Штам малассезій malassezia sympodialis 97

Штам маласссезій Malassezia sympodialis 97, депонований в Музеї патогенних для людини мікроорганізмів ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб" АМН України під реєстраційним номером МПМ №27-Д, що використовується для діагностики атопічного дерматиту. UA (21) a200811427 (22) 22.09.2008 (24) 25.03.2011 (46) 25.03.2011, Бюл.№ 6, 2011 р. (72) МАВРОВ ІВАН ІВАНОВИЧ, БІЛОЗОРОВ ОЛЕКСІЙ ПАВЛОВИЧ, ВАСИЛЬЧЕНКО ВАЛЕРІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, БЕЗРУЧЕНКО ІЗАІТА АНТОНІВНА, ЧАСТІЙ ТЕТЯНА ВОЛОДИМИРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ДЕРМАТОЛОГІЇ ТА ВЕНЕРОЛОГІЇ" АМНУ (56) UA U 30701, 11.03.2008. Aditya K Gupta et al.:”Molecular differentiation of Seven Malassezia species”, Journal of clinical microbiology, May 2000, Vol. 38, No. 5, p. 1869-1875. Aristea Velegraki et al.:”Use of fatty acid RPMI 1640 media for testing susceptibilities of eight Malassezia species to the new triazole posaconazole and to six established antifungal agents by a modified NCCLS M27-A2 microdilution method and etest”, Journal of clinical microbiology, Aug. 2004, Vol. 42, No. 8, p. 3589-3593. Monica Vilhelmsson et al.:”Crystallization and preliminary crystallographic study of the yeast malassezia sympodialis allergen Mala s 1”, Acta Cryst. (2006). F62, 97-99, ISSN: 1744-3091. Koichi Makimura et al.:”Species identification and strain typing of Malassezia species stock strains and C2 2 (19) 1 3 controls. // Acta. Dermatol. Venereol. - 2005. - Vol.85, №1. - P.17-23]. M. sympodialis є представником роду Malassezia у хворих на АД, що найчастіше регіструється. Роль Malassezia spp. в розвитку АД визначається за допомогою детекції специфічних антитіл класів IgG, IgE, внутрішньошкіряної проби та нашкірного аплікаційного тесту, для постановки яких використовується екстракт із M.sympodialis [Casagrande B.F., Fluckiger S., Linder M.T., Jonansson C, Scheynins A., Crameri R., SchmidGrendelmeir P. Sensitization to the yeast Malassezia sympodialis is specific for extrinsic and intrinsic atopic eczema // J.Infest. Dermat. - 2006. - Vol.126, №6. P.2414-2421; Schmid-Grendelmeier P., Scheynius A., Crameri R. The role of sensitization to Malassezia sympodialis in atopic eczema in Allergy and Asthma in the in modern Society: The Scientific approach. Chem. Immunol. Allergy, Basel, Karger, ed. Crameri R. - 2006. - Vol.91. - P.98-109]. Однак відомо, що в кожному великому регіоні циркулюють штами мікроорганізмів одного виду, які суттєво відрізняються за своїми антигенними, імуногенними, алергенними та ін. властивостями, що визначає необхідність готувати біологічні препарати із мікроорганізмів, які виділяються в даному регіоні. Ці відмінності можуть бути настільки принциповими, що доводиться класифікувати такі мікроорганізми, як новий вид. Так, було встановлено, що в Японії циркулюють два нових види Malassezia M.dermatis та M.japonica, які почали використовуватися для приготування діагностикумів (Sugita Т., Takashima M., Shinoda Т., Suto H., Unno Т., Tsuboi R., Ogawa H., and Nishikawa A. New yeast species Malassezia dermatis, isolated from patients with atopic dermatitis // J. Clin. Microb. - 2002. - Vol. 40, №4. - p. 1363-1367; Sugita Т., Takashima M., Kodama M., Tsuboi R., and Nishikawa A. Description of a new yeast species, Malassezia japonica, and its detection in patients with atopic dermatitis and healthy subjects // J.Clin. Microb. - 2003. - Vol. 41, №10. - p. 4695-4699). Найбільш близьким за сукупністю ознак до того, що заявляється, є штам Malassezia sympodialis ATCC 42132, який використовується для детекції специфічних IgG та IgE антитіл до Malassezia, а також для внутрішньо-шкіряних проб та нашкірних аплікацій при діагностиці, перш за все, атопічного дерматиту. Фірма Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala, Швеція, випускає діагностикум Immuno CAP "m70", який містить екстракт із культури М. sympodialis ATCC 42132. В основу винаходу покладено задачу виділення штаму мікроорганізмів виду M.sympodialis, які циркулюють в даному регіоні та стабільно зберігають антигенні та імуногенні властивості. Це дозволить одержати високоактивні імунні сироватки та специфічний антиген для виготовлення діагностичних тест-систем при діагностиці АД, що відповідає технічному результату, який досягається при використанні винаходу - штаму. Новому штаму Malassezia sympodialis 97 задепонованому в ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб АМН України" під реєстраційним 93898 4 номером МПМ №27-Д, властиві такі ознаки, що відрізняють його від споріднених штамів. Штам, який за сукупністю властивостей був ідентифікований як M.sympodialis, одержаний шляхом змиву зі шкіри за допомогою стерильного вологого мікробіологічного зонду зі скла, гомогенізації у 0,5 мл стерильного 0,05% розчину Тритону Х-100 у фізіологічному розчині рН 