Рекомбінантний поксвірус, який містить принаймні два ati промотори коров’ячої віспи

1. Рекомбінантний поксвір ус, який місти ть у вір усном у геномі принаймні дві експресійні касети, кожна з яких містить ATI промотор коров'ячої віспи відповідно до SEQ ID.: No.1, його похідну або підпослідовність ATI промотору, та кодуючу послідовність, де експресія кодуючої послідовності регулюється вказаним промотором, по хідною або підпослідовністю і де по хідна ATI промотор у коров'ячої віспи є послідовністю, в якій не більше ніж 6 нуклеотидів замінено, видалено та/або вве 2 (19) 1 3 85379 4 11. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким з пп.110, де щонайменше одна з експресійних касет уведена в міжгенну ділянку поксвірусного геному. 12. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким з пп.111, де щонайменше одна з кодуючи х послідовностей кодує щонайменше один ан тиген, епітоп антиген у та/або терапевтичну сполуку. 13. Рекомбінантний поксвірус за будь-яким з пп.1-12 як вакцина або лікарський засіб. 14. Вакцина або фармацевти чна композиція, яка включає рекомбінантний поксвірус за будьяким з пп.1-12. 15. Застосува ння рекомбінан тн ого поксвір усу за будь-яким з пп.1-13 для приготування вакцини або лікарського засобу. 16. Спосіб уведення кодуючих послідовностей у клітини-мішені, який включає інфікування клітинмішеней вірусом за будь-яким з пп.1-12, де клітина-мішень не є клітиною тварини або людини. 17. Спосіб продукування пептиду, протеїну та/або вірусу, який включає: a) ін фік ування клі тини-хазя їна рекомбінан тним поксвір усом за будь-яким з ПП .1-12, b) культивування інфікованої клітини-хазяїна за придатних умов, та c) виді лення та /або зб ага чення пеп ти ду та /або проте їн у, та /або вір усі в, що продукуються вказаною клітиною-хазяїном. 18. Застосування вірусу за будь-яким з пп.1-12, для одержання вакцини або фармацевтичної композиції для впливу, переважно індукування, імунологічної відповіді в живому тваринному організмі, включаючи людину. 19. Застосування за п.18, де вводять принаймні 102 TCID50 (Інфекційна доза тканинної культури) вірусу. 20. Клітина, яка містить вірус за будь-яким з пп.112. 21. Спосіб продукування рекомбінантного вірусу за будь-яким з пп.1-12, який включає етап уведення щонайменше двох експресійних касет у геном поксвірусу. Винахід стосується рекомбінантних поксвірусів, які містять у вірусному геномі, принаймні, дві експресійні касети, кожна з яких включає ATI промотор коров'ячої віспи або його похідне та кодуючу послідовність, де експресія кодуючої послідовності регулюється вказаним промотором або його похідним. Вірус може використовуватися як вакцина або частина фармацевтичної композиції. Рекомбінантні поксвіруси широко застосовуються для експресування чужорідних антигенів в інфікованих клітинах. Більше того, рекомбінантні поксвіруси на сьогоднішній момент тестовано як багатообіцяючі вакцини для індукування імунної відповіді проти чужорідних антигенів, які експресуються з поксвірусних векторів. Найбільш популярними є з одного боку, пташині поксвіруси та, з іншого боку, віруси коров'ячої віспи. [US 5,736,368 та US 6,051,410] описують рекомбінантний штам вірусу коров'ячої віспи Wyeth, який експресує антигени та протеїни ВІЛ. [US 5,747,324] описує рекомбінантний штам вірусу коров'ячої віспи NYCBH, який експресує лентивірусні гени. ЕР 0 243 029 описує рекомбінантний штам вірусу коров'ячої віспи Western Reserve, який експресує гени ретровірусу людини. Поксвірус домашньої птиці, який містить гени ВІЛ у вірусному геномі розкрито в [US 5,736,368 та US 6,051,410]. Для індукування ефективної імунної відповіді, бажано експресувати не лише одиничний протеїн агенту, проти якого викликається імунна відповідь. Натомість, бажано