Спосіб одержання метаболітів з поверхнево-активними і емульгувальними властивостями

Спосіб одержання метаболітів з поверхневоактивними і емульгувальними властивостями, де Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 культивують на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецю і енергії - етанол або гексадекан у концентрації 2 % при рН 6,8-7,0, а також вносять у середовище на початку стаціонарної фази росту продуцента фумарат і цитрат, який відрізняється тим, що концентрація фумарату і цитрату становить 0,07-0,08 %, а вміст мінеральних солей становить: KNO3 - 1,0; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001. UA (21) a201002791 (22) 11.03.2010 (24) 26.04.2011 (46) 26.04.2011, Бюл.№ 8, 2011 р. (72) ПИРОГ ТЕТЯНА ПАВЛІВНА, ТАРАСЕНКО ДМИТРО ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ЯЦУК ДМИТРО ВАЛЕРІЙОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ (56) UA U 44144, 25.09.2009 UA A 10467, 25.12.1996 UA C2 77345, 15.11.2006 UA C2 92819, 10.12.2010 Волошина І. М., Пирог Т. П. Cинтез мікробних поверхнево-активних речовин для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень. Міжнародна науково-практична конференція "Перший Всеукраїнський з'їзд екологів". - Збірник матеріалів, 2006 Пирог Т.П. та ін. Синтез поверхнево-активних речовин у різних умовах культивування штаму Rhodococcus erythropous ЭК-1, Збірник тез всеукраїнської науково-практичної конференції "Біотехнологія. Освіта. Наука" Львів, 6-7 жовтня 2004 C2 2 (19) 1 3 94345 ваних метаболітів з емульгувальними властивостями (далі по тексту - емульгатора). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання метаболітів з поверхнево-активними та емульгувальними властивостями, який знижує вміст солей у середовищі культивування R. erythropolis EK-1 та підвищує синтез емульгатора. Штам R. erythropolis EK-1 депоновано у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології Національної академії наук України за номером ІМВ Ас-5017. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання метаболітів з поверхневоактивними та емульгувальними властивостями включає культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, джерело вуглецю і енергії, а також внесення у середовище на початку стаціонарної фази росту продуцента фумарату і цитрату. Згідно винаходу концентрація фумарату і цитрату становить 0,070,08 %. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Добавлення у середовище на початку стаціонарної фази росту продуцента 0,07-0,08 % фумарату і цитрату дає змогу знизити кількість солей у середовищі культивування та підвищити синтез метаболітів з емульгувальними властивостями. Експериментально доведено, що внесення на початку стаціонарної фази росту продуцента у середовище 0,07-0,08 % фумарату і цитрату дає змогу знизити у 3 рази вміст солей у середовищі культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 та підвищити у 1,6-2,2 разів індекс емульгування розбавленої у 50 разів культуральної рідини. Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): KNO3 - 1,0; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO47H2O - 0,1; FeSO47H2O 0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол і гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру R. erythropolis ІMB Ас-5017 з середини експоненційної фази (44-48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі з 1,0 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту (58-60 4 год.) у середовище вносять 0,07-0,08 % фумарату і цитрату. Цитрат натрію і фумарат натрію добавляють у середовище у вигляді 10 %-них розчинів. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 30 °С, рН 6,8-7,0 упродовж 100 год. Використання нового способу дає змогу знизити у 3 рази вміст солей у середовищі культивування (з 9 до 2,85 г/л) і підвищити у 1,6-2,2 рази індекс емульгування розбавленої у 50 разів культуральної рідини (з 40-60 до 88-98 %). Приклад 1. Вплив фумарату і цитрату на синтез поверхнево-активних речовин за умов росту R. erythropolis ІMB Ас-5017 на середовищах різного складу. Культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі 1 (прототип) такого складу (г/л): KН2РО4 - 6,8; NaOH - 1,0; NH4NO3 - 0,6; MgSO47H2O - 0,4; СаСl22Н2О - 0,1; FeSO47H2O - 0,001; рН 6,8-7,0; а також на середовищі 2 (г/л): KNO3 - 1,0; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO47H2O - 0,1; FeSO47H2O - 0,001, рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують гексадекан і етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру R. erythropolis IMB Ас-5017 з середини експоненційної фази (4448 год. росту), вирощену на рідкому середовищі з 1,0 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Концентрація посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту (58-60 год.) у середовище вносять фумарат натрію у концентрації 0,2 %, а також цитрат натрію у концентрації 0,1 % (згідно прототипу). Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °С, рН 6,8-7,0 упродовж 100 год. Синтез ПАР оцінюють за показником умовної концентрації ПАР (ПАР*), який визначають як ступінь розведення вільної від клітин культуральної рідини у точці збільшення поверхневого натягу на кривій залежності поверхневого натягу від логарифму значення розведень. Абсциса точки перетину кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР та виражається в безрозмірних одиницях. Значення показника ПАР* за умов росту штаму IMB Ас-5017 на середовищах різного складу наведено у табл. 1. Таблиця 1 Синтез поверхнево-активних речовин під час культивування R. etythropolis IMB Ас-5017 на середовищах різного складу за присутності фумарату (0,2 %) і цитрату (0,1 %) Середовище 1 (прототип) 2 Умовна концентрація ПАР (ПАР*) за умов росту на етанолі гексадекані 5,1 6,6 5,1 6,6 Як видно з наведених у табл. 1 даних, показники синтезу ПАР є однаковими за умов росту R. erythropolis IMB Ас-5017 на обох середовищах. У подальших дослідженнях культивування продуце нта здійснювали на середовищі 2, оскільки воно значно дешевше (містить у 3 рази менше солей, ніж середовище 1). 5 Приклад 2. Визначення оптимальної для синтезу ПАР концентрації фумарату і цитрату у середовищі культивування R. erythropolis IMB Ас-5017. Культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): KNO3 - 1,0; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KН2РО4 - 0,14; MgSO47H2O - 0,1; FeSO47H2O - 0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують гексадекан і етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру R. erythropolis IMB Ас-5017 з середини експоненційної фази (44 94345 6 48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі з 1,0 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Концентрація посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту (58-60 год.) у середовище вносять фумарат натрію і цитрат натрію у концентрації 0,060,09 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 30 °С, рН 6,8-7,0 упродовж 100 год. Значення показника ПАР* залежно від концентрації фумарату і цитрату у середовищі культивування наведено у табл. 2. Таблиця 2 Синтез ПАР R. erythropolis IMB Ас-5017 залежно від концентрації фумарату і цитрату у середовищі з етанолом і гексадеканом Концентрація фумарату і цитрату, % Без фумарату і цитрату (контроль) Цитрат, 0,06 + фумарат, 0,06 Цитрат, 0,06 + фумарат, 0,07 Цитрат, 0,06 + фумарат, 0,08 Цитрат, 0,06 + фумарат, 0,09 Цитрат, 0,07 + фумарат, 0,06 Цитрат, 0,07 + фумарат, 0,07 Цитрат, 0,07 + фумарат, 0,08 Цитрат, 0,07 + фумарат, 0,09 Цитрат, 0,08 + фумарат, 0,06 Цитрат, 0,08 + фумарат, 0,07 Цитрат, 0,08+ фумарат, 0,08 Цитрат, 0,08 + фумарат, 0,09 Цитрат, 0,09 + фумарат, 0,06 Цитрат, 0,09 + фумарат, 0,07 Цитрат, 0,09 + фумарат, 0,08 Цитрат, 0,09 + фумарат, 0,09 Отже, найвищий показник ПАР* спостерігається за умови внесення у середовище як з етанолом, так і гексадеканом фумарату і цитрату у концентрації 0,07-0,08 %. За таких умов культивування показник ПАР* підвищується у 1,61,8 разів порівняно з вирощуванням продуцента на середовищі без фумарату і цитрату. Приклад 3. Синтез емульгатора за умов росту R. erythropolis IMB Ас-5017 на середовищі з фумаратом і цитратом. Умовна концентрація ПАР (ПАР*) за умов росту на етанолі гексадекані 3,0 3,6 3,23,33,53,6 4,24,44,44,5 4,35,15,14,9 6,06,66,66,3 4,75,15,15,0 6,26,66,66,2 4,84,74,74,6 5,75,65,85,5 Культивування R. erythropolis IMB Ac-5017 здійснюють в умовах, описаних вище. Як джерело вуглецю і енергії використовують гексадекан і етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). На початку стаціонарної фази росту у середовище вносять фумарат і цитрат (0,07-0,08 %). Синтез емульгатора оцінюють за показником індексу емульгування (Е24, %) розбавленої у 50 разів культуральної рідини. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. Таблиця 3 Вплив фумарату і цитрату на синтез емульгатора за умов росту R. erythropolis IMB Ас-5017 на середовищі з етанолом і гексадеканом Концентрація фумарату і цитрату, % Без фумарату і цитрату (контроль) Цитрат, 0,07 + фумарат, 0,07 Цитрат, 0,07 + фумарат, 0,08 Цитрат, 0,08 + фумарат, 0,07 Цитрат, 0,08 + фумарат, 0,08 Таким чином, за присутності фумарату і цитрату (0,07-0,08 %) у середовищі з етанолом і гек Показник Е24, % (1:49) за умов росту на етанолі гексадекані 60 40 98 85 97 84 98 88 97 87 садеканом показник індексу емульгування підвищується в 1,6 і 2,2 разів відповідно. 7 94345 Отже, використання запропонованого способу дає змогу знизити у 3 рази (з 9 до 2,85 г/л) вміст солей у середовищі культивування R. erythropolis Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 8 IMB Ас-5017 та підвищити у 1,6-2,2 разів з 40-60 до 88-98 % індекс емульгування розбавленої у 50 разів культуральної рідини. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601