Мутантні промотори аох1

1. Мутантний промотор алкогольоксидази 1 (АОХ1) Pichia pastoris промотору AOX1 Pichia pastoris дикого типу (SEQ ID No. 1), який включає щонайменше одну мутацію нуклеотидів від 170 до 235 (від -784 до -719) Seq. ID No. 1 для забезпечення високої експресії в умовах індукції метанолом. 2. Промотор за п. 1, який відрізняється тим, що промотор далі включає мутацію нуклеотидів від 694 до 723 (від -260 до -231) та/або нуклеотидів від 729 до 763 (від -225 до -191) Seq. ID No. 1 та/або сайта зв'язування фактора транскрипції (TFBS) та/або щонайменше одну мутацію, вибрану з групи, що складається з нуклеотидів від 170 до 2 (19) 1 3 94399 4 6. Вектор, який включає мутантний промотор алкогольоксидази 1 (АОХ1) Pichia pastoris за будь-яким з пп. 1-4 або молекулу нуклеїнової кислоти за п. 5. 7. Клітина, яка включає щонайменше один мутантний промотор алкогольоксидази 1 (АОХ1) Pichia pastoris за будь-яким з пп. 1-4, щонайменше один фрагмент нуклеїнової кислоти за п. 5, або щонайменше один вектор за п. 6. 8. Клітина за п. 7, яка відрізняється тим, що зазначена клітина є еукаріотичною клітиною, зокрема, дріжджовою клітиною, краще, метилотрофною дріжджовою клітиною, краще, вибраною з групи, що складається з Candida, Hansenula, Pichia та Toruplosis, зокрема, клітиною Pichia pastoris. 9. Набір для експресії вибраного білка, який включає і) вектор за п. 6, та іі) клітину, здатну експресувати зазначений білок під контролем промотору за будь-яким з пп. 1-4. 10. Набір за п. 9, який відрізняється тим, що зазначена клітина є дріжджовою клітиною, краще, метилотрофною дріжджовою клітиною, краще, вибраною з групи, що складається з Candida, Hansenula, Pichia та Toruplosis, зокрема, клітиною Pichia pastoris. 11. Спосіб експресії рекомбінантного білка, пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти у клітині, який включає такі стадії: - забезпечення молекули нуклеїнової кислоти за п. 5 або вектора за п. 6, що включають промотор АОХ1 за будь-яким з пп. 1-4 та нуклеїнову кислоту, яка кодує білок, пептид або функціональну нуклеїнову кислоту, причому зазначений промотор функціонально зв'язаний із зазначеною нуклеїновою кислотою, - трансформування зазначеної клітини зазначеним вектором або зазначеною молекулою нуклеїнової кислоти, - культивації трансформованих клітин у придатному культуральному середовищі, - необов'язково, індукування експресії зазначеного білка, пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти, та - виділення зазначеного експресованого білка, пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти. 12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що зазначена клітина є дріжджовою клітиною, краще, метилотрофною дріжджовою клітиною, краще, вибраною з групи, що складається з Candida, Hansenula, Pichia та Toruplosis, зокрема, клітиною Рісhіа pastoris. 13. Використання молекули нуклеїнової кислоти за п. 5, вектора за п. 6 або клітини за будь-яким з пп. 7 або 8, для експресії білка, пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти. 14. Спосіб виділення суперекспресивних клонів, який включає стадії: a) введення в клітину молекули нуклеїнової кислоти, що включає мутантний промотор алкогольоксидази 1 (АОХ1) Pichia pastoris за будь-яким з пп. 1-4, та щонайменше однієї молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок (пептид) або функціональної нуклеїнової кислоти, і маркерного гена резистентності, де зазначений промотор та зазначена нуклеїнова кислота є функціонально зв'язаними з утворенням одно- чи мультикопійної касети експресії або вектора, що включають зазначену молекулу нуклеїнової кислоти, b) перенесення клітини зі стадії а) до середовища, яке містить придатний селективний маркер, нерепресуюче джерело вуглецю та метанол для селективного росту суперекспресивних клонів в умовах індукування, c) інкубації клітини зі стадії b) на зазначеному середовищі, d) виділення колонії клітин, одержаних зі стадії с), та е) детектування суперекспресивних клонів шляхом визначення швидкості експресії зазначеної клітини. 15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що селективний маркер є антибіотиком, краще, зеоцином або генетицином. 16. Спосіб за пп. 14 або 15, який відрізняється тим, що селективний маркер є зеоцином, а маркерний ген резистентності є геном sh ble. 17. Спосіб за будь-яким з пп. 14-16, який відрізняється тим, що клітина є дріжджовою клітиною, краще, метилотрофною дріжджовою клітиною, краще, вибраною з групи, що складається з Candida, Hansenula, Pichia та Toruplosis, зокрема, клітиною Pichia pastoris. 18. Спосіб за будь-яким з пп. 11-17, який відрізняється тим, що нерепресуюче джерело вуглецю вибирають з групи, що складається з аланіну, маніту, сорбіту, трегалози, лактози та їх комбінацій. 19. Спосіб за будь-яким з пп. 1-18, який відрізняється тим, що молекулу нуклеїнової кислоти або вектор вводятьв клітину шляхом трансформації, краще, електропорації або хімічної трансформації, або шляхом злиття протопластів, або шляхом бомбардування частинками. Даний винахід стосується мутантних промоторів АОХ1 Pichia pastoris. S. cerevisiae домінував (і продовжує домінувати) у науковому та біотехнологічному застосуванні як модельний еукаріотичний організм та продукуюча система. У минулому сторіччі багато уваги притягнули інші дріжджі, а саме дріжджі, що діляться, Schizosaccharomyces pombe. Завдяки своїй властивості розмножатися лише шляхом поділу S. pombe заслужили виняткову увагу як модельний організм і на сьогодня є видом дріжджів, найбільш інтенсивно досліджуваним з погляду молекулярної генетики та біології клітин, поряд з S. cerevisiae. З більш ніж 700 різних видів дріжджів, відомих зараз, два вищезгадані види дріжджів можуть забезпечувати лише обмежений набір цікавих ознак для технологічних та наукових областей застосування. Починаючи з 1970-х чи 80-х років, дедалі більше видів дріжджів з видатними характеристиками вивчалися для біотехнології та досліджень. Ці так 5 94399 звані незвичайні дріжджі (NCY) або несахароміцетні (non-Saccharomyces) дріжджі (в даному випадку термін Saccharomyces включає дріжджі Schizosaccharomyces pombe) розробляють з кількох причин: вони мають значення для медіцини, як Candida albicans, або для технології, як Yarrowia lipolytica та Kluyveromyces lactis, які мають здатність до росту на певних субстрати (наприклад, налканах, лактозі). Наприклад, найбільш поширений грибковий патоген людини С. albicans уважно досліджується для визначення природи вірулентних факторів, які беруть участь у патогенезі, тим самим стаючи модельним організмом для патогенних дріжджів. Іншою добре визначеною групою NCY є метилотрофні дріжджі Pichia pastoris та Hansenula polymorpha (Pichia angusta), які перевершують S. cerevisiae за показниками продукування рекомбінантного протеїну та для досліджень біогенезу пероксисом. Це лише найбільш видатні члени незвичайних дріжджів, які привертають увагу через технологічні або наукову увагу. На сьогодні кілька видів становлять особливий інтерес і ця група буде швидко зростати найближчими роками. Цукри, найбільш поширений клас молекул в природі, утилізуються всіма відомими дріжджами. Хоча існують великі розбіжності в прийнятності 6 субстрату для різних видів (див. Таблицю 1), конверсія глюкоза-6-фосфату або фруктоза-6фосфату на піруват є звичайною темою в їхньому метаболізмі. В будь-якому випадку, ферментативне обладнання гліколітичного шляху істотно відрізняється для різних дріжджів. Якщо у S. cerevisiae більшість ферментів є відомими та охарактеризованими, щонайменше частково, і ще кілька ферментів було описано для NCY. Деякі з функцій, потрібних для гліколізу, медіюються кількома генами/ферментами у деяких дріжджів, особливо ті, що відіграють додаткову роль в контролі або регуляції метаболізму та/або належать до точки розгалуження, такі як глюкокіназа/гексокіназа, фосфофруктокіназа та гліцеральдегід-3фосфатдегідрогеназа. Нормально, ізоферменти регулюються диференційно, що вказує на різні функції в змінних мовах навколишнього середовища. Деякі з генів, що кодують гліколітичні ферменти, є конститутивними та високоекспресійними, наприклад, гени PGK1 S. cerevisiae (фосфогліцераткіназа) або GAP P. pastoris (гліцеральдегід-3фосфатдегідрогеназа), тоді як інші ферменти є суворо регульованими, так як ген ENO1 (енолаза) S. cerevisiae. Таблиця 1 Вибрані дріжджі, що становлять біотехнологічний інтерес для відповідних комерційних субстратів крім глюкози та фруктози Дріжджі S. cerevisiae S. pombe Zygosaccharomyces bailii Yarrowia lipolytica Pichia stipitis Pichia pastoris Hansenula poiymorpha Енергетичний метаболізм Кребтрі-позитивні Кребтрі-позитивні Кребтрі-позитивні Кребтрі-негативні Кребтрі-негативні Кребтрі-негативні Кребтрі-негативні Schwanninomyces occidentalis Кребтрі-негативні Kluyveromyces lactis Кребтрі-негативні Доля пірувату при метаболізмі істотно відрізняється для різних видів дріжджів та умов культури. У S. cerevisiae та Інших так званих Кребтріпозитивних дріжджів, дихання інгібується глюкозою та спорідненими цукрами. Це приводить до трансформації пірувату піруватдекарбоксилазою до етанолу та СО2, навіть при великій кількості кисню, що відомо також як ферментація. У Кребтрі-негативних дріжджів, до яких належить більшість NCY, трансформація пірувату на етанол відбувається тільки в анаеробних умовах. В аеробних умовах піруват окиснюється до СО2 піруватдегідрогеназою за циклом трикарбонових кислот (ТСА). Цикл ТСА є надзвичайно цікавим для клітинного метаболізму через той факт, що він є єдиним шляхом окиснення цукрів до СО2. Окиснення до СО2 приводить до утворення NADH, що використовується для виробляння енергії. Крім того, проміжні сполуки циклу ТСА є важливими джерелами мета Вибрані субстрати сахароза, мальтоза, рафіноза, етанол сахароза, мальтоза, рафіноза оцтова кислота, етанол, гліцерин н-алкани, жирні кислоти, етанол ксилоза метанол, гліцерин метанол, гліцерин крохмаль, н-алкани, ксилоза, сахароза, рафіноза, трегалоза, лактоза, етанол лактоза, сахароза, мальтоза, рафіноза, етанол, гліцерин, ксиліт, лактат болітів для біосинтезу. Через видалення проміжних сполук цикл ТСА має підживлюватися для його підтримання. Основними анаплеротичними реакціями у дріжджів є цикли піруваткарбоксилази та гліоксилату. Перший є основним шляхом при вирощуванні на амонії як єдиному джерелі азоту, а останній потрібний при вирощуванні на джерелах вуглецю з менш ніж 3 атомами вуглецю. На відміну від цього великого інтересу майже нічого невідомо про гени або ферменти, що беруть участь в циклі ТСА у NCY. NADH, генерований катаболічними реакціями в цитозолі або в мітохондріях, має бути + повторно окиснений до NAD для підтримання реакції. У Кребтрі-негативних дріжджів (наприклад, Pichia pastoris) в аеробних умовах NADH повторно окиснюється переважно в дихальному ланцюзі. Ситуація істотно відрізняється у Кребтріпозитивних дріжджів, таких як S. cerevisiae, де дихання та ферментація співіснують. При вирощу 7 ванні на глюкозі в аеробних умовах, дихання пригнічується глюкозою і відбувається ферментація. В + цих умовах NAD регенерується шляхом утворення етанолу (NADH виробляється гліколізом) або гліцерину. Дихання у дріжджів відрізняється від тваринної парадигми цього шляху, описаної в будь-якому підручнику біохімії. По-перше, деякі дріжджі, такі як S. cerevisiae та Kluyveromyces lactis, не мають комплексу І дихального ланцюга. У + цих дріжджів регенерація NAD здійснюється без перекачування протонів через внутрішню мітохондріальну мембрану зовнішніми та внутрішніми NADH дегідрогеназами. Другою значною відмінністю, спостережуваною у Кребтрі-негативних дріжджів, грибків та рослин, є альтернативний дихальний шлях, паралельний комплексам III та IV цитохромного ланцюга. Це альтернативне дихання медіюється так званою альтернативною оксидазою, яка переносить електрони безпосередньо від убіхінонового пула до кисню без перекачування протонів через внутрішню мітохондріальну мембрану. NADPH для біосинтезу продукується в окисній частині пентозфосфатного шляху (РРР). Іншими дуже важливими метаболітами, що виробляються цим шляхом, є рибоза-5-фосфат та еритроза-4фосфат, потрібні для синтезу нуклеїнових кислот та нуклеотидних кофакторів та для синтезу ароматичниих амінокислот, відповідно. Досі існує багато прогалин в інформації про гени та їхні відповідні ферменти, що приймають участь в РРР у незвичайних дріжджів. Кілька ферментів були виділені з Candida utilis, S. pombe та K. lactis. Композиційний та кінетичний аналіз виявив кілька розбіжностей між цими ферментами. Через відсутність інформації вплив на РРР у цих дріжджів не можна оцінити, але було показано, що, наприклад, фосфоглюкозоізомеразні мутанти K. lactis, які є гліколіздефіцитними, здатні рости в глюкозному середовищі, на відміну від S. cerevisiae. Це спостереження вказує, що місткість пентозофосфатного шляху у K. lactis є достатньою для росту на глюкозі як джерелі вуглецю. У метилотрофних дріжджів можна знайти додаткову транскетолазу (дигідроксіацетонсинтазу). Цей фермент локалізований в пероксисомах та забезпечує асиміляцію формальдегіду в клітинний метаболізм шляхом конденсації з ксилулоза-5-фосфатом з утворенням дигідроксиацетону та гліцеральдегід-3-фосфату. Дріжджі як одноклітинні еукаріотичні організми є привабливими системами експресії для продукування рекомбінантних протеїнів. Вони поєднують переваги бактерій, такі як добре розроблені методики генетичних маніпуляцій, прості, надійні і тому дешеві (великомасштабні) методики культивації, з основною перевагою еукаріотичних систем експресії, а саме, процесингом протеїну еукаріотів. З названих вище причин S. cerevisiae протягом багатьох років домінував в цій області, в результаті чого велика кількість протеїнів (наприклад, інсулін, HBsAg, HSA) продукувалися в цьому організмі. S. cerevisiae виявляє деякі обмеження внаслідок гіперглікозилювання, утримання секретованих протеїнів в периплазматичному просторі, нестабільність плазмід та низький вихід продукту. Для 94399 8 подолання обмеження цього одного організму був розроблений невеликий набір незвичайних дріжджів як хазяїв для експресії гетерологічного гена. Поміж інших, використовувалися K. lactis, Y. lipolytics та метилотрофні дріжджі Candida boidinii, H. polymorpha та Р. pastoris, але тільки 2 останні види притягнули великий комерційний інтерес. Schizosaccharomyces pombe виявляє деякі характеристики, дуже близькі до вищих еукаріотів, що робить ці дріжджі дуже привабливим хазяєм для продукування гетерологічного протеїну: (1) механізм ініціації транскрипції є більш близьким до вищих еукаріотів, (2) деякі промотори ссавців є функціональними в S. pombe, (3) здатність до РНКсплайсингу, що проявляється в подібності компонентів спликосоми до тих, що присутні у ссавців, (4) може розпізнаватися сигнал утримання ендоплазматичн ретикулюм ссавців KDEL, (5) присутність галактозних залишків в глікопротеїнах та (6) деякі інші посттрансляційні модифікації, такі як ацетилювання та ізопренілювання протеїнів здійснюються у спосіб, більш близький до клітин ссавців, ніж до дріжджових клітин. Кілька з вищезгаданих ознак можуть збільшити важливість S. pombe у продукуванні рекомбінантного протеїну в близькому майбутньому по відношенню до продукування аутентичних гетерологічних протеїнів та їх високопродуктивних застосувань, таких як структурна та функціональна геноміка. Всі мікроорганізми мають механізми адаптації їхнього метаболізму для оптимальної утилізації живильних речовин, присутніх в навколишньому середовищі. Швидка та точна адаптація до цих навколишніх обмежень є важливим фактором контролю росту та інших фізіологічних параметрів усіх організмів. Для дріжджів, як і для більшості мікроорганізмів, глюкоза є кращим джерелом вуглецю та енергії. Тому не дивно, що глюкоза, найбільш поширений в природі моносахарид, є важливим месенджером для клітин, який впливає на ріст та розвиток цих організмів шляхом регулювання генної експресії, переважно, але не виключно, на рівні транскрипційного контролю. Аналіз геномної транскрипції показав, що значна кількість генів регулюється визначуваними навколишнім середовищем рівнем глюкози. Гени з відомою метаболічною функцією в утилізації глюкози, такі як низькоафінні транспортери глюкози та гліколітичні ферменти, а також гени, що кодують рибосомальні протеїни, індукуються глюкозою. З іншого боку, глюкоза пригнічує велику кількість генів, включаючи гени, які беруть участь в утилізації альтернативних джерел вуглецю, глюконеогенезі, гліоксилатному циклі, пероксисомальних функціях та диханні. Пригнічення дихання (ефект Кребтрі) відбувається лише у кількох видів дріжджів (ферментуючі дріжджі, Кребтрі-позитивні), таких як Saccharomyces cerevisiae, в той час як у більшості видів дріжджів глюкоза не пригнічує дихання (Кребтрі-негативні). Хоча протягом останніх 20 років було одержано багато знань про механізми глюкозного пригнічення, переважно на основі дріжджів Saccharomyces cerevisiae, його фактичний механізм, особливо, його початкові частини розпізнавання глюкози та сигналізації, повінстю не зрозумілі. Тим не менш, 9 для кращого розуміння даної роботи, далі стисло описані кілька основних учасників пригнічення продуктів катаболізму вуглецю, описаних для S. cerevisiae. Ген SNF1 кодує Ser/Thr протеїнкіназу, яка може бути присутньою у вигляді комплексів з високою молекулярною масою у дріжджових клітинах. Він регулюється конформаційними змінами у комплексі, спричиненими фосфорилюванням регуляторної субодиниці Snf1p. На сьогодні ідентифіковані 3 апстрім-кінази (Ракір, ЕІm1р та Tos3p), які фосфорилюють і, таким чином, активують Snf1p. Його активність є абсолютно необхідною для дерепресії різноманітних генів, репресованих глюкозою. Тому не дивно, що Snf1p або гомологи у еукаріотів є в значному ступені консервативними. Білок цинкового пальця Mig1p є здатним зв'язувати промоторні ділянки різноманітних генів, репресованих глюкозою. Він діє, найімовірніше, шляхом рекрутингу загального репресорного комплекса Ssn6(Cyc8)-Tup1p. Функція Mig1p контролюється протеїнкіназою Snf1, але чітких свідчень прямого фосфорилювання немає. Mig1p локалізований у ядрі в нефосфорильованій формі. Вичерпання глюкози спричинює фосфорилювання Mig1p з наступним переміщенням до цитоплазми. При додаванні глюкози до клітин Mig1p швидко повертається до ядра та пригнічує транскрипцію. Adr1p також належить до сімейства білків цинкового пальця і, як було знайдено, є позитивним ефектором пероксисомальних протеїнів та гена ADH2, кодуючим глюкоза-репресовану алкогольдегідрогеназу II. Експресія ADR1 даунрегулюється глюкозою за допомогою циклічної AMP (сАМР)залежної протеїнкінази при високих рівнях сАМР. Основний регуляторний ефект виявляється на рівні трансляції мРНК, але спостерігалися також регуляторні ефекти на транскрипцію, а також стабільність мРНК, в залежності від досліджуваного штаму S. cerevisiae. Для великого числа генів, включаючи багато з генів, які беруть участь в дихальному газообміні, транскрипція активується на неферментованих джерелах вуглецю за допомогою комплексу Нар2/3/4/5. Для кількох генів, що беруть участь в диханні, таких як CYC1 (кодує ізо-1-цитохром с) та СOХ6 (оксидазна субодиниця VI цитохрому с) було встановлено, що Snf1 є потрібним для дерепресії після росту на глюкозі. Транскрипція НАР4 пригнічена у присутності глюкози, але показати пряму участь Нар4р або Snf1p в дерепресії не вдалося. Gcr1p є важливим білком-активатором транскрипції гліколітичних генів (наприклад, енолаза, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа). Gcr1p, разом із загальним фактором транскрипції Rap1p є головним продуктом гліколітичної генної експресії з погляду координації транскрипції і є абсолютно необхідним для високого рівня експресії. Характер геномної експресії дикого типу S. cerevisiae та мутанта дсг1, вирощуваних на різних джерелах вуглецю, виявив 53 відкриті рамки зчитування (ORFs), включаючи гени гліколізу, як Gcr1p-залежні. Цей опис деяких факторів транскрипції та шляхів Snf1p і Mig1p повинен надати певні уявлення про деяких учасників мережі глюкозної реп 94399 10 ресії. Слід відзначити, що існують інші регуляторні цикли глюкозної репресії, крім шляху SNF1p. Хоча за останні 20 років були зібрані великі знання про розпізнавання глюкози та сигналізацію, важливі запитання все ще залишаються без відповіді: якою є природа сигналу глюкози та яким чином регулюються та інтегруються відомі сигнальні шляхи. Обмежене число видів дріжджів є здатними рости на метанолі як єдиному джерелі вуглецю та енергії. Вони належать до одного з чотирьох родів Pichia, Hansenula, Candida та Torulopsis і мають спільний шлях утилізації метанолу, який експресується після дерепресії або індукції метанолом (див. 1,3,1). Оскільки початкові реакції цього шляху компартменталізовані у пероксисомах, ці органели також індукуються. Завдяки сильній індукції пероксисом, дріжджі Candida boidinii, Pichia methanolica, Pichia pastoris та Hansenula polymorpha часто використовувалися в клітинній біології для досліджень біогенезу та функції пероксисом. Як згадувалося вище, метилотрофні дріжджі мають спільний шлях утилізації метанолу. Першою стадією є окиснення метанолу до формальдегіду та перекису водню, каталізоване алкогольоксидазами (АОХ, EC 1,1,3,13). Токсичний Н2О2 знешкоджується до кисню та води дією каталази. Обидва ферменти секвестровані у пероксисомах. Формальдегід або окиснюється дегідрогеназою за допомогою двох послідовних реакцій або асимілюється в клітинний метаболізм шляхом конденсації з ксилулоза-5-фосфатом (Xu5Р). Формальдегід окиснюється до форміату і далі до двоокису вуглецю глутатіон (68Н)-залежною формальдегіддегідрогеназою та форміатдегідрогеназою, які обидві локалізовані в цитозолі. NADH, генерований в обох реакціях, використовується для виробляння енергії для росту на метанолі. Реакція конденсація відбувається в пероксисомах і каталізована вищезгаданою транскетолаза-дигідроксиацетонсинтазою. Утворювані при цьому С3-сполуки дигідроксиацетон (DHA) та гліцеральдегід-3-фосфат (GAP) далі метаболізуються в цитозолі. Після фосфорилювання DHA, фруктоза-1,6-бісфосфат (FBP) утворюється шляхом альдолазної реакції дигідроксиацетонфосфату (DHAP) та GAP. FBP перетворюється на фруктоза-6-фосфат фосфатазою, а ксилулоза-5-фосфат (Xu5Р) регенерується у пентозофосфатному шляху. Третина генерованого GAP надходить до шляху глюконеогенезу для синтезу складових клітин. Ключові ферменти шляху утилізації метанолу, алкогольоксидаза та форміатдегідрогеназа, продукуються з дуже високими рівнями після індукції метанолом. Алкогольоксидаза може забезпечувати більш ніж 30% загального розчинного протеїну, дигідроксиацетонсинтаза та форміатдегідрогеназа - до 20%. Пероксисоми, які також індукуються, можуть складати приблизно 80% об'єму клітини. Промоторні послідовності декількох генів утилізації метанолу були розроблені для рекомбінантного продукування протеїну. Поміж іншого, ці сильні та індуцибельні промотори є головною причиною широкого використання Pichia pastoris та Hansenula polymorpha як хазяїв для продукування білка. 11 У Н. polymorpha та С boidinii алкогольоксидазу кодує один ген: МОХ (метанолоксидаза, Н. polymorpha) та AOD1 (алкогольоксидаза, С. boidinii). 2 гени були знайдені в двох видах Pichia P. pastoris (АОХ1 та АОХ2) та P. methanolica (AUG1 та AUG2, ген утилізації алкоголю, або MOD1 та MOD2), причому АОХ1р та AUG1p є основною алкогольоксидазою. Порівняння кодуючих ділянок виявило 73-85% подібність на амінокислотному рівні між метилотрофними дріжджами [1]. Гомологія між ORFs (відкриті рамки зчитування) P. pastoris АОХ1 та АОХ2 становить 92% та 97% на рівнях нуклеотидної та амінокислотної послідовностей, відповідно [2, 3]. Алкогольоксидаза є октамерним флавопротеїном, що містить один нековалентно зв'язаний FAD або модифікований аналог (mFAD) на субодиницю. Трансляція АОХ відбувається на вільних рибосомах з наступним посттрансляційним імпортом в пероксисоми. Переміщення в пероксисоми забезпечується зв'язуванням з PTS1 (сигнал націлювання пероксисом типу 1) послідовністю на її С-кінці. Аох-олігомери утворюються тільки після імпорту в пероксисомальний матрикс. У С. boidinii та P. pastoris не було виявлено Аох-олігомерів у цитозолі на відміну від дигідроксиацетонсинтази, яка утворює димер в цитозолі перед її перенесенням до пероксисомального матриксу. Не лише промоторна послідовність алкогольоксидази 1 Pichia pastoris, але і фермент представляють інтерес для у біотехнології завдяки широкому спектру субстратів (ненасичені та насичені первинні спирти з довжиною ланцюга від короткого до помірного) та високій стабільності в різних реакційних умовах. Регуляція усіх алкогольоксидазних генів відбувається на транскрипційному рівні, найімовірніше, на стадії ініціації транскрипції. Хоча АОХ1 та AOX2 регулюються аналогічно (мРНК не детектується на гліцерині або глюкозі, детектується у фазі вуглецевого голодування, високий вміст на метанолі), їх 5-фланкуючі ділянки не виявляють значної гомології [2, 4]. Кожний локус АОХ має гаданий сайт зв'язування РНК-полімерази (ТАТААА; рамка ГолдбергаХогнеса або ТАТА-бокс) в положенні -43 по відношенню до первинного сайта ініціації транскрипції. Обидві мРНК лідерні послідовності Р. pastoris АОХ мають дуже високий вміст А залишків і є незвичайно довгими для дріжджів (115 нуклеотидів (nt) у АОХ1 та 160 nt у АОХ2). Ділянки ініціації трансляції навколо старт-кодона ATG (послідовність Козака; АОХ1: CGAAACG ATG GCT, АОХ2: GAGAAAA ATG GCC) узгоджуються з раніше описаними консенсусними послідовностями для S. cerevisiae та вищих еукаріотів. Фізіологічна роль другого алкогольоксидазного гена у P. pastoris та P. methanolica залишається незрозумілою. Руйнування АОХ1 або AUG1 спричинює тяжкі дефекти росту у цих штамів (так званий фенотип повільної s утилізації метанолу (Mut )), у той час як штами аох2 та аug2 виявляють швидкість росту, порівнянну зі штамом дикого типу. 9 множинних форм алкогольоксидази спостерігалися у P. methanolica, які представляють випадкову олігомеризаці. 2 генних продуктів Aug1p та Aug2p. AUG1 та AUG2 є 94399 12 диференційно регульованими: при вуглецевому голодуванні та низькій концентрації метанолу тільки Aug1p може бути детектований, і при зростанні концентрації метанолу співвідношення Aug2p до Aug1p збільшується. Зсув до октамерів з підвищеним вмістом Aug2p викликаний зростанням експресії AUG2, регульованій на транскрипційному рівні. Значення Km для метанолу двох гомооктамерів Aug1p та Aug2p становлять приблизно 0,56 та 5,6 мМ, відповідно. Разом з тим результатом, що руйнування AUG1 спричинює дефект росту при низьких концентраціях метанолу [5], ці результати свідчать про те, що AUG2 є перевагою для P. methanolica при вирощуванні з вищими концентраціями метанолу. Для Pichia pastoris не була детальніше проаналізована роль гена АОХ2, і не були визначені сприятливі умови для володіння другим геном алкогольоксидази. Оскільки лабораторні умови представляють лише дуже малу частину умов, з якими зустрічаються мікроорганізми у вільних умовах, у природі повинні існувати ситуації, коли ген АОХ2 матиме селективну важливість для Р. pastoris. Експресія AOD1 С. boidinii та МОХ Н. polymorpha суворо репресується при вирощуванні на глюкозі або етанолі як єдиному джерелі вуглецю, дерепресується на гліцерині та сильно індукуються на метанолі. Експресія цих двох ферментів also репресується, коли глюкоза та метанол присутні у середовищі. Якщо присутній гліцерин, то метанол є здатним індукувати генну експресію. Транскрипція AOD1 та МОХ також дерепресується при вуглецевому голодуванні та репресується у присутності етанолу [6-9]. Два окремих регуляторних механізми відповідають за репресію метаболізму утилізації метанолу етанолом або глюкозою [10, 11]. У Pichia pastoris ситуація істотно відрізняється: АОХ1 репресується, коли у середовищі присутні глюкоза, етанол або гліцерин (в концентраціях, що не обмежують ріст). Дерепресія при вуглецевому голодуванні та індукція метанолом є подібними до AOD1 та МОХ. Джерелами вуглецю, при яких експресія АОХ1 дерепресується є, наприклад, сорбіт, маніт, трегалоза та аланін [12]. При переході від метанолу до репресуючого джерела вуглецю, такого як глюкоза або етанол, пероксисоми деградують за кілька годин під час адаптації до нового джерела вуглецю. Протеолітична деградація у вакуолі дріжджів також відбувається за двома різними механізмами при адаптації до глюкози або етанолу, які називають мікро- та макроаутофагією, відповідно. Як згадувалося вище, метилотрофні дріжджі Pichia pastoris та Hansenula polymorpha широко використовуються для рекомбінантного продукування білка. Досі, більш ніж 500 білків продукували у P. pastoris. Стимулом для їх розробки були кілька характеристик, що забезпечують їхню перевагу поміж хазяїв для рекомбінантної експресії: 1) вони мають спільні для дріжджів переваги з погляду генетичних маніпуляцій та технології культивації (лабораторної та великомасштабної); 2) здатність рости до надзвичайно високої щільності клітин; та 3) високий рівень продукування рекомбінантного протеїну (секретованого або внутрішньоклітинно 13 го). Сильні індуцибельні промотори генів, що кодують реакції шляху утилізації метанолу були розроблені для продукування рекомбінантного білка. Найчастіше використовуваними є промоторні ділянки генів алкогольоксидази AOX1 та МОХ P. pastoris та Н. polymorpha, відповідно. Але для здійснення продукування рекомбінантного білка використовувалися також інші промоторні ділянки генів шляху утилізації метанолу: промотори FMD (форміатдегідрогеназа) та DAS1 (дигідроксиацетонсинтаза) є Н. polymorpha та С. boidinii та промотор FLD1 (формальдегіддегідрогеназа) у P. pastoris. Останній може бути також індукований метиламіном як єдиним джерелом азоту з глюкозою як джерелом вуглецю. Промотори конститутивної експресії чужорідних генів також є доступними: промоторнй елемент GAP (гліцеральдегід-3фосфатдегідрогеназа) у P. pastoris та промотор + РМА1 (що кодує Н -АТФазу плазматичної мембрани) у Н. polymorpha. Кілька комбінацій ауксотрофний штам-хазяїн/маркерний ген було розроблено для P. pastoris (наприклад, HIS4) та Н. polymorpha (наприклад, LEU2 та URA3). Домінантні селектовані маркери також є доступними (наприклад, Зеоцин, стійкість до G418). Інтеграція гена в метилотрофні дріжджі здійснюється переважно (якщо не виключно) шляхом гомологічної інтеграції. Вектори, що несуть ділянку ARS (автономно реплікована послідовність) також є доступними, але вони є звичайно дуже нестабільними при знятті тиску добору, що приводить до їх обмеженої технологічної застосовності. У P. pastoris чужорідний ген інтегрується сайт-специфічно в локус AOX1 або HIS4. Іншими можливими сайтами інтеграції є, наприклад, локус GAP (для експресії GAP) або локуси будь-якого іншого селектованого маркера (наприклад, ADE1, URA3, ARG4 та LEU2). У Н. polymorpha касети експресії випадковим чином інтегровані за схемою голова-до-хвоста, що приводить до мітотично стабільних iнтегрантів з високими числом копій (до 100). Однак, високе число копій часто не приводить до високого рівня експресії. Додатковими факторами, що мають великий вплив, є: структура касети інтеграції, природа та структура протеїну, що має бути експресований та сайт інтеграції. Особливо великий вплив на ефект дози гена має структура касети інтеграції. Подальше обговорення питання оптимізації касети експресії та дози гена наведене в [13, 14]. Метилотрофні дріжджі належать до групи Кребтрінегативних дріжджів, таким чином, продукування етанолу відбувається на дуже низькому рівні при вирощуванні в аеробних умовах. Завдяки цьому факту ці дріжджі можуть вирощуватися до дуже високої щільності клітин в культурах ферментера, даючи дуже високий вихід продукту. Продукування білка під контролем AOX1 може бути далі підвищене в 3-5 разів, якщо концентрація метанолу в біореакторі находиться в сферах обмеженого росту. Той факт, що P. pastoris секретує в стандартних умовах лише низькі кількості ендогенних білків, робить кожний секретований рекомбінантний білок найбільш поширеним у середовищі. Секреція може служити суттєвим першим кроком у процесі подальшого очищення. Для секреції білка, лідерна 94399 14 рrерrо-послідовність MF1 S. cerevisiae (фактор парування ) та послідовності, похідні від кислої фосфатази (РНО1), широко використовуються у Р. pastoris та Н. polymorpha. В деяких випадках достатня секреція була одержана для рослинних, грибкових та протеїнів ссавців, що несуть свої природні сигнали секреції. Як згадувалося вище, дріжджі є здатними здійснювати посттрансляційні модифікації, такі як утворення дисульфідного зв'язку, процесинг сигнальної послідовності (наприклад, лідерної prepro-послідовності MFa1), приєднання ліпіду та N- та О-зв'язане глікозилювання. Якщо у клітинах ссавців утворюються дуже складні N- та О-зв'язані олігосахаридні структури, які складаються з різноманітних цукрів (наприклад, Nацетилглюкозамін, галактоза та сіалова кислота), більшість дріжджів генерують структури з високим вмістом манози, у яких відсутні деякі цукрові фрагменти, такі як галактоза або сіалова кислота. Ці структури, не характерні для ссавців, можуть викликати тяжкі проблеми для терапевтичного застосування, переважно внаслідок їх високої потенційної