експресувати стільки різних протеїнів або епітопів вказаного агенту, скільки це можливо, для отримання широкої та ефективної імунної відповіді проти вказаного агенту. Отже, може бути корисним вставити декілька різних експресійних касет в той самий поксвірусний геном, якщо він призначений для використання як вектор для вакцинації. US 5,736,368 описує конструкцію рекомбінантного поксвірусу, який має експресійну касету генів HIV-1 env та HIV-1 gag-pol. Для експресування протеїнів, кодованих різними експре сійними касетами застосовуються різні промотори, а саме, промотор D1 та промотор 40К вірусу коров'ячої віспи. Недоліком цієї стратегії є те, що дії різних промоторів не є однаковими, що призводить до різного рівня протеїнів, експресованих з різних експресійних касет. Більш рівномірний рівень експресії може бути одержаний, коли промотори в різних експресійних касетах поксвірусного геному будуть однаковими. Хоча, недоліком цієї стратегії є ризик того, що може відбутися небажані рекомбінації між гомологічними/ідентичними промоторними послідовностями. Дійсно, було показано Howley та ін. (Gene (1996) 172,233-237), що може бути створений вірус коров'ячої віспи, який містить три промотори р7.5 в різних позиціях вірусного геному; однак, відбуваються рекомбінації між гомологічними промоторними послідовностями, що призводить до появи змішаних геномних популяцій рекомбінантного поксвірусу. Такі змішані та невизначені геномні популяції, які відображають нестабільність вірусного геному не є прийнятними, якщо вони призначені для використання рекомбінантного поксвірусу для вакцинації, зокрема для вакцинації людей. Об'єктом даного винаходу було створення стабільних рекомбінантних поксвірусів, які несуть, принаймні, дві експресійні касети, переважно для генів, які не є природними частинами вірусного геному, коли має бути можливе продукування протеїнів, кодованих вказаними, принаймні, двома різними експресійними касетами в рівних кількостях. Це завдання було вирішено створенням рекомбінантних поксвірусів, які мають у вірусному геномі, принаймні, дві експресійні касети, кожна з яких містить промотор коров'ячої віспи ATI або його похідне та кодуючу послідовність, де експресія кодуючої послідовності регулюється вказаним промотором або його похідним. Даним винаходом було продемонстровано, що поксвіруси, які містять дві або більше копій промо 5 85379 тору ATI, є неочікувано стабільними; було продемонстровано, що нема виявлених рекомбінацій, що пройшли між гомологічними або ідентичними до промоторних послідовностей ATI. Це контрастує із вірусами коров'ячої віспи, які містять у вірусному геномі два або більше промоторів р7.5. Згідно даного винаходу, поксвірус може бути будь-яким поксвірусом, в котрому експресія генів має регулюватися промотором ATI або його похідним. Отже, поксвірус може бути будь-яким вірусом сімейств Chordopoxvirinae та Entomopoxvirinae (див. Fields Virology 3rd edition, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, USA, Chapter: 83, ISBN 07817-0253-4). Віруси з підсімейства Chordopoxvirinae, є зокрема переважними, якщо рекомбінантний поксвірус використовується для експресії генів у ссавцевих тварин, включаючи людей. Зокрема переважними родами, що належать до сімейства Chordopoxvirinae є Orthopoxviruses, Parapoxviruses, Avipoxviruses, Capripoxviruses, Leporipoxviruses та Suipoxviruses. Найбільш переважними є Orthopoxviruses та Avipoxviruses. Прикладами авіпоксвірусів є поксвіруси канарок та домашньої птиці. Прикладом Orthopoxvirus є вірус коров'ячої віспи. Штам вірусу коров'ячої віспи який може бути використаний згідно даного винаходу може бути штамом вірусу коров'ячої віспи, таких штамів як Copenhagen, Temple of Heaven, Wyeth, Western Reserve, Elstree, NYCBH та таке інше. Зокрема, переважним є модифікований вірус коров'ячої віспи Ankara (MVA). MVA був одержаний 516 послідовними пасажами на фібробластах курячих ембріонів штаму вір усу коров'ячої віспи Ankara (CVA) (для огляду дивись Ma yr, A., et al. Infection 3,6-14 [1975]). Як наслідок цих довготривалих пасажів одержаний вірус MVA втратив близько 31 тис. Основ (kb) своєї геномної послідовності, і як наслідок, був описаний як дуже обмежений у відношенні клітин-хазяїв до пташиних клітин (Me yer, H. et al., J. Gen. Virol. 