7,9, висівання на модифіковане поживне середовище ЛімінгаНотмана, яке містить пептон, D-глюкозу, бичачу жовч, дріжджовий екстракт, гліцерол моностеарат, гліцерол, олеїнову кислоту, Твін 20, Твін 40, Твін 80, молоко коров'яче, антибіотики левоміцетин, гентаміцин, цефазолін, агар-агар, рН 5,5-6,5. Для визначення генетичних особливостей було ампліфіковано внутрішні транскрибовані спейсери гену рибосомальної РНК 18S---ITS1---5,8--ITS2. Амплікон був секвенований. Визначенні нуклеотидні послідовності його при порівнянні з базою даних НЦБІ США, виявили 99% збігу, що дозволяє ідентифікувати штам, як M.sympodial, але 1% генетичного матеріалу відрізняється від класичного зареєстрованого штаму, що обумовлює появу нових властивостей. Так, в позиціях 36 та 72 первинної структури внутрішніх транскрибованих спейсерів гену рибосомальної РНК реєструються нуклеотиди, які не зустрічаються в жодній депонованій культурі M.sympodialis, у тому числі M.sympodialis ATCC 42132. Штам було одержано від хворої Б., №97, 19 років, жінка, діагноз "атопічний дерматит", яка хворіє з дитинства. Скарги на висип по всьому тілу, свербіж. Зразки для культивування грибів "змив зі шкіри" були одержані за допомогою стерильного вологого мікробіологічного зонду зі скла, гомогенізовано у 0,5 мл стерильного 0,05% розчину Тритону Х-100 у фізіологічному розчині рН 7,9, висіяні на модифіковане поживне середовище ЛімінгаНотмана, яке містить пептон, D-глюкозу, бичачу жовч, дріжджовий екстракт, гліцерол моностеарат, гліцерол, олеїнову кислоту, Твін 20, Твін 40, Твін 80, молоко коров'яче, антибіотики левоміцетин, гентаміцин, цефазолін, агар-агар, рН 5,5-6,5. Перші ознаки росту грибів були виявлені на 10 добу. Ідентифікацію грибів здійснювали на підставі вивчання морфологічних, культуральних, біохімічних та молекулярно-генетичних властивостей. Штам характеризується такими ознаками та властивостями: За даними мікроскопічних досліджень дріжджові клітини кулястої, овоїдної форми, розміром 2-6 мікронів, грампозитивні. Колонії на модифікованому середовищі Лімінга-Нотмана, сферичної форми, кольору слонової кістки, розміром 2-4 мм. Штам, що виділений, не росте на середовище Сабуро, росте на модифікованому середовищі Диксона при t32°C, t37°C, t40°C, каталазопозитивний, не розщеплює Кремофор EL, розщеплює ескулін, утилізує Твін 40, Твін 80, не утилізує Твін 20. Родову приналежність визначали за допомогою полімеразно ланцюгової реакції (ПЛР), а видову приналежність ідентифікували за допомогою ампліфікації та наступного секвенування внутрішніх транскрибованих спейсерів гену рибосомальної РНК 18S---ITS1---5,8---ITS2 для визначення послідовності нуклеотидів. Секвенування було прове 5 дено фірмою "Пінні" (РФ, Москва) на секвенаторі АВІ Prism Genetic Analyzer 3100 фірми Applied Biosystems. Дані приведені у графіку (див. Рис.). Порівняння з базою даних Національного центру біотехнологічної інформації США, виявили 99% збігу, що дозволяє ідентифікувати штам, як M.sympodialis, але в позиціях 36 та 72 первинної структури гену рибосомальної РНК реєструються нуклеотиди, які не зустрічаються в жодній депонованій культурі M.sympodialis, у тому числі M.sympodialis ATCC 42132, що свідчить про унікальні властивості регіонального штаму M.sympodialis 97. Штам стабільно зберігає антигенні властивості в процесі пасажу його на модифікованому поживному середовищі Лімінгу-Нотмана. При електрофорезі в поліакріламідному гелі екстракту із штаму M.sympodialis було виявлено не менш ніж 13 білкових фракцій, що є характерним для M.sympodialis [Limacher A., Glaser A.G., Meier С, Schmid-Grendelmeier P., Zeller S., Scapozza L. and Crameri R. Cross-reactivity and 1.4. - A crystal structure of Malassezia sympodialis thioredoxin (Mala 93898 6 s 13), a member of a new pan-allergen family // J. Immunol. - 2007. - Vol.178, №3. - P.389-396]. Це дозволяє одержати високоактивні імунні сироватки та специфічний сумарний антиген для приготування діагностичних тест-систем для діагностики АД. Для перевірки антигенних властивостей штаму було визначено в сироватці хворого на АД вміст специфічних антитіл класу IgG, за допомогою ІФА. Специфічність штаму ілюструє наступний приклад: Приклад. Хворий X., чоловік, 45 років, історія хвороби №484, діагноз "атопічний дерматит в стадії загострення". З його шкіри було виділено Malassezia furfur. Враховуючи те, що M.sympodialis містить не тільки видо-, але й родиноспецифічні антигени, сумарний екстракт M.sympodialis 97 був використаний в якості антигену. У сироватці цього хворого були виявлені специфічні IgG антитіла в титрах 4,5 од/мл, що співпадає за даними літератури (>0,35-70,0 од/мл) з відповідними показниками, коли застосовували для визначення IgG специфічних антитіл у хворих на АД екстракт M.sympodialis АТСС 42132. 7 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 93898 8 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601