імуногенності. У Н. polymorpha та P. pastoris, на відміну від S. cerevisiae, гіперманозилювання є менш вираженим і N-зв'язані олігосахариди не включають гіперімуногенних кінцевих 1,3-зв'язаних маноз. Для подолання проблем імуногенності (і деяких інших, таких як низька стабільність у кровотоці) прикладаються зусилля з метою гуманізації олігосахаридних структури дріжджового походження, та, як видно з літератури за останній час, особливо у P. pastoris. Досі, переважна більшість досліджень та комерційних процесів покладалися на добре відомі дріжджі S. cerevisiae. Завдяки зростанню знань про незвичайні дріжджі, разом з очевидними перевагами з погляду великомасштабної ферментація та глікозилювання, Н. polymorpha та Р. pastoris швидко перетворюються на кращі дріжджі. Це підтверджується тим фактом, що декілька виробничих процесів вже впроваджено у промисловості. У WO 02/081650 розкрита ідентифікація промоторних ділянок АОХ1, які можуть бути використані для конструювання мутантних промоторів АОХ1. Оскільки видалені ділянки послідовності промотора АОХ1, розкриті тут, є дуже довгими, можна спостерігати акумульований ефект, а не одиничні ефекти окремих регуляторних послідовностей промотора. Однак, такий підхід не дозволяє розробляти дуже посилені промотори. Знання точного положення меж регуляторної послідовності особливо потрібно при конструюванні нових промоторів з посиленими ознаками шляхом делеції або дуплікації частин вихідного промотора. Метою даного винаходу є створення удосконаленого промотора АОХ1 з посиленими властивостями з метою сприяння подальшому процесингу при продукуванні білка, збільшення питомого виходу на одиницю часу та об'єму та допомоги підвищення якості продукту. Іншою метою є створення сильного промотора АОХ1 у векторі або штамі-хазяїні, який запобігає частково або повністю глюкозній репресії. Було б бажаним мати промотор, який забезпечує сильну 15 експресію в присутності високих концентрацій глюкози. Наступною метою даного винаходу є створення промотора АОХ1, який дозволяє продукування білка з використанням зменшеної кількості метанолу або без метанолу. Такі промотори матимуть значний вплив на процеси промислового виробництва. Через питання безпеки для виробничих установок з використанням метанолу як індуктора потрібно спеціальне обладнання. Це суперечить застосуванню Pichia pastoris на багатьох менш спеціалізованих виробничих установках. На додаток, стабільність білка в присутності метанолу може заважати основаній на використанні метанолу індукції білкової експресії. Це є менш критичним для відпрацьованих методів продукування промислових білків, але стає великою проблемою, наприклад, для секретованих терапевтичних білків. Конструювання таких промоторів потребує знання конкретних частин (наприклад, регуляторні елементи, сайти зв'язування фактора транскрипції) промотора АОХ1 Pichia pastoris дикого типу, які - у випадку якої-небудь мутації - виявляють вплив на експресійну поведінку. Тому метою даного винаходу є ідентифікація цих ділянок та забезпечення тим самим засобів для створення промоторів AOX1 з посиленими ознаками. Таким чином, даний винахід стосується мутантного промотора алкогольоксидази 1 (AOX1) Pichia pastoris промотора AOX1 Pichia pastoris дикого типу (SEQ ID No. 1), який включає щонайменше одну мутацію, вибрану з групи, що складається з: a) сайт зв'язування фактора транскрипції (TFBS), b) нуклеотидів 170-235 (-784 - -719), нуклеотидів 170-191 (-784 - -763), нуклеотидів 192-213 (-762 - -741), нуклеотидів 192-210 (-762 - -744), нуклеотидів 207-209 (-747 - -745), нуклеотидів 214-235 (740 - -719), нуклеотидів 304 дo 350 (-650 - -604), нуклеотидів 364-393 (-590 - -561), нуклеотидів 434508 (-520 - -446), нуклеотидів 509-551 (-445 - -403), нуклеотидів 552-560 (-402 - -394), нуклеотидів 585617 (-369 - -337), нуклеотидів 621-660 (-333 - -294), нуклеотидів 625-683 (-329 --271), нуклеотидів 736741 (-218 - -213), нуклеотидів 737-738 (-217 - -216), нуклеотидів 726-755 (-228 - -199), нуклеотидів 784800 (-170 - -154) або нуклеотидів 823-861 (-131 - 93) Seq ID No. 1 та їх комбінацій. (Від'ємні) числа в дужках в опису відображають відповідні положення промотор по відношенню до старт-кодону трансляції (наприклад, ATG). Наприклад, "А" в "ATG" у послідовності нуклеїнової кислоти, що включає NxGACTATGNy, відповідає положенню +1, у той час як "Т" перед "А", що входить до складу "ATG", відповідає положенню -1. Відповідно до даного винаходу, мутантний промотор АОХ1 включає щонайменше одну мутацію в сайті зв'язування фактора транскрипції та/або один з вищевказаних інтервалів послідовності нуклеїнової кислоти. Виявилося, що ці ділянки промотора АОХ1 є особливо придатними для модифікації зазначеного промотора з метою зміни його характеристик. Звичайно, може бути введена також комбінація вищевказаних мутацій для посилення характерних ознак промотора АОХ1 (напри 94399 16 клад, дві TFBS мутації, вибрані з а), одна TFBS мутація, вибрана з а) та одна мутація, вибрана з b), одна мутація, вибрана з а) та дві мутації, вибрані з b)). Наприклад, мутація TFBS може бути поєднана з мутацією у нуклеотидах 737-738 (-217 -216) та/або нуклеотидах 207-209 (-747 - -745) Seq ID No. 1. Експресія білка під контролем промотора АОХ1 у Pichia pastoris індукується загалом шляхом додавання метанолу та інгібується присутністю глюкози у середовищі. Для того, щоб посилити або зменшити ефект зазначених добавок до середовища на експресію білка, промотор краще мутують на промоторних ділянках, як вказано вище. Ефективність мутованих промоторів АОХ1 з продукування потрібного білка змінюється в залежності від кількості (тобто, копій) вектора, інтегрованого в хромосому хазяїна. Виявилося, що мультикопійні штами мають особливо посилені промоторні ефекти. Оскільки резистентність до антибіотика штамів Pichia залежить від числа касет резистентності до антибіотика (вектори, введені хазяїну, краще включають касету резистентності до антибіотика, що дозволяє хазяїну рости на/у середовищі, що містить антибіотик як селективний маркер), інтегрованих в хромосому зазначеного хазяїна, мультикопійні штами можуть бути продуковані шляхом застосування зростаючих концентрацій антибіотика (в інтервалі 10 мкг/мл - 10 мг/мл, краще, 50 мкг/мл - 1000 мкг/мл; в залежності від використаного антибіотика; наприклад, генетицин: 0,1-10 мг/мл, краще 0,2-5 мг/мл, особливо 0,25-4 мг/мл, зеоцин: 10-5000 мкг/мл, краще 50-3000 мкг/мл, особливо 100-2000 мкг/мл) на селективних агарових пластинах для збільшення тиску добору (наприклад, [14]; Scorer, C.A. et al. (1994) Bio/Technology 12:181-184). Однак, було знайдено, що ріст клітин, які несуть множину касет резистентності до антибіотика, залежить не лише від концентрації антибіотика, але й від часу. Таким чином, мультикопійні штами є здатними вирости до детектованої колонії на середовищі, що містить таку саме концентрацію антибіотика, за більш короткий період часу, ніж одноколійні штами. Ця поведінка дає можливість фахівцю в цій області техніки детектувати та виділяти мультикопійні штами до початку росту одноколійних штамів. Наприклад, штам, який містить одну одноколійну касету резистентності до антибіотика, росте на агаровій пластині до детектованого розміру колонії за 72 год., у той час як той самий штам, що містить більш ніж одну копію зазначеної касети, росте до такого саме розміру за 24-48 год. Зокрема, мультикопійні штами, що містять промотор АОХ1 з мутаціями у нуклеотидах 694723 (-260 - -231) та у нуклеотидах 737-738 (-217 - 216), показали несподівано підвищені швидкості експресії. Для підвищення ефективності експресії білка у хазяїна в присутності метанолу, нуклеотиди 170235 (-784 - -719) промотора АОХ1 (SEQ ID No. 1) краще мутують. Мутація в цій ділянці підвищує експресію білка до 120-130% у порівнянні з промотором АОХ1 дикого типу, за умови, що плазміда, яка несе мутантний промотор АОХ1, лише раз інтегрована в хромосому/геном хазяїна (одноко 17 лійний мутант). Однак, мутації у всіх інших вищезгаданих ділянках знижують або не впливають на ефективність метанолу з індукції експресії білка. На відміну, мутації у промоторних ділянках промотора AOX1 дикого типу (як вказано вище) приводять - в залежності від мутації - до підвищеної та зниженої експресії білка в умовах дерепресії (наприклад, див. Таблицю 13, приклад 1). Однак, рекомбінантні штами, що несуть більш ніж одну копію мутованих промоторів AOX1, дають в результаті штами, що мають посилену активність в умовах дерепресії та індукції метанолом (мультикопійні штами, наприклад, див. Фіг. 7, приклад 2). Детальніше, мультикопійні штами, що несуть мутації у нуклеотидах 694 та 723 Seq ID No. 1 (d6), у нуклеотидах 694 та 723 (-260 та -231) Seq ID No. 1 (d6), у нуклеотидах 694 та 723 (-260 та -231) та у нуклеотидах 304 та 350 (-650 та -604) Seq ID No. 1 (d2d6), в TFBS, особливо, в Rap1, Gcr1, QA-1F, Hsf_1, ADR1, Hsf_2, Mat1MC, abaA та Нар2345, виявляють підвищену експресію в умовах дерепресії та/або при індукції метанолом у порівнянні з експресією білків під контролем промотора АОХ1 дикого типу. В умовах дерепресії деякі з цих мультикопійних штамів дають значення експресії білка, які є підвищеними приблизно в 10 разів у порівнянні з експресією під контролем промотора дикого типу. В присутності метанолу як індуктора ефективність експресії посилена більш ніж в 5 разів при використанні промотора відповідно до даного винаходу. Таким чином, ці мутації, особливо коли вони присутні в хазяїні в мультикопійній формі, краще використовуються для експресії білків. Комбінація двох чи більше вищезгаданих мутацій може далі підвищувати силу промотора (див., наприклад, Фіг. 7, приклад 2). Сайти зв'язування фактора транскрипції можуть бути ідентифіковані експериментально (наприклад, за зсувом мобільності або шляхом аналіз футпринтів) або шляхом порівняння послідовності з відомими сайтами зв'язування фактора транскрипції (наприклад, за допомогою комп'ютерного аналізу [15]). Знання промоторних ділянок, які впливають на силу та характеристики зазначеного промотора, можуть бути використані для проектування промоторів з певними властивостями (висока експресія білка в умовах дерепресії та/або висока експресія білка в присутності метанолу). Більш того, ці властивості можуть бути посилені або змінені, якщо ці мутантні промотори інтегровані один чи більше разів до геному хазяїна (наприклад, див. приклади 1-3). Однак, в деяких випадках активність промотора має бути зменшена, а не підвищена. Зокрема, ко-експресія регуляторних білків, таких як кінази, фосфорилази та хелперні білки, такі як, наприклад, шаперони, протеїндисульфідізомераза, цистранс ізомерази, фолдази (foldases), протеїндисульфідізомерази та протеази, в багатьох випадках повинна бути низькою порівняно з головним продуктом, який може продукуватися клітиною під контролем промотора дикого типу або посиленого промотора відповідно до даного винаходу. Зокрема, об'єднана експресія двох різних продуктів (на 94399 18 приклад, хелперного білка та головного продукту) під контролем промотора AOX1 з підвищеною активністю та промотора AOX1 зі зниженою активністю (у порівнянні з активністю дикого типу), відповідно, виявилася зручною, тому що швидкість експресії головного та вторинного продуктів розрізняється ще більше, ніж при використанні промоторів AOX1 дикого типу. Зменшена експресія може бути краще забезпечена шляхом делеції сайтів зв'язування активатора, таких як HSF або НАР, або шляхом вставки сайтів зв'язування репресора в промотор АОХ1 дикого типу. Таким чином, використання промотора AOX1 зі зменшеною активністю запобігає перевантаженню механізмів експресії білка клітини, наслідком якого було б зниження виходу головного продукту. Наприклад, Bessette P.H. et al. (PNAS USA (1999) 96:13703-13708) зміг показати, що експресія активного поліпептиду може бути значно збільшена за допомогою коекспресії тіоредоксину. Відповідно до кращого варіанта втілення промотор включає додаткову мутацію у нуклеотидах 694-723 (-260 - -231) та/або нуклеотидах 729-763 (225 - -191) Seq lD No. 1. Мутація, в цих ділянках нуклеотидної послідовності в комбінації з мутацією, вказаною вище, приводить до ще більшого посилення активності промотора. Наприклад, подвійна мутація, що стосується нуклеотидів 694-723 (-260 - -231) та нуклеотидів 737-738 (-217 - -216) Seq ID No. 1, приводить до одержання промотора, який виявляє вищі рівні експресії при дерепресії, а також в умовах індукції у порівнянні з рівнями експресії промотора дикого типу в таких саме умовах. Ефект цієї подвійної мутації може бути посилений, коли нуклеїнова кислота, що містить промотор, вводиться в клітину в більш ніж одній копії (з одержанням мультикопійного клону). Мутація є краще делецією, заміщенням, інсерцією, інверсією та/або мультиплікацією. Для модифікації характеристик промотора АОХ1 дикого типу Pichia pastoris several можливі кілька типів мутацій. Промоторні відрізки, що включають вищезгадані ділянки (сайти зв'язування фактора транскрипції (TFBS), нуклеотиди 170-235 (-784 - -719), 170-191 (-784 - -763), 192-213 (-762 - 741), 192-210 (-762 - -744), 207-209 (-747 - -745), 214-235 (-740 - -719), 304-350 (-650 - -604), 364-393 (-590 - -561), 434-508 (-520 - -446), 509-551 (-445 - 403), 552-560 (-402 - -394), 585-617 (-369 - -337), 621-660 (-333 - -294), 625-683 (-329 - -271), 694-723 (-260 - -231), 729-763 (-225 - -191), 736-741 (-218 - 213), 737-738 (-217 - -216), 726-755 (-228 - -198), 784-800 (-170 - -154) або 823-861 (-131 - -93) Seq ID No. 1) можуть бути частково або повністю видалені, частково або повністю заміщені на інші нуклеотиди або послідовності нуклеїнової кислоти, розірвані інсерцією окремих нуклеотидів або послідовностей нуклеїнової кислоти, інвертовані частково або повністю або мультипліковані. Всі ці мутації приводять до зміни активності промотора, тому що структурні ознаки та/або сайти розпізнавання/зв'язування, наприклад, факторів транскрипції, зазнають впливу зазначених мутацій. Однак, ці зміни можуть приводити до підвищеної або зни 19 94399 женої активності промотора у порівнянні з промотором дикого типу. З попереднього рівня техніки добре відомо, що мультиплікація/дуплікація конкретних відрізків нуклеїнової кислоти може підвищити активність промотора. Регуляція генної експресії багатьох еукаріотичних промоторів, зокрема, дріжджових промоторів, включає численні взаємодії між факторами транскрипції, зв'язаних у промоторі. Численні сайти можуть бути потрібними для функціонування навіть найменших цис-діючих елементів. В дріжджових клітинах, апстрім-послідовності активатора (UAS) є необхідними для транскрипції. Вони працюють в будь-якій орієнтації та на змінній відстані по відношенню до ТАТА-бокса та сайта початку транскрипції, але на відміну від енхансерів у вищих еукаріотах, вони повинні передувати цим базальним елементам. UAS є мішенями кількох активаторів транскрипції. Більшість явищ репресії у дріжджових клітинах виникає внаслідок інактивації або відсутності факторів транскрипції. Однак, можуть бути також ідентифіковані деякі негативні регуляторні сайти (апстрім-послідовності репресії (URS)). На основі делеціного аналізу промотора АОХ2 P. pastoris було знайдено три регуляторні ділянки, дві негативно діючі ділянки (URS1 і URS2) та позитивно діючий домен (UAS) [3]. Для промотора МОХ Η. polymorpha також були описані дві активуючі апстрім-послідовності (UAS1 та UAS2) та один сайт зв'язування репресора (URS1) [8]. Відповідні послідовності можуть бути також ідентифіковані в промоторах AOX1 (нуклеотиди 585-614 (369 - -340) та 725-756 (-229 - -198), що виявляють подібність до АОХ2 UAS [3], а також нуклеотиди 622-656 (-332 - -298) [8]). Мультиплікація (2, 3, 4, 5, 6 або 7-кратна UAS) цих відрізків нуклеїнової кислоти може привести до одержання промотора з підвищеною силою, приводячи до ще більш потужної експресії білка. Таким чином, конструкція промоторів, що включають численні UAS, краще, за участі вищезгаданих ділянок послідовності, подібних до AGX2 та МОХ UAS, або інших численних відрізків послідовності (наприклад, вищевказані інтервали послідовностей нуклеїнової кислоти) також входять до обсягу даного винаходу та вважаються кращим варіантом втілення. Активуюча 20 послідовність звичайно розташована за кілька сотень пар основ від промотора. Наприклад, більшість активуючих послідовностей розташовані за приблизно 200-400 пар основ від промотора, що є посиленим. Ще далі перед промотором звичайно розташовані додаткові енхансери та сайти зв'язування фактора транскрипції. Щонайменше одна мутація промотора АОХ1 може бути введена стандартними методами відомими фахівцю в цій області (наприклад, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Відповідно до кращого варіанта втілення даного винаходу сайт зв'язування фактора транскрипції (TFBS) вибраний з групи, що складається з Нар1, Hsf, Нар234, abaA, Stre, Rap1, ADR1, MatiMC, Gcr1 та QA-1F. Мутація щонайменше одного з цих TFBS приводить до мутантних промоторів зі змінними характеристиками (див., приклад 2). Краще, сайт зв'язування фактора транскрипції (TFBS) Hap1 включає нуклеотиди від 54 (-900) до 58 (-896) Seq ID No. 1, Hsf нуклеотиди від 142 (812) до 149 (-805) та від 517 (-437) до 524 (-430) Seq ID No. 1, Нар234 нуклеотиди від 196 (-758) до 200 (-754), від 206 (-748) до 210 (-744) та від 668 (286) до 672 (-282) Seq ID No. 1, abaA нуклеотиди від 219 (-735) до 224 (-730) Seq ID No. 1, Stre нуклеотиди від 281 (-673) до 285 (-669) Seq ID No. 1, Rap1 нуклеотиди від 335 (-619) до 339 (-615) Seq ID No. 1, ADR1 нуклеотиди від 371 (-583) до 377 (577) Seq ID No. 1, MatiMC нуклеотиди від 683 (271) до 687 (-267) Seq ID No. 1, Gcr1 нуклеотиди від 702 (-252) до 706 (-248) Seq ID No. 1 та QA-1F нуклеотиди від 747 (-207) до 761 (-193) Seq ID No. 1. Ці TFBS можуть бути ідентифіковані експериментально або шляхом порівняння з відомими TFBS інших промоторів (наприклад, промоторів еукаріотів) за допомогою комп'ютерних програм (наприклад, див. приклад 1). Стислий опис впливу мутантних промоторів АОХ1 на експресію білків, пептидів або функціональних нуклеїнових кислот наведений у таблиці 2 (у порівнянні з активністю дикого типу). Таблиця 2 Вплив мутантів промотора дикого типу АОХ1 на експресію білків, пептидів або функціональних нуклеїнових кислот Мутація Нар1 Hsf_1 1 Нар2345_1 Нар2345_2 abaA Stre 2 Однокопійний клон Умови індукції ме1 Умови дерепресїі 1 танолом + + + + + + + + Мультикопійний клон Умови індукції ме1 Умови дерепресії 1 танолом + + + + + + 21 94399 22 Продовження таблиці 2 Rap1 3 ADR1 4 Hsf_2 5 Нар2345_3 Mat1MC 6 6* Gcr1 7 QA-1F QΑ-1Fzus Hsf_2_dHap2345_1 Hsf_2_dHap2345_1zus Hsf_2_Mat1MC 8 9 26 736-41 737-38 lnD-d4m D-d4 1-1 1-2 1-3 1-Sacl 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Швидкість експресії у порівнянні з промотором АОХ1 дикого типу: - зменшена, + підвищена Інший аспект даного винаходу стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка включає мутантний промотор алкогольоксидази 1 (AOX1) Pichla pastoris відповідно до даного винаходу та нуклеїнову кислоту, що кодує білок, пептид або функціональну нуклеїнову кислоту, причому промотор та зазначена нуклеїнова кислота функціонально зв'язані разом. Мутантний промотор AOX1 може бути зв'язаний з геном, що кодує білок (наприклад, фермент), пептид (наприклад, гормон) або функціональну нуклеїнову кислоту (наприклад, siRNA). Одержаний в результаті фрагмент нуклеїнової кислоти може бути використаний для експресії, наприклад, білка при введенні в організм, краще, дріжджі, зокрема, штам Pichla pastoris. Конструювання зазначеної молекули нуклеїнової кислоти є добре відомим фахівцю в цій області техніки та може бути здійснене стандартними молекулярнобіологічними методами (наприклад, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press; посібник "Pichia Expression Kit", Invitrogen Corp.). "Функціонально зв'язаний" стосується першої послідовності (послідовностей), розташованої достатньо проксимально до другої послідовності (по слідовностей), так що перша послідовність (послідовності) може чинити вплив на другу послідовність (послідовності) або область, що находиться під контролем цієї другої послідовності. Наприклад, промотор може бути функціонально зв'язаним з геном таким чином, що ген буде експресуватися під контролем промотора, який буде типово розташований з 5'-кінця гена. Звичайно, ядро промотора буде розташовано за кілька сотень пар основ від сайта початку трансляції. Приблизно в 30 п.о. (bр) далі звичайно находиться даунстрімпромоторний елемент. Інший аспект даного винаходу стосується вектора, який включає мутантний промотор алкогольоксидази 1 (АОХ1) Pichia pastons відповідно до даного винаходу або молекулу нуклеїнової кислоти, як вказано вище. Для введення мутантного промотора, необов'язково, функціонально зв'язаного з нуклеїновою кислотою, що кодує білок, пептид або функціональну нуклеїнову кислоту, в хазяїна, краще, в штам метилотрофних дріжджів (наприклад, штам Pichia pastons), зазначений промотор повинен бути забезпечений у векторі, який може бути використаний для трансформації зазначеного хазяїна. Наприклад, зазначені вектори можуть бути епісомальними плазмідами дріжджів (YEp), інтег 23 ративними плазмідами дріжджів (YIp) або штучними хромосомами дріжджів. Такі вектори включають звичайно початок реплікації (якщо ампліфікація в мікробному хазяїні є потрібною) та селектований маркер для розмноження векторів у Е. coli, промотори та термінатори для експресії рекомбінантного білка в дріжджах та селектовані маркери для дріжджів. He-інтегративні вектори далі включають автономну реплікативну послідовність (ARS), яка забезпечує стабільність вектор у клітині (наприклад, Myers, A. M., et al. (1986) Gene 45: 299-310). Інтегративні вектори, що не містять AR послідовності, включають ділянки послідовності, які є гомологічними до ділянок геному. Альтернативно, для трансформації може бути використана лінійна ДНК, наприклад, одержана методом ПЛР. Інший аспект даного винаходу стосується клітини, яка включає щонайменше один мутантний промотор алкогольоксидази 1 (AOX1) Pichia pastoris, щонайменше, один фрагмент нуклеїнової кислоти або щонайменше один вектор, розкритий тут. Введення молекули нуклеїнової кислоти, що містить мутантний промотор AOX1 (наприклад, вектор, де промотор є функціонально зв'язаним з нуклеїновою кислотою, що кодує білок) в хазяїна може бути здійснене, наприклад, шляхом електропорації. Зазначена молекула нуклеїнової кислоти інтегрована в хромосому після її введення в зазначеного хазяїна в одній або в численних копіях або присутня у клітині як одноколійна або мультикопійна автономна реплікативна плазміда. Якщо використовується кілька мутантних промоторів, вони можуть бути всі зв'язані з одним геном (що кодує білок або функціональну нуклеїнову кислоту (наприклад, рибозим, антисмислова РНК тощо), ідентичним білком або різними білками (наприклад, 1 варіант промотора зв'язаний з селектованим маркером, а інший мутантний промотор зв'язаний з іншим білком, що має експресуватися). Таким чином, в межах обсягу даного винаходу краще продукують одноколійні штами, які включають одну копію промотора AOX1, функціонально зв'язану з нуклеїновою кислотою, що кодує білок, пептид або функціональну нуклеїнову кислоту, а також мультикопійні штами, що включають більш ніж одну, краще, щонайменше 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 або 20 копій промотора АОХ1, функціонально зв'язаних з нуклеїновою кислотою, що кодує білок, пептид або функціональну нуклеїнову кислоту. Відповідно до кращого варіанта втілення даного винаходу, зазначена клітина є еукаріотичною клітиною, зокрема, дріжджовою клітиною, краще, метилотрофною дріжджовою клітиною. Краще, метилотрофну дріжджову клітину вибирають з групи, що складається з Candida, Hansenula, Pichia та Toruplosis, особливо, клітин Pichia pastoris. Промотори АОХ1, а також його мутовані варіанти можуть бути функціонально введені дуже великому чмслу різних дріжджових клітин, включаючи метилотрофні (наприклад, Pichia pastoris) та неметилотрофні (наприклад, Saccharomyces cerevisiae) клітини. Переносимість промоторів ін 94399 24 шим організмам, зокрема, промоторів АОХ1 та МОХ, є відомим фахівцям в цій області техніки. Хоч специфічність до субстрату та деякі регуляторні ознаки є різними у різних дріжджів (наприклад, Pichia pastoris, Hansenula polymorphs та Saccharomyces cerevisiae), було продемонстворано розпізнавання чужорідних промоторів (наприклад, Raschke, W.C, et al., Gene, 1996. 177:163-7; Pereira, G.G. та СР. Hollenberg, Eur J Biochem, 1996. 238:181-91). Наприклад, промотор МОХ Η. polymorpha розпізнається в S. cerevisiae, репресованих в присутності глюкози та дерепресованих в умовах обмеження джерела вуглецю. Аналогічно, промотор AOX1 може бути використаний у Н. polymorpha та регулюється у такий саме спосіб, як промотор МОХ. Промотор ZZA1, близько споріднений з промотором АОХ1, може бути також успішно використаний в S. cerevisiae. Інший аспект даного винаходу стосується набору для експресії вибраного білка або транскрипції до функціональної РНК, який включає і) вектор, як визначено вище, та іі) клітину, здатну експресувати зазначений білок або функціональну РНК під контролем промотора відповідно до даного винаходу. Вектор відповідно до даного винаходу може бути використаний в наборі для експресії вибраного білка або транскрипції функціональної РНК (наприклад, рибозиму, антисмислової РНК, РНКі). Відповідно до кращого варіанта втілення даного винаходу, зазначена клітина є дріжджовою клітиною, краще, метилотрофною дріжджовою клітиною. Краще, метилотрофну дріжджову клітину вибирають з групи, що складається з Candida, Hansenula, Pichia та Toruplosis, зокрема, з клітин Pichia pastoris. Інший аспект даного винаходу стосується способу експресії рекомбінантного білка, пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти у клітині, який включає такі стадії: - забезпечення вектора або молекули нуклеїнової кислоти, що включає промотор АОХ1 відповідно до даного винаходу та нуклеїнову кислоту, що кодує білок, пептид або функціональну нуклеїнову кислоту, причому зазначений промотор функціонально зв'язаний із зазначеною нуклеїновою кислотою, - трансформацію зазначеної клітини зазначеним вектором або зазначеною молекулою нуклеїнової кислоти, - культивацію трансформованої клітини у придатному культуральному середовищі, - необов'язково, індукцію експресії зазначеного білка, пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти, та - виділення зазначеного експресованого білка, пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти. Відповідно до кращого варіанта втілення даного винаходу, зазначен клітина є дріжджовою клітиною, краще, метилотрофною дріжджовою клітиною. Краще, метилотрофну дріжджову клітину вибирають з групи, що складається з Candida, Hansenula, Pichia та Toruplosis, зокрема, з клітин 25 Pichia pastoris. Інший аспект даного винаходу стосується використання молекули нуклеїнової кислоти, вектора або клітини відповідно до даного винаходу для експресії білка, пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти. Якщо молекула нуклеїнової кислоти, вектор або клітина відповідно до даного винаходу використовується для експресії білка, пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти, то краще вибирають відповідний промотор АОХ1, який задовольняє вимогам, що висуваються до експресії (наприклад, висока або конститутивна експресія в умовах дерепресії (= без додавання глюкози до середовища) або в умовах індукції метанолом). Придатні мутантні промотори АОХ1 можуть бути вибрані за допомогою таблиці 2. Інший аспект даного винаходу стосується способу виділення суперекспресивних клонів, який включає стадії: a) введення молекули нуклеїнової кислоти або вектора, що включає мутований індуцибельний метанолом промотор, краще, промотор АОХ1, функціонально зв'язаний з нуклеїновою кислотою, що кодує білок, або з функціональною нуклеїновою кислотою та маркерним геном резистентності, в клітину, b) перенесення клітини зі стадії а) до середовища, що включає відповідний селективний маркер, не-репресуюче джерело вуглецю та метанол для селективного росту суперекспресивних клонів в умовах індукування або до середовища, що включає придатний селективний маркер та нерепресуюче джерело вуглецю без метанолу для селективного росту суперекспресивних клонів в умовах дерепресії, c) інкубації клітини зі стадії b) на зазначеному середовищі, d) виділення колонії клітин, одержаних на стадії с), та e) детектування суперекспресивних клонів шляхом визначення швидкості експресії зазначеної клітини. Конструювання супер- або високоекспресивних клонів, які містять вектор або нуклеїнову кислоту, що включають мутований індукований метанолом промотор потребує методів, які б давали змогу фахівцю в цій області техніки виділяти ці клони. Такий спосіб пропонується тут. Першою стадією зазначеного способу є введення промотора, що включає нуклеїнову кислоту (наприклад, вектор) в придатну клітину, здатну регулювати зазначений промотор. Власне промотор може бути мутований за допомогою генетичної інженерії або хімічного (наприклад, бісульфіт, нітрит, фумарова кислота, гідразин) або фізичного (наприклад, випромінювання, зокрема, УФ-випромінювання) мутагенезу. На наступній стадії клітини, що містять зазначений мутований промотор, переносять до середовища, краще, до твердого середовища, безпосередньо або через рідке середовище, що містить антибіотик (наприклад, зеоцин) та сорбіт (або інше не-репресуюче джерело вуглецю, таке як описано, наприклад, у [12], зокрема, аланін, маніт або трегалоза) для вирощування високоекспресивних клонів в умовах дерепресії і яке додат 94399 26 ково включає метанол, якщо високоекспресивні клони мають бути одержані в умовах індукції. Шляхом включення глюкози до середовища разом з метанолом можуть бути виділені нерепресовані глюкозою та індуковані метанолом трансформанти (щоб запобігти випаровуванню метанолу середовище може зберігатися під час інкубації в атмосфері, насиченій метанолом, або такій, що містить метанол). Після культивації клітин в або на придатному середовищі, зазначені клітини виділяються із зазначеного середовища і можуть бути використані для подальшого аналізу (наприклад, визначення точної швидкості експресії, виділення промотора з метою аналізу змін у послідовності нуклеїнової кислоти промотора у порівнянні з промотором дикого типу). Не-репресуючі джерела вуглецю, використовувані у способі відповідно до даного винаходу та розкриті, наприклад, в [12], краще використовуються в кількості 0,1-10%, краще, в кількості 0,2-5%, ще краще, в кількості 0,33%, зокрема, в кількості 0,5-1%. Краще нерепресуюче джерело вуглецю вибирають з групи, що складається з аланіну, маніту, сорбіту, трегалози, лактози та їх комбінацій. Вибір придатного маркера гена резистентності залежить від маркера, використовуваного для добору трансформантів. Наприклад, якщо зеоцин використовується як маркер, то маркером гена резистентності, що має бути введений в вектор під контролем мутантного промотора АОХ1, є ген Sh ble. Якщо нуклеїнова кислота кодує білок або пептид, то утворюваний/експресований білок може бути злитим білком. Особливо краще забезпечити маркер гена резистентності під контролем мутантного промотора AOX1, оскільки в цьому випадку швидкість експресії продукту маркерного гена резистентності залежить також від сили промотора та поведінки мутованого промотора. Наприклад, сильний промотор, відповідальний за високу експресію продукту нуклеїнової кислоти буде також збільшувати швидкість експресії генного продукту маркера резистентності. Такі клони мають селективну перевагу над клонами з промотором, що виявляє зменшену силу промотора. Це дозволяє забезпечити вибір суперекспресивних клонів безпосередньо після регенерація від трансформації клітин. Швидкість експресії краще визначається такими методами, як електрофорез на гелі (наприклад, SDS-PAGE), зв'язування антитіла (наприклад, ELISA), кількісна (зворотно-транскриптазна) ПЛР (наприклад, RT-PCR в реальному часі), ферментативна активність (наприклад, якщо експресований білок є ферментом) або флуорометрично (протеїн з характеристичним спектром випромінювання, такий як зелений флуоресцентний білок). Промотори (трансформанти), що виявляють підвищену експресію за відсутності інакше репресуючих С-джерел (у випадку промотора АОХ1 глюкоза) вибирають шляхом селективного вирощування трансформованих клітини в/на середовищі, що містить нерепресуюче джерело вуглецю. Промотори (трансформанти), що виявляють підвищену експресію за відсутності інакше репресуючих С-джерел (у випадку промотора АОХ1 - глюко 27 за) в присутності індуктора (наприклад, метанол) вибирають шляхом селективного росту трансформованих клітин в/на середовищі, що містить нерепресуюче джерело вуглецю та індуктор (наприклад, метанол). Індуктор може також бути нерепресуючим джерелом вуглецю. Суперекспресивні клони вибирають шляхом комбінації мультикопії, що забезпечує вищу резистентність проти антибіотиків (наприклад, зеоцину) або вищу продуктивність есенціального компонента середовища (наприклад, Leu, His, Arg, Ura) з описаним вище регуляторним добором. Композиції середовища для використання у способі відповідно до даного винаходу можуть бути одержані безпосередньо від виробників або дистрибьюторів з наборів, клітин та векторів, що стосуються Pichia Pastoris (наприклад, Invitrogen). Концентрація метанолу у середовищі може становити краще 0,05-15%, ще краще, 0,1-10%, зокрема, 0,3-5%. У науковій літературі описані різні концентрації метанолу для різних умов культивації. Наприклад, струшувані колби можуть містити 1% метанолу чи менше (Guarna Μ.