72,1031-1038 [1991]). Було показано, на різноманітних тваринних моделях, що одержаний MVA був досить вірулентним (Ма уг, А. & Danner, К. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225-34). Також, цей штам MVA пройшов тестування в клінічних випробуваннях як вакцина для імунізації людей проти захворювання на віспу (Ma yr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. В 167,375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Згідно даного винаходу може використовуватися будь-який штам MVA. Прикладами штамів вірусу MVA, використовуваних згідно даного винаходу й депонованих у відповідності до вимог Будапештської Угоди є штами MVA 572 та MVA 575 депоновані в Європейській колекції тваринних клітинних культур (European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK)) із депозитними номерами ECACC V94012707 та ЕСАСС V00120707, відповідно, та MVA-BN із депозитним номером ECACC V00083008. Найбільш переважним штамом MVA є MVA-BN або його похідні. Характерні ознаки MVA-BN, опис біологічних тестів, які дозволяють визначити чи є штам MVA є штамом MVA-BN або його похідним 6 та способи, які дозволяють одержувати MVA-BN або його похідні розкрито в [WO 02/42480]. Зміст цієї заявки включено в дану заявку через посилання на неї. Взагалі, бажано використовувати віруси, які не є шкідливими для тварин, включаючи людей, якщо вірус використовується для вакцинації тварин, включаючи людей. Для людей, зокрема, безпечними вірусами є різні штами вірусу коров'ячої віспи, такі як MVA та пташині поксвіруси, такі як поксвірус домашньої птиці та канарковий поксвірус. Для вирощування поксвірусів, еукаріотичні клітини інфікують поксвірусом. Еукаріотичні клітини є клітинами, які можуть бути інфіковані відповідним поксвірусом та дозволять реплікацію та вироблення інфікуючого вірусу. Такі клітини для кожного вірусу є відомими особам досвідченим в цій галузі. Для MVA прикладом цього типу клітин є фібробласти курячого ембріону (CEF) та клітини ВНК (Drexler I., Heller К., Wahren В., Erfle V. and Slitter G., J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). Клітини CEF можуть культивуватися за умов, відомих особам досвідченим в цій галузі. Переважно, клітини культивуються в безсироватковому середовищі в закріплених колбах або ролерних флаконах. Інкубування зазвичай займає від 48 до 96 годин при 37°С±2°С. Для інфікування MVA, переважно беруть в МОЇ від 0,05 до 1 ТСID50 й інкубування зазвичай займає від 48 до 72 годин при 37°С±2°С. Промоторна послідовність гену інклюзивного протеїну типу А вір усу коров'ячої віспи (промотор ATI) є відомою особі, обізнаній в даній галузі. В цьому контексті робиться посилання на вхідний номер D00319 в Genebank. Переважною послідовністю промотору ATI є послідовність, відома як SEQ ID.: No.1 яка являє собою наступне: 5' GTTTT GAATA АААТТ TTTTT АТААТ АААТ 3' Згідно даного винаходу можна використати промотор ATI як зазначено в SEQ ID.: No.1 або використовува ти похідний промотору ATI, який може бути підпослідовністю послідовності SEQ ID.: No.1. Термін "підпослідовність послідовності згідно із SEQ. ID.: No.1" стосується більш коротшого фрагменту послідовності SEQ. ID.: No.1, який все ще залишається активним як промотор, зокрема пізній