Спосіб детекції грибів роду malassezia в клінічних зразках

Спосіб детекції грибів роду Malassezia в клінічних зразках методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням праймеру 5'ctaaatatcggggagagaccga-3', який відрізняється тим, що в реакції використовують зворотний праймер довжиною 21 нп з послідовністю 5'gtgtgaaggtgtccgaagacc-3', при цьому довжина амплікону, що відповідає позитивній реакції, дорівнює 308 нп. (19) (21) u200711932 (22) 29.10.2007 (24) 11.03.2008 (72) МАВРОВ ІВАН ІВАНОВИЧ, UA, БІЛОЗОРОВ ОЛЕКСІЙ ПАВЛОВИЧ, UA, СОКОЛ ОКСАНА АНАТОЛІЇВНА, UA, БЕЗРУЧЕНКО ІЗА АНТОНІВНА, UA, МІЛЮТИНА ОЛЕНА ЙОСИПІВНА, UA, БІЛОЗОРОВА ОЛЬГА ОЛЕКСІЇВНА, UA, ЗУЄВА МАРІЯ ІГОРІВНА, UA, ВАСИЛЬЧЕНКО ВАЛЕРІЙ МИКОЛАЄВИЧ, UA (73) ІНСТИТУТ ДЕРМАТОЛОГІЇ ТА ВЕНЕРОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ, UA 3 США і експериментально перевірений на можливість використання для ПЛР з метою детекції специфічних ділянок ДНК грибів роду Malassezia. Введення в реакцію нового праймера значно зменшує можливість утворення димерів і артефактів ампліфікації, що дає можливість визначення утвореного в результаті реакції амплікону методом електрофорезу в гелі агарози. Спосіб виконують наступним чином. З досліджуваного зразку виділяють ДНК за допомогою методу, що забезпечує ефективне вивільнення ДНК з клітини грибів і її очищення від речовин, які заважають проведенню ампліфікації. Досліджуваний зразок вміщується в пробірку з 1 мл лікуючим розчином, до складу якого входять 100мМ Трис-НСl, рН 8,0, 30 mM EDTA, рН 8,0 та 0,5% додецил сульфат натрію, і інкубується 15хв при 100С. Суспензія переноситься до нової пробірки і екстрагується сумішшю фенол/хлороформ/ізоаміловий спирт (24/24/1 за об'ємом), а потім додатково хлороформом з ізоаміловим спиртом (24/1 за об'ємом). ДНК осаджувалась 2,5 обсягами етанолу з 3М ацетату натрію. Осад ДНК розчинювався в 30мкл буферу ТЕ (10мМ Трис-НСl, рН 8,0 І 1 mM EDTA, рН 8,0). Для ампліфікації готували суміш наступного складу: Трис-НСl рН 8,5 10 mM, KCl 50 тМ, хлористий магній 2,5мМ, три фосфати 0,2мМ, диметилсульфоксид - 1%, Taq полімераза: 0.5 од, а також праймери 0,2мкМ такого складу: прямий F 992 5'-ctaaatatcggggagagaccga-3' та зворотний R 1279 5'-gtgtgaaggtgtccgaagacc-3' Ампліфікація проводилась за таким режимом: Перший цикл: Денатурація 95°С 2 хвилини, Віджиг 54°С 2 хвилини, Елонгація 70°С 2 хвилини. Після цього проводилось ще 39 циклів за такими умовами: 94°С - 30 секунд, 54°С - 30 секунд, 70°С - 30 секунд. Після закінчення ампліфікація проводили детекцію продуктів реакції електрофорезом в 1,5% гелі агарози в ТЕ буфері, рН 8,3 з 0,5мМ етидіума броміду протягом 15 хвилин, після чого аналізували за допомогою трансілюмінатора зі світлом з довжиною хвилі 310 нм. При позитивному результаті реакції виявлявся амплікон довжиною 308 нп. Як приклад застосування можна навести визначення ДНК Malassezia у зразку, отриманому за допомогою квача зі шкіри хворого N, діагноз себорейна екзема. При електрофорезі в гелі агарози зразка після ампліфікації було виявлено смужку, забарвлену бромістим етидієм, розташовану поряд із смужкою позитивного контролю на ДНК Malassezii, що відповідав молекулярній масі 308 нп. 30701 4