Μ. et al. (1997) Biotech. Bioeng. 56:279-286), процеси ферментації можуть містити 0,5% метанолу (Damasceno L.M. et al. (2004) Protein Expr Purif 37:18-26; Hellwig S., et al. (2001) Biotechnol Bioeng 74:344-352; Hellwig S., et al. (1999) Biotechnol. Appl. Biochem. 30:267-275). Посилена експресія мультикопійних клонів може залежати не лише від присутності більш ніж однієї копії мутованого промотора у клітині, але також бути спричиненою тим, що існує нестача кількох факторів транскрипції, тому що ці фактори можуть бути зв'язаними з великою кількістю сайтів зв'язування фактора транскрипції у зазначеній клітині. Це можна показати шляхом порівняння швидкості експресії в умовах індукції метанолом зі швидкістю експресії в умовах дерепресії, завдяки якому можна побачити, що підвищена швидкість експресії є не лише ефектом числа копій мутованого промотора АОХ1 у клітині (відсутність лінійного ефекту). Наприклад, штам d6*F10 має такі характеристики. Середовище, використовуване для ізоляції суперекспресивних клонів, може включати додаткові компоненти середовища, такі як лейцин, урацил, аргінін, гістидин та/або аденін, і сорбіт може бути заміщений глюкозою з метою ідентифікації варіантів промотора що виявляють зменшену репресію в присутності глюкози у порівнянні з варіантами промотора дикого типу. У тих випадках, коли використовуються ауксотрофні штами, клітина може бути переміщена до середовища, що включає сорбіт (або інші нерепресивні джерела вуглецю) та містить індивідуальні компоненти середовища (наприклад, лейцин, урацил, аргінін, гістидин та аденін) для селективного росту суперекспресивних клонів в умовах дерепресії з використанням маркерів ауксотрофії (стадія b)). Звичайно використовуваний маркер резистентності P(TEF)-ZeO у векторах, що містять промотор АОХ1, приводять до конститутивної експресії білка резистентності до зеоцина і тому дозволяє виділити мультикопійні клони за резистентністю по 94399 28 відношенню до вищих концентрацій антибіотика. Описаний новий спосіб дозволяє поєднувати цей ефект з регуляторними ознаками для детектування промоторів та мультикопійних клонів, які забезпечують вищу експресію при певних контрольованих регуляторних умовах (наприклад, дерепресована експресія, індукована експресія тощо). Це робить можливим детектувати нові промотори зі зміненими регуляторними властивостями, а також клони, де мультикопійні клони забезпечують посилення експресії в таких спеціальних регуляторних умовах. "Суперекспресивні клони" є експресивними клонами, які експресують більшу кількість білка чи функціональної нуклеїнової кислоти під контролем мутованого промотора, ніж під контролем промотора дикого типу або більшу кількість білка чи функціональної нуклеїнової кислоти, ніж при застосуванні векторів зі звичайно використовуваними комбінаціями промотор-селектований маркер, такими як P(TEF)-Zeo. Швидкість експресії "суперекспресивних клонів" відповідно до даного винаходу може бути щонайменше на 20%, краще, щонайменше на 50%, ще краще, щонайменше на 100%, особливо, щонайменше на 500% збільшеною у порівнянні зі швидкістю експресії того самого білка або пептиду або функціональної нуклеїнової кислоти під контролем промотора дикого типу (середнє значення плюс 2-3-кратний стандартний відхил). "Суперекспресивні клони" можуть, краще, включати більш ніж одну копію мутованого промотора або молекули нуклеїнової кислоти відповідно до даного винаходу. Альтернативно, "суперекспресивні клони" можуть також бути названі "клонами з підвищеною експресією". Відповідно до даного винаходу, "індуковані метанолом промотори" є промоторами, активність котрих регулюється присутністю метанолу в культуральному середовищі. Такі промотори є краще промоторами АОХ1 (з Pichia pastoris) або МОХ (з Hansenula polymorpha) або будь-якими іншими метанол-індуцибельним та глюкоза-репресованим промотором, похідним з метилотрофних дріжджів, таких як, наприклад, FMD, FLD, DAS (наприклад, див. таблиця 6, приклад 1). Відповідно до кращого варіанта втілення даного винаходу, селективний маркер є антибіотиком, краще, зеоцином. Селективний маркер, призначений для використання у середовищі, залежить від того, яка молекулярна характеристика клітини може бути використана для відрізнення клітини, яка містить нуклеїнову кислоту або вектор, що включає мутований або дикого типу метанол-індуцибельний промотор, від клітини, яка не містить зазначеної нуклеїнової кислоти або вектора. Селективні маркери можуть, таким чином, бути антибіотиками (гени резистентності до антибіотика можуть бути присутні у векторі або нуклеїновій кислоті, введених до зазначеної клітини). Для компенсації ауксотрофії певних штамів селективний маркер у середовищі може бути речовиною, такою як лейцин, урацил, аргінін, гістидин та аденін, в залежності від типу ауксотрофії. 29 94399 Краще, молекула нуклеїнової кислоти, вектор та клітина є нуклеїновою кислотою, вектором та клітиною відповідно до даного винаходу. Відповідно до кращого варіанта втілення даного винаходу, молекула нуклеїнової кислоти або вектор вводять в клітину шляхом її трансформації стандартними методами, відомими фахівцю в цій області, краще, електропорацією, хімічною трансформацією, злиттям протопластів або бомбардуванням частинками (див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M. Ausubel et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Даний винахід далі ілюстрований такими фігурами та прикладами, без обмеження ними. Фіг. 1 зображує SDS-PAGE штамів P. pastoris, що експресують GFP-Zeo у мікромасштабі перед індукцією метанолом (А) та через 24 (В) та 72 (С) години після індукції. Зразки готували, як описано у прикладі 1 h). Доріжка 1 є Х-33 (негативний контs роль), Доріжки 2-4 є Х-33 GFP-Zeo штамами Mut 9, D2 та Е2, Доріжка 5 є Х-33 d6*F10. Сильна смуга при 42 кДа присутня у всіх GFP-Zeo клонах. Фіг. 2 зображує огляд делецій послідовності в промоторній області АОХ1 та деякі сайти зв'язування фактора транскрипції. Ділянки дельта1-9 були видалені методом ПЛР з перекривним подовженням (overlap extension PCR). Фіг. 3 зображує стовпчикову діаграму інтенсивності флуоресценції варіантів промотора АОХ1 в мікромасштабі після дерепресії (вуглецеве голодування). Клітини вирощували на 1% глюкозі в мікромасштабі. Дані представляють середнє+SD (стандартний відхил) для 4 незалежних вимірів. RFU: відносні одиниці флуоресценції; WT: штам P. pastoris GFP-Zeo D2 з GFP-Zeo під контролем промотора дикого типу АОХ1; D1-D9: штами P. pastoris з делеційними конструктами ΑΟΧ1 1-9 перед геном GFP-Zeo; EX. довжина хвилі збудження; ЕМ: довжина хвилі випромінювання. Фіг. 4 зображує стовпчикову діаграму інтенсивності флуоресценції варіантів промотора АОХ1 в мікромасштабі після індукції метанолом. Клітини вирощували на 1% глюкозі в мікромасштабі. Дані представляють середнє+SD для 4 незалежних вимірів. RFU: відносні одиниці флуоресценції; WT: штам P. pastoris GFP-Zeo D2 з GFP-Zeo під контролем промотора дикого типу АОХ1; D1-D9: штами 30 P. pastoris з делеційними конструктами ΑΟΧ1 19 перед геном GFP-Zeo; EX. довжина хвилі збудження; ЕМ: довжина хвилі випромінювання. Фіг. 5 зображує стовпчикову діаграму інтенсивності флуоресценції вибраних варіантів промотора AOX1 в мікромасштабі. Наведені рівні експресії в умовах дерепресії, а також індукції одноколійних штамів та мультикопійних штамів з варіантами промотора дикого типу та 6. Дані представляють середнє±SD для 4 незалежних вимірів. WT: одноколійний штам GFP-Zeo з промотором АОХ1 дикого типу (GFP-Zeo D2), D6: одноколійний клон ΑΟΧ16*; WT_E2: мультикопійний клон GFP-Zeo з промотором АОХ1 дикого типу; D6*F10: мультикопійний клон ΑΟΧ16* (X-33d6F10). Фіг. 6 показує результат краплинної проби штамів P. pastoris на MD та MDM агарових планшетах з різними концентраціями Зеоцину. Клітини вирощували на середовищі BMD (1%) до OD595 (оптична густина при 595 нм) 1,5, постадійно розводили 10-кратно до кінцевого розведення 5 10 та переносили на агарові планшети за допомогою 48-штиркового реплікатора. Числа зверху зображення позначають коефіцієнт розведення, який є однаковим для всіх планшетів. Середовище MD готували, як описано вище. Метанол на MDM-Zeo планшетах додавали до кінцевої концентрації приблизно 0,5%. Зеоцин додавали до кінцевих концентрацій 100, 200 та 500 мкг/мл, відповідно. Хs 33: P. pastoris X-33, 9: P. pastoris GFP-Zeo Mut 9, D2: P. pastoris GFP-Zeo D2, E2: P. pastoris GFP-Zeo E2. Фіг. 7 показує рівень експресії декількох мультикопійних штамів у порівнянні з еталонними штамами; а) активність в умовах дерепресії; b) активність після індукції метанолом. Фіг. 8 показує рівень експресії 6* мультикопійних штамів в умовах дерепресії та індукції у порівнянні з еталонними штамами. Приклади: Приклад 1: Матеріал та методи: а) Набори для приготування/очищення ДНК: Кілька комерційно доступних наборів для приготування та очищення ДНК були використані відповідно до наданих посібників (див. Таблиця 3). Таблиця 3 Набори для приготування та очищення ДНК Набір Easy-DNA Kit QIAprep Spin Miniprep Kit Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System GenElute High Performance (HP) Plasrnid Midi-prep Kit Germany QIAquick Gel Extraction Kit Quantum Prep Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns QIAquick PCR Purification Kit Виробник Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA QIAGEN GmbH, Hilden, Germany Promega GmbH, Mannheim, Germany Sigma-Aldrich Handels GmbH, Vienna, Austria QIAGEN GmbH, Hilden, Germany Bio-Rad Laboratories GmbH, Vienna, Austria QIAGEN GmbH, Hilden, Germany 31 b) TOPO клонування: TOPO клонування здійснюють відповідно до наданих посібників (для клонування в pCR4BluntTOPO та для клонування в pCR-Blunt II-TOPO). Для клонування завжди використовували 4 мкл продукту ПЛР. 2 та 4 мкл кожної реакції клонування трансформували в One Shot хімічно компетентні клітини Е. coli TOP10F' (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) відповідно до вищевказаних протоколів. c) Трансформація Ε. coli: Трансформацію реакцій лігування та плазмід в Е. coli здійснюють відповідно до протоколу SEM (простий та ефективний спосіб) [16]. Для трансформації використовували хімічно компетентні клітини Е. coli TOP10F'. d) Трансформація Pichia pastoris: Приготування компетентних клітин Pichia pastoris: Окрему колонію бажаного штаму-хазяїна Pichia pastoris використовують для інокуляції 50 мл YPD (2% глюкози) в широкогорлій конічній колбі Ерленмейера на 300 мл з дефлектором. Після інкубування протягом ночі при 30°С, 60% вологості та 130 об./хв. (Pilot Shake RC-2 ТЕ) використовують певний об'єм цієї попередньої культури для інокуляції 200 мл YPD (2% глюкози) в конічній широкогорлій колбі Ерленмейера на 2 л з дефлектором до оптичної густини приблизно 0,1 при 595 нм (OD595). Культуру вирощували в таких саме умовах, як і попередню культуру, до оптичної густини 1,0-1,5. Клітини збирали при 4°С та 4000 об./хв. протягом 10 хвилин та ресуспендували в 200 мл охолодженої льодом стерильної води. Цю процедуру повторяли 3 рази з ресуспендуванням клітин в 100 мл води, 10 мл 1М сорбіту та 0,5 мл 1М сорбіту, відповідно. 10 мкг бажаної плазміди переводили в лінійну форму за допомогою ВgІll та Notl (по 50 мю (u) кожного) протягом ночі в кінцевому об'ємі 300 мкл. Після рестрикційного гідролізу ДНК осаджують в EtOH та 0,3М ацетаті натрію відповідно до стандартного протоколу [16]. ДНК розчиняють в 11 мкл стерильного бідистиляту (ddH2O) та знесолюють за допомогою мембранного фільтра MF-Millipore (див. Таблицю 12) протягом приблизно 1-2 год. Якщо для трансформації використовують ПЛРпродукт, то приблизно 4-5 мкг ДНК обробляють, як описано вище, починаючи з преципітації EtOH. Для кожної трансформації 80 мкл приготовлених клітин змішують з 10 мкг ДНК, як описано вище, та інкубують протягом 5 хвилин на льоді. Суміш переносять в охолоджені льодом кювети для електротрансформації (Bio-Rad) та обробляють в імпульсному режимі при 200 , 25 мкФ та 2,5 кВ. Негайно додають 1 мл охолодженого льодом 1М сорбіту. Суспензію переносять в стерильну 12-мл поліпропіленову (РР) пробірку (Greiner, Frickenhausen, Germany, #184261) та інкубують протягом 2 години при 30°С без струшування. Після цієї фази регенерації аліквоти висівали на селекційні планшети. Для селекції трансформантів з високою експресією в умовах індукції, клітини висівають на MSM-Zeo планшети, що містять мінімальне середовище із сорбітом (або будь-яким ін 94399 32 шим нерепресуючим джерелом вуглецю) метанолом та зеоцином. Для селекції клонів, що виявляють високу експресію в умовах дерепресії, клітини можуть бути висіяні на zeo-планшети з мінімальним сорбітом і без метанолу. Включення глюкози до селекційних планшетів, що містять метанол, дає змогу детектувати клони з експресією, що не репресується глюкозою, та їх промотори. e) ПЛР колоній: Окрему колонію бажаного штаме Pichia ресуспендують в 100 мкл бідистиляту (ddH2O) в мікропробірці на 100 мкл та нагрівають протягом 5-10 хвилин при 95°С. Після центрифугування при 13200 об./хв. протягом 1 хвилини 10 мкл супернатанта використовували як матрицю для ПЛРреакції. 5 мкл цього першого циклу ПЛР використовували як матрицю для другого. 5 мкл другого циклу ПЛР використовували для контрольного гелю. ПЛР реакції містили 10 пмоль кожного праймера (АОХ1_соІ та GF-Prev), 200 мкМ кожного dNTP та 2,5 одиниці Hot Star Taq ДНК-полімерази (QIAGEN) або Taq ДНК-полімерази (Promega) в буферних умовах відповідно до наданих посібників в кінцевому об'ємі 50 мкл. Для секвенування другий ПЛР-продукт очищають з використанням набору для очищення ПЛР QIAquick. Таблиця 4 Температурна програма для ПЛР колоній Температура Taq 95°С 5 хв. 95°С 30 с 57°С 30 с 72°С 1 хв. 30 с 72°С 10 хв. Hot Star Taq 15 хв. 30 с 30 с 1 хв. 30 с 10 хв. Цикли 1 30 1 f) Виділення геномної ДНК Pichia pastoris: Бажаний штам P. pastoris вирощують протягом ночі в 5 мл YPD в стерильній 12 мл поліпропіленовій (РР) пробірці на обертовому штативі при 30°С до кінцевої OD595 5-10. 1,5 мл культури використовують для виділення ДНК з використанням набору Easy-DNA відповідно до наданого протоколу. g) Кількісне визначення білка: Виміри концентрації білка в розчині давно використовуються в біохімії. Одним з важливих областей застосування є нормалізація різноманітних біохімічних методів по загальній кількості білка, як це робиться в даному випадку для показників споживання кисню. Найбільш розповсюдженими способами визначення концентрацій білка є методи Бредфорда (Bradford), Лоурі (Lowry) та ВСА. Ці методи мають чіткі обмеження по чутливості, динамічному діапазону та сумісності з певними реагентами. З цих 3 тестів, методи Бредфорда та Лоурі є більш надійними та відтворюваними, ніж ВСА. З іншого боку, методи Лоурі та Бредфорда мають суворі обмеження у присутності детергентів та/або відновників, що приводить до високих значень холостих вимірів. Таким чином, тест ВСА є 33 94399 кращим методом після хімічного лізису. Концентрації білка визначали за допомогою тесту ВСА після хімічного лізису клітин з використанням YPer та BSA як стандарту відповідно до інструкцій з використання (Pierce Biotechnology Inc.), а тому нижче будуть стисло описані лише головні стадії. 200 мкл культур центрифугують при 4000 об./хв. та 4°С протягом 5 хвилин. Після видалення супернатанта осад ресуспендують в 100 мкл Y-Per всмоктуванням та видуванням з піпетки. Суспензію інкубують в мікропробірках на 1,5 мл в Thermomixer при кімнатній температурі та 600 об./хв. протягом 20 хвилин. Після збирання осаду уламків клітин при 13200 об./хв. та кімнатній температурі протягом 10 хвилин супернатант переносять в нову мікропробірку та зберігають при 4°С для тесту ВСА або SDS-PAGE. 25 мкл зразка змішують в лунці мікропланшета з 200 мкл робочого реагента ВСА (реагент А:реагент В=50:1), 34 ретельно перемішують протягом 30 секунд та щільно закривають кришкою для планшета (Promega). Після інкубації протягом 30 хвилин при 37°С та охолодження до кімнатної температури визначають поглинання при 562 нм за допомогою планшет-рідера Спектриmах Plus 384. Якщо треба, зразки розводять бідистилятом (ddH2O) перед тестом ВСА. h) SDS-PAGE: Зразки для SDS-PAGE готують шляхом хімічного лізису клітин з використанням Y-Per як реагенту, як описано в розділі вище. 10 мкл лізату змішують з 10 мкл 2 SSB (буфер для зразків sigma) та інкубують при 95°С протягом 5-10 хв. і 15 мкл цієї суміші наносять на гель для білка. Електрофорез проводять при 180 В протягом приблизно 1 год. і смуги білка детектують шляхом забарвлення кумасі (Coomassie) синім. Таблиця 5 Приготування гелю для SDS-PAGE Бідистилят (ddH2O) 30% акриламід/біс 0,5М Tris-HCI, pH 6,8 1,5М Tris-HCI, pH8,8 10% (мас/об.) SDS TEMED 10%APS Концентруючий гель (4%) 3,05 мл 650 мкл 1,25 мл і) Аналіз глюкози: Концентрації глюкози визначають за допомогою методу глюкози - УФ гексокінази без депротеїнізації (DIPRO med Handels GmbH, Weigelsdorf, Austria, Prod. no. D590522). 