промотор вірусу коров'ячої віспи. Типовий фрагмент послідовності SEQ. ID.: No.1 має довжину принаймні 10 нуклеотидів, більш переважно 15 нуклеотидів, ще більш переважно 20 нуклеотидів, найбільш переважно 25 нуклеотидів послідовності SEQ. ID.: No.1. Підпослідовність переважно може мати нуклеотиди з 25 по 29 послідовності SEQ. ID.: No.1, тобто послідовність 5'-ТАААТ-3' розташована в 3' кінці послідовності SEQ. ID.: No.1. Підпослідовність переважно може мати нуклеотиди з 22 по 29 послідовності SEQ. ID.: No.1, тобто послідовність 5'-ТАААТ-3' розташована в 3і кінці послідовності SEQ. ID.: No.1. Промотор може бути вставлений раніше кодуючої послідовності, таким чином, що нуклеотиди з 28 по 29 послідовності SEQ. ID.: No.1 (підкреслені в наведеній послідовності) є частиною стартового кодону трансляції 5' ATG 3'. Або, промотор може бути відділений декількома нуклеотидами від стартового кодону трансляції. Спейсер між 3' 7 85379 кінцем промотору, згідно до SEQ ID.: No.1 та А в стартовому кодоні 5'ATG 3', переважно, менший за 100 нуклеотидів, більш переважно, менший за 50 нуклеотидів та ще більш бажано, менший за 25 нуклеотидів. Однак, спейсер може бути значно довшим за довжину промотора, залишаючись здатним спрямовувати експресію кодуючої послідовності, розташованої пізніше (нижче) промотору. Похідний промотору ATI також може бути послідовністю, яка має одну або більше нуклеотидних замін, делецій та/або вставок відповідно до послідовності SEQ ID.: No.1 або її підпослідовностей, де вказані похідні є все ще активними як промотори, зокрема, як пізній промотор вірусу коров'ячої віспи. Послідовність, яка має одну або більше нуклеотидних замін є послідовністю, у якої один або більше нуклеотидів послідовності згідно з SEQ ID.: No.1 заміщені різними нуклеотидами. Послідовність, яка має одну або більше нуклеотидних вставок є послідовністю, у якої один або більше нуклеотидів введені в один або більше локусів послідовності згідно з SEQ ID.: No.1. Послідовність, яка має одну або більше нуклеотидних делецій є послідовністю, у якої один або більше нуклеотидів послідовності згідно з SEQ ID.: No.1 видалено в одному або більше локусів. У похідних SEQ ID.: No.1 делеції, заміни та вставки можуть бути поєднані у доній послідовності. Переважно похідне має гомологію принаймні 40%, більш бажано принаймні 60%, навіть більш бажано принаймні 80%, найбільш бажано принаймні 90% якщо порівнювати з послідовністю SEQ ID.: No.1. Згідно з найбільш бажаним втіленням не більше ніж 6 нуклеотидів, навіть більш бажано не більше ніж 3 нуклеотиди замінюють, видаляють та/або вводять у послідовність SEQ ID: No.1. Зокрема, може бути бажаним залишити нуклеотиди з 25 по 29 послідовності SEQ ID.: No.1, тобто, послідовність 5'-ТАААТ-3' в промоторі для досягнення промоторної активності. Також може бути переважним залишити нуклеотиди з 22 по 29 послідовності SEQ ID.: No.1, тобто, послідовність 5'-ТААТАААТ-3 в промоторі. Вище згадані пояснення щодо розташування промотору ATI або його підпослідовності також застосовні до вище визначених послідовностей, які мають одну або більше нуклеотидних замін, делецій та/або вставок відповідно до послідовності згідно із SEQ ID.: No.1 або відповідно до її послідовностей. Велика кількість документів рівня техніки дозволяє особі, обізнаній в даній галузі передбачити які похідні SEQ ID.: No.1 залишать біологічну активність в сенсі дії як поксвірусного вірусного промотору, зокрема як пізнього вірусного промотору коров'ячої віспи. В цьому контексті посилання робиться на Chakrarbarti et al., Biotechniques (1997) 23,1094-1097 та Davison and Moss, J. Мої. ВіоІ. (1989) 210,771-784. Більше того, спеціаліст, обізнаний у даній галузі може легко перевірити чи фрагмент зберігає активність, як