DAB. Вивчення 1 UA 92620 U 5 10 15 20 25 30 зрізів проводять за допомогою світлового мікроскопа, Leica DC500. Зображення отримують і обробляють за допомогою програмного забезпечення Abode Photoshop. Для кількісного морфометричного аналізу площі, товщини регенеруючого епітелію, потовщеної ділянки шкіри; довжини регенеруючого епітелію; довжини відкритої рани; загальної довжини рани - суми довжини регенеруючого епітелію і відкритої рани - використовують програмне забезпечення "Image J". Проводять дослідження рівня експресії РНК гена IGF-1. Виділення РНК проводять згідно з інструкцією набору "Рибо-золь", АмпліСенс, РФ. Обробку ДНКазою проводять відповідно до інструкції виробника, Thermo Scientific, EU. Зворотну транскрипцію та отримання кДНК проводять згідно з інструкцією набору "Реверта-L", АмпліСенс, РФ. Ампліфікаційну суміш готують з використанням реактивів фірми "Thermo Scientific", EU. Кінцевий об'єм суміші для ампліфікації в кожному зразку складає 25 мкл. Склад ампліфікаційної суміші: по 0,5 мкл, 1 мкг/мкл, R та F праймерів відповідного гена; 2 мкл dNTP, 2 мМ; 7 мкл DEPC-обробленої води; 10 мкл розчину досліджуваної кДНК; 5 мкл буферу для ПЛР, 2,5 мМ MgCl2; 0,2 Од Taq-полімерази. Ампліфікацію проводять на термоциклері Corbett Research, Австралія. Встановлено, експресія гена IGF-1 в пошкодженій шкірі значно збільшується порівняно з неушкодженою тканиною на 5-й і 8-й дні у мишей з діабетом. У групі трансгенних тварин з діабетом це збільшення було тільки як тенденція, але рівні мРНК IGF-1 в шкірі тварин цієї групи були значно вищими порівняно з диким типом. На 5-й день в гранульомній тканині тварин 3 та 4 груп рівень експресії IGF-1 був вищим, на 8-й день підвищений рівень мРНК зберігався лише в групі трансгенних мишей. Таким чином, максимальний ефект від трансгенного IGF-1 може зберігатися протягом всього періоду загоєння. Паралельно спостерігалося збільшення кількості моноцитів/макрофагів, Мас-1+, і гранулоцитів, Gr-1+, в гранульомній тканині диких тварин з діабетом на 8-й день після травми та тенденція до зменшення їх кількості (не значної) у трансгенних мишей з діабетом. Значно більше їх число потрапляло в рану у тварин дикого типу з діабетом шляхом інтенсивної інфільтрації через стінки капілярів. Що більша кількість моноцитів/макрофагів та гранулоцитів в рані тварин з діабетом, свідчить на користь посилення запальних процесів. Отримані результати свідчать про те, що трансгенні K14m/IGF1 миші з діабетом характеризуються значним збільшенням експресії IGF-1 в гранульомній тканині на 8-й день після травми порівняно з мишами дикого типу. Цей період характеризується значним збільшенням площі та товщини регенеруючого епітелію Загоєння ран у мишей зі стрептозотоцин-індукованим діабетом супроводжується збільшенням Мас-1+ клітин у рані, що підтверджує лікування ран шкіри при ЦД І типу. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Спосіб лікування ран шкіри при цукровому діабеті І типу, який відрізняється тим, що використовують трансгенний IGF-1, вбудований в промотор кератиноцитів K14/mIGF-1 лінії мишей FVB. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2