50 мкл культур Pichia переносять на мікропланшет для ПЛР та центрифугують при 4000 об./хв. протягом 5 хвилин. 10 мкл супернатанта додають до 190 мкл реагенту гексокінази в мікропланшеті UV-Star та інкубують при кімнатній температурі протягом 15 хвилин. Після інкубації визначають поглинання при 340 нм за допомогою планшет-рідера Спектриmax Plus 384. j) Краплинні проби: Штами P. pasioris вирощують у BMD (1%) до кінцевої OD595 1,5 та розводять серійно у 10 ра5 зів до кінцевого коефіцієнта розведення 10 . Переносять на агаровi планшети за допомогою 48 голкового реплікатора. Планшети інкубують при 30°С до появи колоній (звичайно 2 дня на планшетах MD). k) Аналіз первинної структури послідовностей: Всі аналізи первинної структури послідовностей здійснюють з використанням MultAlin на домашній сторінці INRA (Institut National de la 50 мкл 5 мкл 25 мкл Роздільний гель (12%) 3,35 мл 4 мл 2. 5 мл 100 мкл 10 мкл 50 мкл Recherche Agronomique, Paris, France) (prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) [17] або ClustalW в European Bioinformatics Institute (EBI, www.ebi.ac.ch/clustalw) [18]. При порівнянні послідовності з MultAlin завжди використовують для порівняння матрицю подібності ДНК послідовності. Гени шляху утилізації метанолу та більшість пероксисомальних генів регулюються у спосіб, аналогічний глюкозній репресії, дерепресії при вуглецевому голодуванні та індукції метанолом. Аналогічна транскрипційна регуляція з певним набором факторів транскрипції (репресори, а також індуктори) має відповідати за цей тип регуляції. Сайти зв'язування фактора транскрипції в цих промоторних ділянках повинні мати деякі консервативні ділянки. Аналіз структури численних послідовностей промоторних ділянок корегульованих генів повинен виявити консервативні сайти зв'язування факторів транскрипції, що беруть участь в регуляції відповідних генів. Повідомлялось, що кілька генів метилотрофних дріжджів P. pastoris, Η. polymorpha та С. boidinii є корегульованими, та їх промоторні послідовності були виділені (Таблиця 6). 35 94399 36 Таблиця 6 Корегульовані гени шляху утилізації метанолу або пероксисомальні гени метилотрофних дріжджів P. pastoris, Η. polymorpha та С. boidinii Дріжджі P. pastoris Η. poJymorpha С. boidinii Ген AOX1 AOX2 ZZA1 FLD1 МОХ DAS CAT AOD1 FLD1 FDH1 DAS1 PMP20 PMP47 CTA1 № доступу Genbank Фермент алкогольоксидаза алкогольоксидаза алкогольоксидаза формальдегіддегідрогеназа метанолоксидаза дигідроксиацетонсинтаза каталаза алкогольоксидаза формальдегіддегідрогеназа форміатдегідрогеназа дигідроксиацетонсинтаза пероксисомальний мембранний білок пероксисомальний мембранний білок каталаза l) Аналіз фактора транскрипції: Аналіз фактора транскрипції здійснюють з використанням Matlnspector Release professional 6.1 Jan. 2003, що входить до складу GenomatixSuite 1.6.1 на серверах Genomatix Software GmbH Servers [15]. Послідовність РАОХ1 pPICZ В вико Література www.invitrogen. com Х79871 S62281 AF066054 А11156 А11168 Х56501 М81702 АВ085186 АВ035095 АВ035094 АВ035096 АВ035097 АВ064338 ристовують для пошуку сайтів зв'язування фактора транскрипції з використанням Matrix Family Library Version 3.1.1 April 2003 групи ALL fungi.lib (www.genomatix.de). m) Праймери: Таблиця 7 Перелік праймерів, використовуваних для описаних прикладів (синтезовані MWG Biotech AG, Ebersberg, Germany) SEQ ID No. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Назва P (AOX1) forw P (AOX1) rev GFPZeo forw GFPZeo rev AOX1TT forw AOX1TT rev AOX11forw AOX11rev AOX12forw AOX12rev AOX13forw AOX13rev AOX14forw AOX14rev AOX15forw AOX15rev AOX16forw AOX16rev AOX17forw AOX17rev AOX18forw AOX18rev AOX19forw AOX19rev Послідовність AAGGTACCAGATCTAACATCCAAAGACGAAAG CTAGCCATGGTTGAATTCTTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTG GAAAGAATTCAACCATGGCTAGCAAAGGAG GATGATGGTCTAGAACGTGTCAGTCCTGCTCCTC GACACGTTCTAGACCATCATCATCATCATCATTG ATAGCGGCCGCACAAACGAAGGTCTC CAACACCCACTTTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAG GTTAGTAGCCTAAAGTGGGTGTTGAGGAGAAGAG GTTCATGTTTGTAGATGAGGGCTTTCTGAGTG GCCCTCATCTACAAACATGAACCTCGCCAG GAGGGCTTTCCCAAATGGCCCAAAACTG CCATTTGGGAAAGCCCTCATCTGGAGTG CGGCCAGTTGTTGGTATTGATTGACGAATGC CAATACCAACAACTGGCCGTTAGCATTTC GCTTCTGAACCTTGTCTCCACATTGTATGCTTC GTGGAGACAAGGTTCAGAAGCGATAGAGAGAC GTCTCCACACTGCTGATAGCCTAACGTTC GGCTATCAGCAGTGTGGAGACAATGCATAATCATC GGAATACTGCTCTAACCCCTACTTGACAGC GTAGGGGTTAGAGCAGTATTCCCACCAGAATC CTTGACAGCAAGCTGCCCTGTCTTAAACC GGGCAGCTTGCTGTCAAGTAGGGGTTAG CTGTCTTAAACCTTACTGGTTCCAATTGACAAGC GGAACCAGTAAGGTTTAAGACAGGGCAGC Tm [°С] 70 67 70 70 67 72 71 70 67 71 70 70 69 71 68 68 66 71 65 67 66 68 68 69 37 94399 38 Продовження таблиці 7 26 27 28 29 30 423forw 1372forw 2325forw AOXI_col GFPrev GATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGACCTCCACTCC GTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGC CGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTTCTAGACCATCATC TCCAAAGACGAAAGGTTGAATG CCGTATGTAGCATCACCTTCACC 87* 81* 86* 72 74 * Tm обчислюють з використанням Рівняння 2 (набір для мультисайт-спрямованого мутагенезу QuikChange) Приклад 1.1: Клонування репортерного конструкта GFP-Zeo використовують як репортер генної експресії, керованої варіантами промотора AOX1. Послідовності, що оточують старт-кодон ATG, конструювали з дотриманням мінімальних вимог консенсусних послідовностай Козака (Kozak) для високоекспресивних генів у дріжджах. Для зміни промоторних ділянок перед геном GFP-Zeo вставляли сайт рестрикції EcoRI (Таблиця 8) методом ПЛР з перекривним видовженням. Таблиця 8 Порівняння сайта ініціації трансляції та послідовностей, що оточують його, між АОХ1 послідовністю, використовуваного в цьому прикладі (похідною з pPICZ) та послідовністю AOX1 штама NRRL Y-11430 P. pastorls (Genbank AN: U96967, [2]). Сайт рестрикції EcoRI підкреслений, а мінімальні вимоги Козака (Kozak) в положеннях -3 та +4 виділені жирним шрифтом P(AOX1)-GFP АОХ1 (U96967) ААААСААСТА ААААСААСТА ATTATTgaAa АТТАТТсgА Продукування на основі методу ПЛР компонентів репортерної системи Р(AOX1) ампліфікували з використанням як матриці 10 нг вектора pPICZ-B ARSI. Реакція також містила 10 пмоль кожного праймера {Р(АОХ1) forw та Р(АОХ1) rev, відповідно), 200 мкМ кожного dNTP та 2,5 од. (U) Synergy полімерази у відповідних буферних умовах в кінцевому об'ємі 50 мкл. АОХ1 ТТ ампліфікували аналогічно промотору АОХ1. В цій реакції використовували як праймер AOX1TTforw та AOX1TTrev. Обидві ПЛР реакції проводили в термосайклере протягом 30 циклів (95°С, 1 хв.; 55°С, 30 с; 68°С, 2 хв. 30 с) з початковою стадією денатурації протягом 5 хв. при 95°С та кінцевою стадією подовження протягом 10 хв. при 68°С. 2 мкл першого циклу ПЛР використовували для ампліфікації в другому раунді в таких саме умовах, як вказано вище. Єдиною різницею було підвищення температури подовження до 72°C. GFP-Zeo [19] ампліфікуювали з використанням як матриці 25 нг вектора pTracer-CMV2. Реакція також містила 10 пмоль кожного праймера (GFPZeo forw та GFP-Zeo rev, відповідно), 200 мкМ кожного dNTP та 2,5 од. (U) полімерази Synergy у відповідних буферних умовах в кінцевому об'ємі 50 мкл. ПЛР здійснюють в термосайклері (див. Таблицю 8) протягом 30 циклів (95°С, 1 хв.; 55°С, 30 с; 72°С, 2 хв. 30 с) з початковою стадією денатурації протягом 5 хв. при 95°С та кінцевою стадією видовження протягом 10 хв. при 72°С. Всі ПЛР-продукти очищали електрофорез на агарозному гелі перед ПЛР з перекривним видовженням. Реакція містила 10 нг Р(АОХ1), 5 нг АОХ1 ТТ та 50 нг GFP-Zeo приготовленого, як описано -3 gaattcAACc ------ААСg +1 +4 ATGGCTAgCa ATGGCTAtCc вище, як матриці, 200 мкМ кожного dNTP та 2,5 од. (U) полімерази Synergy у відповідних буферних умовах в кінцевому об'ємі 50 мкл. ПЛР здійснюють в термосайклері (див. Таблицю 8) протягом 30 циклів (95°С, 1 хв.; 53°С, 50 с; 68°С, 3 хв. 30 с) з початковою стадією денатурації протягом 5 хв. при 95°С та кінцевою стадією видовження протягом 10 хв. при 68°С. Після 10 циклів додавали 10 мкл суміші, що містить 10 пмоль зовнішніх праймерів P(AOX1)forw та AOX1TTrev, ще 200 рМ кожного dNTP та 2,5 од. (U) полімерази Synergy у відповідних буферних умовах. Після цього додавання ПЛР продовжували, як запрограмовано. Одержаний ПЛР продукт з бажаним розміром приблизно 2,4 kb очищають на агарозному гелі. Очищений продукт клонували у вектор pCR4Blunt-TOPO та секвенували. Секвенування виявило 4 мутації та 1 делецію у репортерному конструкті. Сайт делеції пари основ був знайдений в положенні -15 оригінальної промоторної послідовності. Оскільки це положення знаходиться в сайті множинного клонування всіх векторів pPICZ (А, В та С; усередині сайта рестрикції Sful), делеція не повинна впливати на активність промотора і тому не виправлялася. Перша мутація (Т—>С) була знайдена в промоторній області в положенні -828. Інші 3 мутації були знайдені в кодуючій послідовності GFP-Zeo в положеннях +122, +507 та +1075, відповідно. Конверсія G—>А в положенні +122 змінює кодон GGA Gly на кодон GAA, який спричинює заміну амінокислоти G41A. Конверсія Т—>С в положенні +507 є мовчазною мутацією, що змінює тільки кодон R169. Остання мутація (Т—>С) в положенні +1075 змінює стоп-кодон TGA на кодон 39 аргініну CGA. Мутації -828, +122 та +1075 були виправлені за допомогою набора для мультисайтспрямованого мутагенезу QuikChange після конструювання вектора рАОХ. Мовчазну мутацію в положенні +507 та мутацію в полілінкері не змінювали, оскільки вона не вводить рідкий кодон. рАОХ конструювали шляхом вирізання фрагмента PAOX1-GFP-Zeo-AOX1TT з вектора pCR4Blunt-TOPO за допомогою Kрnl та Nofl та вставляння його у вектор pBlueScript SK- між сайтами Kрnl та Notl. Мутації, знайдені в промоторі AOX1 та послідовності GFP-Zeo, коригували з використанням набору для мультисайт-спрямованого мутагенезу QuikChange (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands). ПЛР реакцію проводять відповідно до наданої інструкції з використання; вона містить 100 нг рАОХ, 100 нг мутагенних праймерів (423forw, 1372forw та 2325forw, відповідно) та 1 мкл QuikChange мультиферментної суміші у відповідних буферних умовах в кінцевому об'ємі 25 мкл в термосайклері протягом 30 циклів (95°С, 1 хв.; 55°С, 1 хв.; 65°С, 10 хв. 30 с) з початковою стадією денатурації протягом 1 хв. при 95°С. Гідроліз Dрnl та хімічна трансформація в клітини Е. 94399 40 coil XL10-GOLD (Invitrogen Corp.) здійснюють відповідно до наданої інструкції з використання. Коригування всіх 3 мутацій перевіряють шляхом секвенування. Приклад 1.2: Конструювання делецій промотора АОХ1 Ліві плечі промотора АОХ1 синтезували з використанням P(AOX1)forw як прямого праймера та АОХ n rev (n=1..,9) як зворотних праймерів. Праві плічі синтезували з використанням 10 пмоль АОХ n forw (n=1..,9) як прямих праймерів та Р(АОХ1) rev як зворотного праймера. Всі плічі синтезували з використанням 12 нг вектора рАОХ як матриці та 10 пг кожного праймера. Реакція також містила 10 пмоль кожного праймера, 200 мкМ кожного dNTP та 0,6 од. (U) Pwo ДНК полімерази у відповідних буферних умовах в кінцевому об'ємі 50 мкл. ПЛР здійснюють в термосайклері протягом 30 циклів (95°С, 1 хв.; 55°С, 1 хв.; 68°С, 1 хв. 30 с) з початковою стадією денатурації протягом 5 хв. при 95°С та кінцевою стадією видовження протягом 10 хв. при 68°С. Всі плічі очищали на агарозному гелі перед використанням як матриці для ПЛР з перекривним видовженням. Таблиця 9 Перекривні пари праймерів та довжина плеча для делецій промотора Конструкт ΡΑΟΧ11 ΡΑOX12 ΡΑOX13 ΡΑOX14 ΡΑOX15 ΡΑOX16 ΡΑOX17 ΡΑOX18 ΡΑOX19 ліве плече внутрішній праймер довжина плеча [bр] АОХАІ rev 184 ΑOXΔ2 rev 315 ΑOXΔ3 rev 374 ΑOXΔ4 rev 519 ΑOXΔ5 rev 636 ΑOXΔ6 rev 708 ΑOXΔ7 rev 742 ΑOXΔ8 rev 794 ΑOXΔ9 rev 833 Реакція містила 10 нг кожного плеча, приготовленого, як описано вище, як матриці, 200 мкМ кожного dNTP та 0,6 од. (U) Pwo ДНК полімерази у відповідних буферних умовах в кінцевому об'ємі 50 мкл. ПЛР здійснюють в термосайклері протягом 30 циклів (95°С, 45 с; 60°С, 45 с; 68°С, 2 хв.) з початковою стадією денатурації протягом 5 хв. при 95°С та кінцевою стадією видовження протягом 10 хв. при 68°С. Після 10 цикли додавали 20 мкл суміші, що містить 10 пмоль зовнішніх праймерів P(AOX1)forw тa P(AOX1) rev, ще 200 мкМ кожного dNTP та 0,6 U Pwo ДНК полімерази у відповідних буферних умовах. ПЛР продовжували, як запрограмовано, після додавання суміші. Одержані продукти ПЛР з бажаним розміром приблизно 898-947 bр були очищені на агарозному гелі та клоновані у вектор pCR4Blunt-TOPO (A2, 4, 5, 7 та 8) або в pCR-Blunt ІІ-ТОРО (А1, 3, 6 та 9) і секвенували. Вектори рАОХ конструювали шляхом вирізання фрагментів РAOX1 з векторів ТОРО за допомо праве плече внутрішній праймер довжина плеча [bр] 738 ΑΟΧ1 forw 624 ΑΟΧ2 forw 578 ΑΟΧ3 forw 421 ΑΟΧ4 forw 290 ΑΟΧ5 forw 247 ΑΟΧ6 forw 209 ΑΟΧ7 forw 171 ΑΟΧ8 forw 115 ΑΟΧ9 forw гою ВgІll та EcoRI та вставляння їх в вектор рАОХ між ВgІll та сайтом EcoRI замість промотора дикого типу АОХ1. Одержані вектори перевіряли шляхом секвенування. Приклад 1.3: Трансформація Pichia pastoris та аналіз трансформантів Трансформацію Pichia pastoris здійснювали, як описано раніше. Селекцію для інтеграції РАОХ1 (або PAOX1)-GFP-Zeo-AOX1 TT здійснювали шляхом нанесення аліквот трансформованих та регенерованих клітин Pichia на агарові пластини MSM-Zeo. Штами Pichia pastoris вирощували в глибоколункових планшетах, що містять 300 мкл BMD (1%) на лунку при 28°С, 320 об./хв. та 80% вологості протягом 60 годин при кімнатній температурі. Після цього, відбирають 50 мкл для визначення GFP-флуоресценції. Індукцію здійснюють шляхом додавання 250 мкл ВММ2/лунку наступним додатковим інкубуванням протягом 72 год. Метанол поповнюють шляхом додавання 50 мкл ВММ10 після 41 94399 10, 24 та 48 годин. Знов вимірюють GFP флуоресценцію після 72 год. індукції метанолу. Аналіз експресія репортерого ферменту. Експресію GFP-Zeo у Pichia pastoris аналізували шляхом детектування флуоресценції GFP в планшетрідері Спектриmax Gemini XS при збудженні на 395 нм та випромінюванніна 507 нм. 50 мкл культур P. pastoris, що культивуються в глибоколункових планшетах, як описано вище розводили 1+3 бідистилятом (ddH2) на FIA мікротитрувальних планшетах. Через обмежену кількість зразка проводили лише по одному виміру. Всі наведені середні значення±стандартні відхили обчислюють для щонайменше 3 різних культур (лунок). Якщо касета інтеграції інтегрована в локус АОХ1 без заміщення гена АОХ1, рекомбінантний штам Pichia є здатним рости на метанолі зі швидкістю дикого типу, у той час як заміщення гена АОХ1 шляхом подвійного кросинговеру приводить до значно повільнішої швидкості росту на метанолі. Ці два фенотипи росту називають утилізацією + метанолу плюс (Mut ) та утилізацією метанолу s повільною (Muf ), відповідно. Для аналізу фенотипу утилізації метанолу, мікрокультури Pichia pastoris переносили на ММ та MD агарові пластини за допомогою 96-голкового реплікаторa та інкубують при 30°С протягом 2 днів. Після 2 днів колонії з'являються на обох планшетах, якщо штам + Pichia має фенотип Mut , у той час як для фенотиs пічних штамів Muf колонії виникають лише на MD планшетах. Всі штами Pichia, одержані шляхом трансформації рАОХ або однієї з плазмід pΑΟΧ аналізували методом ПЛР колоній, а делеційні конструкти також шляхом секвенування для перевірки промоторної послідовності перед репортерним геном (GFP-Zeo). Приклад 14: Спрямована еволюція промотора АОХ1 42 Хоч ПЛР мутагенез кодуючих ділянок генів є добре розробленим та визнаним, нічого не відомо про мутагенез промоторних ділянок. Через недостатнє знання використовували кілька умов мутагенезу: Для мінімізації похибок в спектрі мутацій, використовували дві різні полімерази - Taq ДНКполімеразу та Mutazyme ДНК-полімеразу (Stratagene Inc.). Через повну відсутність відомостей про частоту мутацій при еволюції промоторних послідовностей, випробовували кілька частот мутацій (теоретично від 1 до ~14/kb). Мутагенез з використанням Hot Star Taq