поксвірусний промотор, зокрема, пізній вірусний промотор коров'ячої віспи. Зокрема, похідне послідовності можна клонувати вище репортерного гену в плазмідному конструкті. Вказаний конструкт може бути трансфі 8 ковано в еукаріотичну клітину або клітинну лінію, таку як клітини CEF або ВНК, які були інфіковані поксвірусом. Поксвірус використовуваний для трансфекції, переважно є поксвірусом з того ж роду, та ще більш переважно тим самим поксвірусом, в геном якого має бути вставлений поксвірус. Експресія репортерного гену потім визначається й порівнюється із експресією репортерного гену, контрольованого промотором, згідно із послідовністю SEQ ID.: No.1. Похідний згідно даного винаходу, переважно є похідним, який має промоторну активність у вказаній тест системі, принаймні 10%, бажано 30%, більш бажано 50%, ще більш бажано 70%, найбільш бажано 90%, порівняно із активністю промоторної послідовності SEQ ID.: No.1. Також ці похідні послідовності SEQ ID.: No.1 в розумінні даного винаходу можуть бути такими, що мають вищу промоторну активність ніж SEQ ID.: No.1. Згідно даного винаходу рекомбінантний поксвірус містить, принаймні дві експресійні касети, кожна з яких містить промотор ATI або його похідне. Іншими словами, геном рекомбінантного поксвірусу може містити два або більше промоторів ATI або його похідних. Промотори ATI у вір усному геномі можуть бути однаковими або різними. Таким чином, може бути, що всі промотори ATI будуть мати послідовність згідно з SEQ ID.: No.1. Також може бути, що всі промотори ATI є одним похідним послідовності згідно з SEQ ID.: No.1. Також, один або більше промоторів ATI можуть мати послідовність згідно з SEQ ID.: No.1 та один або більше промоторів AT! в тому ж поксвірусному геномі можуть бути похідними послідовності згідно з SEQ ID.: No.1. Якщо такий поксвірусний геном містить два або більше похідних промотору ATI, ці похідні можуть бути однаковими або різними. Згідно наступної альтернативи всі промотори ATI в поксвірусному геномі можуть бути різними похідними послідовності згідно до SEQ ID.: No.1. В загальних рисах винахід відноситься до рекомбінантних поксвірусів, які мають принаймні, два промотори ATI або їхні похідні в поксвірусному геномі. Такими чином, вірусний геном може містити, наприклад, два, три, чотири, п'ять, шість або більше промоторів ATI або їхніх похідних у вірусному геномі. Промотори ATI або їхні похідні є зазвичай частиною експресійних касет, кожна з яких містить промотор коров'ячої віспи ATI або його похідне та кодуючу послідовність, експресія котрої регулюється вказаними промоторами. Кодуючі послідовності можуть бути будь-якими послідовностями, експресія котрих має контролюватися промотором ATI або його похідним. Згідно іншої можливості, принаймні один з промоторів ATI в поксвірусному геномі може бути використаний для експресування гену, який вже є частиною поксвірусного геному. Такий ген може бути геном, який є природною частиною вірусного геному або чужорідним геном який вже вбудовано в поксвірусний геном. В цих випадках промотор ATI є вставленим вище гену в поксвірусному геномі, експресія котрого має бути контролюванню промотором ATI. 9 85379 Крім того або додатково принаймні один з промоторів ATI або його похідних можуть бути частиною експресійної касети, котру вбудовано в поксвірусний геном. Експресійні касети, що містять промотор ATI або його похідні та кодуючі послідовності можуть бути вставлені в будь-яке придатне місце у вірусному геномі. Не обмежуючись до наступних прикладів, придатні сайти вставки можуть бути вибрані з поміж: (і) другорядних генів, таких як ген ТК, (іі) генів, необхідних для реплікації вірусу, якщо ця функція доповнюється клітиною, яка використовується для розмноження вірусу; (ііі) міжгенних регіонів поксвірусного геному, де значення "міжгенний регіон" стосується, переважно, тих частин вірусного геному, які розташовано між двома суміжними генами, які не включають кодуючі послідовності; (iv) сайтів поксвірусного геному, де природно зустрічаються делеції. Прикладом вірусного геному, який має делеції, що природно зустрічаються є геном MVA, в котрому певні регіони, як наприклад, в геномі вірусу коров'ячої віспи штаму Copenhagen. Як зазначено вище, сайти вставки не є обмеженими до цих переважних сайтів вставки, оскільки в розумінні даного винаходу є те, що експресійна касета може бути вставлена будь-де у вірусному геномі, де це можливо для одержання рекомбінантів, які можуть бути ампліфіковані або розмножені в, принаймні, одній клітинній системі, такій як фібробласти курячого ембріону (клітини CEF) у випадку MVA та інши х поксвірусів, таких як віруси коров'ячої віспи взагалі та пташині поксвіруси. Різні експресійні касети/ATI промотори або їхні похідні можуть бути вставлені в різні сайти вставки в поксвірусному геномі. З різних причин, може бути бажаним вставка двох або більше експресійних касет в той самий сайт вставки поксвірусного геному. Однак, в такому випадку має бути виключено те, що гомологічна рекомбінація відбувається між двома різними експресійними касетами. Гомологічна рекомбінація може призводити до рекомбінантних вірусів, в яких частина експресійних касет є видаленими. Оскільки не видалено значних частин поксвірусного векторного геному, одержаний рекомбінант є життєздатним. Отже, відсутня селекція для вірусів, які мають дві або більше експресійних касет в тому ж сайті вставки. Для уникнення таких небажаних рекомбінаційних подій вже стало рівнем техніки використання двох різних промоторів, якщо дві або більше експресійних касет вводяться в той самий сайт вставки. Згідно даного винаходу, тепер можливо вбудо вувати дві або більше експресійних касет, кожна з яких включає промотор ATI або його похідне в той самий сайт вставки, оскільки не відбуваються гомологічні рекомбінації між промоторами в експресійних касетах. Таким чином, згідно переважної реалізації, принаймні дві, якщо не всі з експресійних касет вставлені в той самий сайт вставки в поксвірусному геномі. В цьому випадку різні експресійні касети є безпосередньо суміжні без поксвірусних послідовностей між різними експресійними касетами або, принаймні, із більш короткими поксвірусними 10 послідовностями між різними експресійними касетами. Методи, необхідні для конструювання рекомбінантного поксвірусу є відомими особі обізнаній в даній галузі. За для прикладу, експресійну касету та/або промотор ATI або його похідне може бути вбудовано в поксвірусний геном шляхом гомологічної рекомбінації. Для цього нуклеїнову кислоту трансфікують у придатну клітинну лінію, де нуклеїнова кислота включає експресійну касету та/або промотор ATI або його похідне фланковані нуклеотидними ланками, які гомологічні до регіону поксвірусного геному в котрому вставлена експресійна касета та/або промотор ATI або його похідне. Для MVA придатними клітинами є клітини CEF та ВНК. Клітини інфіковані поксвірусом та в інфікованих клітинах гомологічна рекомбінація відбувається між нуклеїновою кислотою та вірусним геномом. Крім того, також можливо спочатку інфікувати клітини поксвірусом і потім трансфікувати нуклеїнову кислоту в інфіковані клітини. Повторна рекомбінація відбувається в клітинах. Рекомбінантний поксвірус потім селектується способом відомим з рівня техніки. Конструювання рекомбінантних поксвірусів не обмежується цим окремим способом. Навпаки, будь-який придатний спосіб відомий особі, обізнаній в даній галузі, може бути використаний для цього. Промотор ATI в рекомбінантному поксвірусі може бути використаний для керування експресією будь-якої кодуючої послідовності(ей). Кодуюча послідовність може, переважно, кодувати, принаймні, один антигенний епітоп або антиген. У цьому випадку рекомбінантний поксвірус може бути використано для експресії вказаного антигену після інфікування клітин в організмі, наприклад, ссавця включаючи людину. Презентація вказаного антиген/антитіло може викликати імунну відповідь в організмі, що може привести до вакцинації організму проти агенту, з якого було одержано антиген/епітоп.