ДНК полімерази: Мутагенну ПЛР здійснюють на промоторній послідовності в реакційному об'ємі 100 мкл відповідно до [20]. Реакція містила 12 нг рАОХ, 40 пмоль кожного праймера, (P(AOX1)forw та Р(АОХ1) rev), dNTPs (200 мкМ dGTP, 200 мкМ dATP, 1 мМ dTTP, 1 мМ dCTP) та 5 од. (U) Hot Star Taq ДНК полімерази у відповідних буферних умовах. Концентрація МgСІ2 була збільшена до 7 мМ (звичайно 3 мМ) для зміни частоти похибок полімерази. ПЛР здійснюють в термосайклері протягом 30 циклів (95°С, 45 с; 55°С, 45 с; 72°С, 1 хв. 30 с) з початковою стадією денатурації протягом 15 хв. при 95°С та кінцевою стадією видовження протягом 10 хв. при 72°С. Набір для випадкового мутагенезу GeneMorph застосовують для промоторній послідовності в кінцевому об'ємі 50 мкл відповідно до наданої інструкції з використання. Як матрицю використовували різні кількості вектора рАОХ (див. Таблицю 10). Використовували 12,5 пмоль кожного праймера, P(AOX1)forw тa P(AOX1) rev. Реакцію ПЛР проводять в термосайклері протягом 30 циклів (95°С, 30 с; 55°С, 30 с; 68°С, 1 хв. 30 с) з початковою стадією денатурації протягом 1 хв. при 95°С та кінцевою стадією видовження протягом 10 хв. при 68°С. Таблиця 10 Кількість матриці, використаної в GeneMorph  ПЛР реакції № 1 2 3 Частота мутація низька-середня середня середня-висока кількість рАОХ 12 нг 1,2 нг 120 пг Перший раунд мутагенезу здійснюють в описаних вище умовах (Taq, 3 GeneMorph). Для одержання вищої частоти мутацій, реакцію GeneMorph #3 використовують як матрицю для другого циклу ПЛР. Використовують умови Taq та GeneMorph #2 та #3. Перед трансформацією в клітини Pichia s pastoris X-33 GFP-Zeo Muf 9, всі ПЛР реакції осаджують та знесолюють, як описано раніше. Використовують стандартні процедури трансформації та регенерації. Селекцію промоторів, індукованих в глюкозному середовищі, здійснюють шляхом нанесення 150 мкл аліквоти суспензії трансформованих клітин на MD агарові пластини, очікуваних мутацій/kb ~3 або менше 3-7 ~7 або більше що містять 100-500 мкг/мл Зеоцину та інкубування при 30°С протягом 2 днів. Приклад 1.5: Результати та обговорення І) Характеризація репортерної системи На сьогодні, в молекулярній біології використовують різноманітні варіанти GFP. Хоч вони відрізняються лише кількома точковими мутаціями, їх характеристики є дуже відмінними. Крім поліпшеної здатності до складання, їх спектри флуоресценції, а також їх квантові виходи і тому інтенсивності істотно відрізняються. Зелені флуоресцентні білки можуть бути розділені на дві основні групи, в залежності від їх максимуму збудження: варіанти GFP дикого типу з максимумом збудження при 395 нм та невеликим максимумом при 470 нм і варіанти GFP з червоним зсувом з максимумом збу 43 дження при 480-490 нм. Відповідно до його амінокислотної послідовності, цикл-3-GFP належить до групи варіантів GFP дикого типу з максимумом збудження при 395 нм. Для контролю спектральних властивостей при експресії в Pichia pastoris вимірювали спектри флуоресценції. Глобальним максимумом збудження цикл-3-GFP в GFP-Zeo є 395 нм, у той час як другий максимум при 478 нм є незначним. Спектр випромінювання виявляє максимум випромінювання при 510 нм. З двох довжин хвиль збудження, запропонованих у посібнику, 395 нм є кращою та використовувалася для всіх подальших вимірів. Самопоглинання є дуже поширеним явищем в флуоресцентній спектроскопії. При високих концентраціях флуорофора, фотони, емітовані в області перекривання спектра поглинання (збудження) можуть поглинатися (радіаційне перенесення енергії). При наявності самопоглинання (ефект внутрішнього емісійного фільтра) буде спостерігатися нижча інтенсивність флуоресценції. Це приводить до недооцінки активності промотора. Без ефекта внутрішнього фільтра інтенсивність флуоресценції зростає лінійно зі збільшенням кількості флуорофора. Тму зростаючі об'єми клітин Pichia pastoris, що експресують GFP-Zeo, випробовували на їх флуоресцентну активність. До 3000 RFU (відносних одиниць флуоресценції) ніякого ефект внутрішнього фільтра випромінювання не було детектовано на клітинному рівні. Самопоглинання у клітинах, спричинене накопиченням GFP, не можна було оцінити. Спостерігалося лінійне зростання флуоресценції протягом усіх 72 годин фази індукції. З цієї причини наявність ефекту внутрішнього фільтра у клітинах здається малоймовірною. Таким чином, накопичення GFP-Zeo у ядрі не повинно створювати проблем з його кількісним визначенням. Ніякого ефекту внутрішнього фільтра не виникає в інтервалі активності однокопійного промотора, визначеному в цих дослідженнях. Через відсутність самопоглинання недооцінка активності промотора є малоймовірною. Ефект внутрішнього фільтра, спостережуваний іншими, найбільш вірогідно спричинений використанням іншого варіанта GFP з набагато меншим стоксовим зсувом і тому перекривними спектрами збудження та випромінювання. Слід бути обережним при порівнянні результатів експериментів з експресії GFP. Використання декількох варіантів GFP з різними спектральними властивостями, але також з використанням оптимізованих кодонів і тому зовсім відмінними рівнями експресії у різних хазяїв експресії ускладнює порівняння результатів різних лабораторій. II) Активність промотора АОХ1 в мікромасштабі Дрібномасштабне культивування мікробних клітин (наприклад, дріжджів, бактерій) звичайно здійснюють у культурах струшуваної колби. Інокуляція та культивування великих мікробних бібліотек у струшуваних колбах є праця- та часінтенсивними, що приводить до великої вартості. Останніми роками як альтернатива були розроб 94399 44 лені системи мікромасштабної культивації з використанням глибоколункових мікротитрувальних планшетів. Завдяки паралельній обробці, наприклад, 96 або 384 штамів/культур та меншій потрібності в матеріалі, мікротитрувальні системи є кращими за струшувані колби за показниками витрат праці, часу, і тому вартості. З кількох причин, основні недоліки мікротитрувальних систем, маленький об'єм зразка та низька ефективність аерації, є менш важливими: (1) технічний прогрес в аналітичних системах привів до нижчих меж чутливості великої кількості сполук, внаслідок чого потрібні дуже малі об'єми зразків; (2) методи та пристрої для вирощування в глибоколункових мікротитрувальних планшетах також були удосконалені. Було показано в кількох дослідженнях, що інтенсивність аерації і тому умови росту в мікротитрувальних планшетах є подібними до струшуваних колб. Було також продемонстровано, що дослідження в реальному часі промотора GAL1 в S. cerevisiae з використанням цикл-3-GFP як репортерного білка узгоджуються з результатами досліджень в струшуваних колбах. Експресія GFP-Zeo під керуванням промотора AOX1 була досліджена в глибоколункових мікротитрувальних планшетах, як описано вище. Після росту клітин на глюкозі йде фаза індукції метанолом як джерелом вуглецю та енергії. Індукція промотора АОХ1 метанолом у клітинах Pichia pastoris, що мають касету експресії PAOX1-GFP-Zeo-AOX1 TT приводила до швидкого зростання флуоресценції GFP. До 72 год. флуоресценція GFP зростає лінійно. Експресія GFP-Zeo може продовжуватися при додаванні метанолу. Якщо ні, то метанол витрачається через випаровування та споживання протягом 24 год. і експресія GFP-Zeo знижується до дерепресованого рівня. Посилення флуоресценції GFP-Zeo також узгоджується з GFP-Zeo білком, як було продемонстровано методом SDS-PAGE. Після індукції метанолом з'явилася смуга білка приблизно 42 кДа, яка ставала більш інтенсивною з посиленням флуоресценції. Сильна смуга при 42 кДа була знайдена у всіх GFP-Zeo клонах, у той час як у негативному контролі (Х-33 дикого типу) ніякої смуги не з'являлося. Також у зразку Х-33 d6*F10 після 72 годин індукції метанолом було знайдено сильну смугу (Фіг. 1С, Доріжка 5). Хоч нормалізація не робилася, можна побачити очевидну кореляцію між інтенсивностями смуг 42 кДа та відповідними рівнями флуоресценції. Ill) Сайти зв'язування фактора транскрипції Як було описано вище, консенсусні послідовності для сайтів зв'язування декількох факторів транскрипції є відомими. Аналіз послідовності промотора AOX1 виявив кілька гаданих сайтів зв'язування фактора транскрипції, з декількома співпадіннями, що є особливо цікавими. У факторі теплового шоку та мотиві елемента стресової відповіді, були знайдені сайти зв'язування декількох факторів транскрипції, загальновідомі як такі, що беруть участь у регуляції глюкози. Найбільш цікаві сайти зв'язування зведені у таблиці 11 та Фіг. 2. 45 94399 46 Таблиця 11 Сайти зв'язування фактора транскрипції (TF), знайдені у послідовності промотора АОХ1. Пари основ, виділені великими літерами, позначають корову послідовність (4 найбільш консервативні, послідовні залишки матриці), підкреслені пари основ показують високоінформативний вміст (Сі>60 при максимумі 100) TF матриця Положення (5)* HAP1.01 HSF.01 HAP234.01 HAP234.01 ABAA.01 STRE.01 RAP1.01 ADR1.01 HSF.03 HAP234.01 MAT.MC.01 GCR1.02 QA-1F.01 52-66 (від -902 до -888) 135-155 (від -819 до -799) 193-205 (від -761 до -749) 203-215 (від -751 до -739) 213-227 (від -741 до -727) 279-287 (від -675 до -667) 332-346 (від -622 до -608) 371-377 (від -583 до -577) 516-536 (від -438 до -418) 665-677 (від -289 до -277) 680-690 (від -274 до -264) 699-713 (від -255 до -241) 743-763 (від -211 до -191) Варіант Корова Матрична Послідовність делеції подібність подібність 1,000 0,802 ctgtggatgtCGGAt 1,000 0,784 AGAAgaggaqtggaggtcctg 1,000 0,895 caagcCCAAtaac 1 1,000 0,923 gagctCCAAtcaa 1 1,000 0,949 ctcgctCATTccaat 1 1,000 1,000 ccAGGGggg 1,000 0,845 tacACCCgaacatca 2 1,000 1,000 tGGGGtc 3 1,000 0,8 62 AGAAacttccaaaagtcggc 4 1,000 0,883 atcatCCAAaaag 5 1,000 0,901 tgcaTTGTctc 1,000 0,872 atqCTTCcaa gattc 6 0,785 0,775 acagttaaatttTGATcatga 7 Seq ID No. 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 * Зазначене положення позначається по відношенню до точки початку трансляції (ATG) гена GFP-Zeo; корові послідовності гаданих сайтів зв'язування фактора транскрипції вказані великими літерами с позначає гомологію з комплементарною ниткою IV) Регуляторні послідовності в регульованих метанолом генах В літературі описано кілька послідовностей, що беруть участь в регуляції метаноліндуцибельних генів. На основі делеційного аналізу промотора АОХ2 P. pastoris було описано три регуляторні ділянки, дві ділянки негативної дії (URS1 та URS2, послідовності апстрім-репресії) та домен позитивної дії (UAS, послідовність апстрімактивації) [3]. Для промотора МОХ Н. polymorpha були також описані дві апстрім-активуючі послідо вності (UAS1 та UAS2) та один сайт зв'язування peпpecopa (URS1) [8]. V) Делеційні конструкти промотора AOX1 На основі аналізу фактора транскрипції та порівняльного аналізу первинної структури множини послідовностей 9 були вибрані промоторні ділянки для делеції ПЛР з перекривним видовженням, як описано раніше. Делеційні конструкти промотора АОХ1 клонували в вектор рАОХ із заміщенням промотор 5 "АОХ1 дикого типу" на репортерний ген GFP-Zeo. Плазміди переводили в лінійну форму та інтегрували в геном Pichia pastoris. Таблиця 12 Послідовності, видалені в конструктах промотора AOX1 Конструкт ΡΑΟΧ11 ΡΑΟΧ12 ΡΑΟΧ13 ΡΑΟΧ14 ΡΑΟΧ15 ΡΑΟΧ16 ΡΑΟΧ17 ΡΑΟΧ18 ΡΑΟΧ19 Положення* 5'-кінець 3'-кінець 170-784 235-719 304 (-650) 350 (-604) 364 (-590) 393 (-561) 509 (-445) 551 (-403) 625 (-329) 683 (-271) 694 (-260) 723 (-231) 729 2(-25) 763 (-191) 784 (від -170) 800 (-154) 823 (-131) 861 (-93) Seq ID No. tttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttcta 44 ttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactcc 45 ctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttc 46 gtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgt 47 ccggigcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgca 48 attgtatgcttccaagattctggtgggaat 49 tgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgt 50 aatatataaacagaagg 51 tttttttatcatcattattagcttactttcataattgcg 52 Послідовність * Зазначені положення позначаються по відношенню до Seq ID No. 1 Інтегранти аналізували на експресію GFP-Zeo та на інтеграцію правильної промоторної послідовності перед геном GFP-Zeo, як описано вище. Одноколійні інтегранти додатково детально аналізували на їх рівні експресії GFP-Zeo в різних дже релах вуглецю в мікромасштабі. В усіх конструктах (делеційних та дикого типу) не детектувалося ніякої GFP флуоресценції доти, поки глюкоза або гліцерин були присутніми у середовищі (з метанолом та без нього). При вуглецевому голодуванні, 47 94399 яке представляє умови дерепресії, було детектовано незначне збільшення GFP флуоресценції. У порівнянні з диким типом деякі варіанти промотора виявляли значні відмінності (Фіг. 3). Значно нижча активність промотора спостерігалася у 6 конструктів (3, 4, 5, 7, 8 та 9, див. Фіг. 3) в умовах дерепресії. 1 мав активність дикого типу, у той час як конструкти 2 та 6* приводили до значно вищої GFP-Zeo експресії. Рівень експресії останнього був істотно вище, ніж рівень дикого типу. При індукцією метанолом всі варіанти виявляли значно знижену активність промотора з одним лише винятком: 1, який забезпечував активність приблизно на 20% вище, ніж у дикого типу. Зниження активності всіх інших варіантів є досить значною, як можна побачити на Фіг. 4. Активність промотора для всіх варіантів та конструктів дикого типу, нормалізована по метанол-індукованій активності дикого типу, наведена у таблиці 13. Таблиця 13 Інтенсивність флуоресценції варіантів промотора АОХ1 в мікромасштабі. Дані представляють середнє±SD для 4 незалежних вимірів. Інтенсивність флуоресценції після 72 год. індукції метанолом промотора дикого типу (WT) (100%) дорівнює 987±81. Ніякої флуоресценції не детектували, якщо глюкоза була присутньою у середовищі Конструкт РАОХ1 ΡΑΟΧ11 ΡΑΟΧ12 ΡΑΟΧ13 ΡΑΟΧ14 ΡΑΟΧ15 ΡΑΟΧ16* ΡΑΟΧ17 ΡΑΟΧ18 ΡΑΟΧ19 відносна інтенсивність флуоресценції [%] Дерепресія Метанол 2,8±0,1 100 3,0±0,5 120±12 4,4±0,8 40±3 0,7±0,2 68±8 1,9±0,1 72±4 0,23±0,04 30±4 9,1±0,6 42±2 2,2±0,4 31,3±0,5 0,3±0,2 17,1±0,7 1,3±0,1 61±3 Делеція ТАТА-бокса в конструкті 8 приводила до масового знищення промотора з різким зниженням активності в умовах дерепресії та індукування на приблизно 90% та 80%, відповідно. При елімінації експериментально визначеного (Ellis, S.B., et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:1111-1121) сайта ініціації транскрипції (9) такого сильного ефекту на рівень експресії не спостерігалося. Це один з найкращих делеційних конструктів після індукції метанолом. Як очікувалося, ТАТА-бокс має сильний вплив на рівень транскрипції. На відміну від нього, сайт ініціації транскрипції здається не таким важливим, як ТАТА-бокс. Інша область на визначеній відстані від ТАТА-бокса може діяти як початок транскрипції після делеції оригінальної. Можна робити припущення щодо ефекту цієї делеції на кілька стадій процесу експресії (наприклад, ініціа 48 ція транскрипції, стабільність мРНК, ініціація трансляції), оскільки ця делеція змінює 5'-кінець мРНК. Лише два конструкти, 2 та 6*, виявляють значно вищий рівень експресії після дерепресії. Гадані сайти зв'язування фактора транскрипції Rap1p та Gcr1p включені в делетовані послідовності. На додаток, гаданий сайт зв'язування фактора транскрипції QA-1F розташований дуже близько до делетованих послідовностей 6*. Відзначимо, що, як відомо, сайти зв'язування Rap1p та Gcr1p виявляють синергічну дію при присутності в промоторній послідовності [21]. Неспецифічний фактор транскрипції Rap1p виконує різноманітні клітинні функції (наприклад, структура теломери, парування, трансляція, гліколіз) в залежності від контексту послідовності його сайта зв'язування та відповідних факторів транскрипції [22-24]. Як згадувалося раніше, Gcr1p є важливим об'єктом регуляції та координації гліколітичних генів і є абсолютно необхідним для високого рівня експресії в S. cerevisiae. Сайти зв'язування Rap1p та Gcr1p знайдені з близькою локалізацією в коровій області апстрім активуючої послідовності (UAS) гліколітичних генів і зв'язування Gcr1p полегшується внаслідок згинання ДНК Rap1p. З іншого боку, суміжний сайт зв'язування Rap1p не є абсолютною вимогою для Gcr1 р-залежної активації генів. Здається, що Gcr1p може сприяти зв'язуванню з його сайтом зв'язування у присутності більшої кількості СТ-боксів. Хоч чітка взаємодія Rap1p з Gcr1p, а також Gcr1p з Gcr1p була описана, робилися припущення, що деякі інші фактори взаємодіють з Gcr1p та/або Rap1p, модулюючи активність комплексу. За останні 3 десятиріччя були накопичені великі знання про механізм індукції. Описана суттєва близька локалізація сайтів зв'язування Gcr1p та Rap1p у функціональній UAS, описана вище, не була знайдена в промоторній послідовності АОХ1. Навпаки, два сайти зв'язування розташовані на відстані 367 bр (пар основ). У гаданому сайті зв'язування Gcr1p, його корова послідовність СТТСС присутня 2 рази в промоторній послідовності АОХ1, але жодна з них не є безпосередньо сусідньою із сайтом зв'язування Rap1p або іншим СТТСС-мотивом. Тому синергічна дія цих двох сайтів зв'язування, виявлена в багатьох гліколітичних генах, здається малоймовірною. Внаслідок того, що гаданими ролями Rap1p та Gcr1p є репресорні білки для AOX1 в умовах дерепресії, можливий новий спосіб (взаємо)дії цих двох білків для цієї гаданої нової клітинної функції. Участь 6* делеції (включаючи гаданий сайт зв'язування Gcr1p) в репресії при вуглецевому голодуванні підкреслюється спостереженнями мультикопійних штамів з дуже високою експресією GFP-Zeo без індукції метанолом. Експресія GFPZeo кращим клоном з серії 1-9, названим P. pastoris Х-33 d6*F10, показана на Фіг. 5. Експресія GFP-Zeo є приблизно на 10% вищою після дерепресії (60 год. в мікромасштабі) у цьому 6* мультикопійному штамі, ніж у штамі дикого типу з одноколійним промотором (Х-33 GFP-Zeo D2) після індукції метанолом. Рівень експресії P. pastoris Х33 d6*F10 після індукції метанолом також набагато 49 вище, ніжу мультикопійному штамі з промотором дикого типу (Х-33 GFP-Zeo E2). Промоторні ділянки P. pastoris AOX1 та DAS1 та Н. polymorpha МОХ промотують експресію репортерного фермента бета-галактозидази (lacZ Ε. coli) в S. cerevisiae [9]. Характер регуляції цих генів в S. cerevisiae є подібним до їх природних хазяїв: глюкоза репресує генну експресію. В умовах вуглецевого голодування експресія ещо дерепресується і гліцерин як джерело вуглецю індукує експресію. Рівні бета-галактозидази, що експресуеться під контролем регуляторних ділянок АОХ1 та DAS1 в S. cerevisiae, є порівнянними з рівнями, одержаними для сильнх промоторів S. cerevisiae CYC1 (конститутивний) та GAL2 (індуцибельний) [9]. Було продемонстровано, що експресія під керуванням промотора МОХ також індукується етанолом, метанолом та масляною кислотою у S. cerevisiae. Іншим дуже важливим відкриттям є участь Adr1p в дерепресії/індукції промотора. Adr1p, позитивний ефектор ADH2 (алкогольдегідрогеназа 2) та деякі пероксисомальні білки у S. cerevisiae [25], є також позитивними ефекторами промотора МОХ при дефіциті глюкози у середовищі. Як згадувалося раніше, характер регуляції АОХ1 та гена МОХ суттєво відрізняються в їх природних хазяях внаслідок дерепресії МОХ в присутності гліцерину. Використання промоторної області AOX1 в Н. polymorpha показало, що промотор АОХ1 не репресується гліцерином у гетерологічних хазяїв [26]. Таким чином, гетерологічний промотор AOX1, по-видимому регулюється аналогічно гомологічному МОХ промотору. Це приводить до припущення про те, що значна різниця в характері регуляції між P. pastoris та Н. poiymorpha спричинена неспецифічною транскрипційною відповіддю на різні джерела вуглецю у цих двох дріжджів. Це означає, що, якщо механізми репресії гліцерином та глюкозою є (частково) ідентичними в P. pastoris, то для Н. poiymorpha (як у S. cerevisiae) ситуація відрізняється і гліцерин не використовує механізми глюкозної репресії. Два з трьох гаданих сайтів зв'язування НАР2/3/4/5, знайдених в промоторній послідовності АОХ1, розташовані в 1 делеційному конструкті, а третій - в 5. Делеція послідовності 1 приводить до підвищення активності промотора при індукції метаноліом, у той час як не спостерігалося ніякого впливу на рівень промотора дерепресії. Навпаки, делеція 5 приводить різкого зниження активності промотора в умовах дерепресії, а також індукції. В делеції 1 був знайдений гаданий сайт зв'язування Aspergillus nidulsns abaA. Генний продукт abaA є активатором транскрипції, який бере участь в розвитку конідіофора (нестатевий репродуктивний апарат) у A. nidulans [27]. Оскільки всі гадані сайти зв'язування є можливими активуючими послідовностями [27], їх делеція повинна мати негативний ефект на рівень експресії, знайдений для конструкта 5. Внаслідок того, що обидві делеції є дуже довгими, за спостережуваний ефект може відповідати інший сайт зв'язування. Той 94399 50 факт, що делеція 1 має протилежний ефект на рівень експресії, вказує, що один з гаданих сайтів зв'язування є репресорним мотивом, або що присутній інший сайт зв'язування, який перевищує ефекти делеції гаданих сайтів зв'язування НАР та abaA, тим самим підвищуючи рівень експресії. Тим не менш, відомо, що комплекс НАР відповідає за підвищувальну регуляцію генів, що беруть участь в дихальному газообміні та та енергетичному метаболізмі у S. cerevisise. Регуляція дихання контролюється рівнем кисню, а також джерелом вуглецю, присутнім у середовищі, які обидва медіюються комплексом Нар. У зброджувальних дріжджів S. cerevisise, кілька генів і тому функції дихального ланцюга, а також циклу лимонної кислоти, репресуються глюкозою. Глюкозна репресія дихання частково медіюється комплексом Нар, а саме, відсутністю Нар4р, доти, поки глюкоза є присутньою. Навпаки, кисень-залежна регуляція, по-видимому, регулюється Нарір [28]. Гомологи генів комплексу Нар були виділені у респіраторних дріжджів K. lactis. Гени, що беруть участь у диханні, конститутивно експресуються у респіраторних дріжджів, навіть в присутності глюкози. На сьогодні, було показано, що майже всі гени дихального ланцюга регулюються незалежно від комплексу Нар [29]. Роль комплексу Нар, по-видимому, полягає в координації асиміляції вуглецю та азоту, як було знайдено також у S. cerevisiae [30] та Aspergillus nidulans [29]. Перша стадія шляху утилізації метанолу, переважно каталізована генним продуктом АОХ1 у P. pastoris, є кисень-витратною. Більшість генів, що беруть участь в енергетичному метаболізмі та майже кожен ген, що кодує дезоксигенуючі ферменти, регулюється киснем, переважно, Нарір та/або Нар2/3/4/5р [28]. При вирощуванні на метанолі як єдиному джерелі енергії та вуглецю, шлях утилізації метанолу приводить до асиміляції вуглецю та продукування енергії. Участь мотиву розпізнавання ТТССАА комплексу Нар в регуляції промотора AOX1 здається логічною. Конструкт 4, який включає другий гаданий сайт зв'язування HSF, приводить до 30% зниження активності промотора після дерепресії та індукції. Таким чином, HSF є неспецифічним енхансером генной експресії АОХ1 в умовах дерепресії, а також індукції. У S. cerevisiae кілька стресових умов, таких як тепловий шок, оксидативний стрес та глюкозне голодування, приводять до активації HSF. Було також продемонстровано, що протеїнкіназа SNF1p, одна з "метаболічних головних вимикачів", бере участь в фосфорилювання і, внаслідок цього, активації HSF при вуглецевому голодуванні [31]. Таким чином відбувається участь HSF у повній активації AOX1 при глюкозному голодуванні (з індукцією чи без неї). Дослідження експресії на промоторі AOX1 з використанням укорочених версій, а також варіантів з делетованими послідовностями, розкриті у відомому рівні техніки [32, 33]. 51 94399 52 Таблиця 14 Результати досліджень промотора Inan et al. [32, 33]; Індукцію здійснюють 0,5% метанолу як джерелом суглецю, репресію - 0,5% метанолу та 0,5% етанолу; Стартове положення позначає 5'-кінець послідовності в промоторі АОХ1 по відношенню до стартової точки трансляції (ATG) Фрагмент промотора Делеція no відношенню до SEQ ID No. 1 InanABCDEF lnan_BCDEF Inan_CDEF Inan DEF Inan EF Inan F inanA CDEF lnanAB_DEF lnanABC_EF lnanABCD_F 7-152 (від -947 до -802) 1-292 (від -947 до -661) 1 до 432 (від -947 до -521) 1-559 (від -947 до -394) 1-798 (від -947 до -245) 153-292 (від -801 до -661) 293 до 432 (від -660 до -521) 433-559 (від -520 до -394) 560-798 (від -393 до -245) Конструкт lnan_BCDEF, який починається з положення 153 (-801) (Таблиця 14) має сайт зв'язування щонайменше одного білка-активатора вище 153 (-801). Кандидатами на цей сайт зв'язування активатора є сайти зв'язування Нарір (5266, від -902 до -888) та HSF (135 та 155, від -819 до -799) на комплементарному ланцюзі, знайдені за допомогою програми Matlnspector. Укорочення по сайту рестрикції Sacl (210-215 (від -744 до 739)) приводить до того, що промотор майже досягає активності промотора дикого типу (Geoff Lin Cereghino, Poster, Sixth Meeting on "Current Topics in Gene expression and Proteomics", San Diego, October 19-22, 2003). Для досягнення рівня промотора дикого типу для укороченого промоторного конструкта Sad (pHWGO, Geoff Lin Cereghino, poster), другий сайт зв'язування репресорного білка може бути присутнім вище позиції 210 (-744), делеція якої має такий саме вплив, але в протилежному напрямку, на промоторну активність. Репресорний білок локалізований між позиціями 169 (-784) та 210 (-744), тому що конструкт 1 ( 169 (784) до 234 (-719)) містить сайт зв'язування репресора. Делеція 1 приводить до 20% підвищення активності промотора (Таблиця 14), що находиться в інтервалі зниження при делеції сайта зв'язування активуючого білка. Шляхом порівняння з 4 ( 508 (-445) до 550 (403)), локалізація сайта зв'язування репресора може бути далі уточнена до послідовнстіі між 433 (-520) та 508 (-445), тому що делеція 4 включає позитивно діючий фактор транскрипції, HSF в положенні 516-536 (від -438 до -418). Якщо позитивно діючий HSF (якщо це HSF) локалізований у запропонованій області, можна припустити більш сильний ефект сайта зв'язування репресора між 433 та 508 (-520 та -445). Якщо сайт зв'язування HSF локалізований в області між 508 та 536 (-445 та -418), то інший сайт зв'язування активатора розташований між 536 та 560 (-418 та -393). Якщо ні; він вірогідно є тим самим сайтом зв'язування. Як варіант ln-anABCD_F ( 560-709 (від -393 до -245)) з лише 16% активності дикого типу, так і конструкт 5 (624-682 (від -329 до -271)) приводить до змен Відносна активність [%] індукована репресована 100 3,1±0,3 76±5 1,9±0,2 49±4 2,2±0,5 14±3 1,3±0 24±7 1,8±0 7±2 1,8±0,2 63±3 2,1±0,2 109±12 3,8±0,4 128±6 5,0±0,6 16±1 0,8±0,2 шення рівня дикого типу на приблизно 70%. Як і очікувалось, делеція фрагмента Іпап В як з непроцесованого промотора (з утворенням lnanA_CDEF), так і з lnan_BCDEF (з утворенням Inan_CDEF) приводить до зниження до 63 та 64% від більш довгого фрагмента, відповідно. На відміну від цього, якщо делеція фрагмента С з повного промотора приводить до підвищення приблизно на 10% активності промотора, делеція з укороченого фрагмента Inan_CDEF приводить до зниження від 49 до 14% (Таблиця 14). Це пояснюється синергічним зв'язування факторів транскрипції в залежності від контексту їх сайтів зв'язування. Між 713 та 760 (від -241 до -194) локалізований останній сайт зв'язування білка-активатора (Geoff Lin Cereghino, Poster, San Diego). Знов, за допомогою 7 конструкта ( 729-763, від -225 до -191) місцезнаходження активатора може бути уточнене до позиції 729 (-225). На закінчення, було знайдено декілька ділянок, які мають сильний вплив на рівень експресії промотора АОХ1. Якщо узяти разом всі відомі регуляторні сайти з наведеного тут прикладу та з інших авторів, за винятком ділянок, що містять ТАТА-бокс та сайт ініціації транскрипції, в промоторній послідовності РАОХ1 існує щонайменше 10 регуляторних сайтів. Наведені дані виявили оркестрову регуляцію промотора AOX1: кілька факторів є потрібними для зв'язування з ДНК для максимального рівня експресії. В умовах індукування кілька позитивно діючих факторів транскрипції (активаторів) зв'язуються з ДНК, у той час як більшість репресорних білків не зв'язуються, що приводить до високого рівня експресії. В дерепресованому стані, активність промотора досягала лише невеликої частки (~3%) від індукованого рівня. Це скоріше всього спричинено тим, що менше активуючих і більше репресорних білків зв'язуються промоторною областю. Можна припустити, що в умовах репресії жодного активатора та кілька репресорів зв'язуються з ДНК з подальшим збільшенням співвідношення репресор/активатор в умовах репресії. 53 Було продемонстровано для репресованого глюкозою промоторa ADH2 (алкогольдегідрогеназа 2) S. cerevisiae, що зв'язування білківактиваторів (наприклад, Adr1p) безпосередньо поряд з нуклеосомами призводить до дестабілізації і тому до перебудови хроматину при дерепресії. Перебудова відбувається в області ТАТА-бокса та сайта ініціації транскрипції, а тому підвищує їх доступність. Завдяки вищій доступності відбувається утворення стабільного попередньо ініційованого комплексу, внаслідок чого зростає активність промотора до базального рівня. З урахуванням зв'язування декількох факторів транскрипції для посилення експресії під контролем РАОХ1, можна припустити аналогічний механізм, щонайменше, для дерепресії. Якщо поєднати всі дані та припущення, то регуляція промотора АОХ1 є дуже складною і гадані сайти зв'язування декількох (позитивно та негативно діючих) факторів транскрипції виявляє висококоординовані механізми, здатні інтегрувати різноманітні сигнали при регуляції промотора АОХ1. VI) ПЛР мутагенез промотора АOX1 Тут було продемонстровано, що специфічні мутації у корових послідовностях сайтів зв'язування фактора транскрипції приводять до значних змін їх ефекторної сили. Гадано, кілька активуючих та репресорних білків діють на промотор AOX1, спричинюючи його дуже сильну регуляцію (майже повна відсутність активності у глюкозі, дуже висока активність в метанолі). Тому випадковий мутагенез промотора AOX1 повинен приводити до кількох варіантів промотора зі знищеною або зменшеною активністю сайта зв'язування репресора. Проводять ряд ПЛР реакцій з різними частотами мутацій. Одержані варіанти промотора були транs сформовані в штам P. pastoris GFP-Zeo Mut А9, де ген AOX1 був заміщений на штам GFP-Zeo. Заміщення промотора дикого типу AOX1 на піддані мутагенезу варіанти промотора повинно відбуватися з певною частотою. Скринінг варіантів про 94399 54 мотора з вищою швидкістю експресії в присутності глюкози у середовищі проводили на MD-Zeo агарових пластинах. Нанесення on MD агарові пластини, що містять 100 мкг/мл зеоцину привело до одержання планшетів з плямами клітин Pichia pastoris без видимих оеркмих колоній. По-видимому, тиск добору був недостанім для пригнічення росту штаму дикого типу. Хоч флуоресценція не детектувалася s для штаму P. pastoris GFP-Zeo Mut A9 в присутності глюкози, кілька GFP-Zeo білків можуть експресуватися у клітинах, надаючи їм резистентності до зеоцину. Для випробувань вищих концентрацій зеоцину на інгібування росту були проведені s краплинні проби штаму GFP-Zeo Mut A9, як описано раніше. Як можна чітко побачити на Фіг. 6, підвищення до 200 мкг/мл на зменшувало життєздатності клітин (у порівнянні з 100 мкг/мл) штамів P. pastoris, які мають ген GFP-Zeo під контролем промотора АОХ1, але зростання до 500 мкг/мл робило це. Очікувалося, що мутагенез промотора повинен приводити лише до трохи підвищених рівнів експресії, тому тиск добору 500 мкг/мл зеоцину, повидимому, є занадно високим. Зрештою, для всіх подальших скринінгів варіантів мутагенезу промотора вибрали 350 мкг/мл. Внаслідок дуже складної транскрипційної регуляції за участі багатьох промоторних ділянок, застосування випадкового мутагенезу з високою частотою мутагенезу є кращим. Приклад 2: Генерування промотора делеції На основі результатів прикладу 1 було генеровано друге покоління делеційних варіантів. На відміну від перших серій, в цих нових делеційних конструктах були видалені лише маленькі та специфічні ділянки послідовності гаданих сайтів зв'язування фактора транскрипції (5-15 bр) (Таблиця 15). 55 94399 56 Таблиця 15 Ефекти делеції специфічних сайтів зв'язування фактора транскрипції на рівень експресії при дерепресії (глюкозне голодування) та індукції метанолом. Також наведені мутації 1-9, а також комбінації окремих мутацій. Всі числа позначають відносну активність промотора у порівнянні з активністю промотора дикого типу в таких саме умовах 57 94399 58 59 Матеріали та методи: а) Мутагенез: Всі делеції були зроблені з використанням протоколу двостадійного сайт-спрямованого мутагенезу відповідно до Wang et al. [34]. На першій стадії оцінюють дві окремі реакції (одна для прямого та одна для зворотного праймера) (100 нг рАОХ матриці, 15 пмоль праймера, 200 мкМ кожного з dATP, dTTP, dCTP та dGTP, 2,5 од. (U) PfuUltra полімерази в загальному об'ємі 50 мкл 94399 60 у відповідних буферних умовах). Об'єднують 25 мкл цих 2 ПЛР реакції та здійснюють другу стадію ПЛР реакції. Додають 1 мкл Dpnl рестрикційного ферменту (10 u/мкл) до 30 мкл другої стадії ПЛР реакції та інкубують протягом 1 год. при 37°С. Трансформують 1-5 мкл гідролізованої Dpnl ПЛР реакції в електрокомпетентні клітини Е. coli [16] та висівають на LB-Amp планшети після регенерації протягом 1 год. в середовищі SOC.