Більш конкретно, епітоп/антиген може бути частиною більшої амінокислотної послідовності, такої, як поліепітоп, пептид або протеїн. Прикладами таких поліепітопів, пептидів або протеїнів можуть бути поліепітопи, пептиди або протеїни одержані з (і) вірусів, таких, як ВІЛ, HTL V (вір ус Тклітинного лейкозу людини), вірус герпесу, вірус тропічної лихоманки, вірус поліомієліту, вір ус кору, вірус свинки, вірус краснухи, віруси гепатиту та інші, (іі) бактерій, (ііі) грибків. Протеїни, пептиди або епітопи, експресовані з різних експресійних касет, можуть бути одержані з одного і того ж збудника, такого, як вірус, бактерія або грибок. За для прикладу, всі продукти, експресовані з експресійних касет, можуть бути протеїнами ВІЛ. Якщо всі продукти одержані від одного агента, то є можливим індукувати дуже широку імунну відповідь проти вказаного агента. Крім того, також можливо, що протеїни, пептиди або епітопи, експресовані з різних експресійних касет, походять від одного агента. За для прикладу, продукти, одержані з експресійних касет в одному поксвірусному геномі, походять від різних вірусів, таких як віруси свинки, кіру та краснухи. Згідно цієї реалізації, є можливим використовувати один рекомбінан 11 85379 тний вірус для індукування імунної відповіді проти декількох агентів. Крім того, принаймні, одна з кодуючи послідовностей може кодувати терапевтичну речовину, таку як інтерлейкіни, інтерферони, рибозими, ензими і таке інше. Рекомбінантний поксвірус, згідно даного винаходу, може вводитись в тіло тварини або людини згідно знань особи обізнаної в даній галузі. Отже, рекомбінантний поксвірус, згідно даного винаходу, може використовуватись як медикамент (наприклад, фармацевтична композиція) або вакцина. Фармацевтична композиція або вакцина в загальному випадку може включати один або більше фармацевтично придатний та/або дозволений носії, домішки, антибіотики, консерванти, адюванти, дилюенти та/або стабілізатори додатково до рекомбінантного вірусу. Так додатковою речовиною може бути вода, сольовий розчин, гліцерин, етанол, змочуючі або емульгуючі речовини, рН буферні речовини або подібні. Прийнятними носіями є типово великі, молекули, які повільно метаболізують, такі, як протеїни, полісахариди, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти, полімерні амінокислоти, амінокислотні кополімери, ліпідні агрегати або подібні. Для виготовлення фармацевтичних композицій або вакцин рекомбінантний поксвірус перетворюють в фізіологічно прийнятну форму. Це можна здійснити на основі досвіду у виго товленні поксвірусних вакцин, які використовуються для вакцинації проти віспи (як це описано Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99,2386-2392). Наприклад, якщо поксвірус є MVA, очи щений вірус може зберігатися при -80°С із титром 5´108 TCID50/ml в приблизно 10mМ Tris, 140mМ NaCI pH 7.4. Для виготовлення вакцинних ін'єкцій, наприклад, 101109 часток рекомбінантного вірусу, згідно даного винаходу ліофілізують в фосфотно-буферному сольовому розчині (PBS) в присутності 2% пептону та 1% альбуміну людини в ампулі, бажано в скляній ампулі. Або, вакцинні ін'єкції можуть бути одержані поступовою ліофільною сушкою вірусу в композиції. Ця композиція може додатково містити такі добавки як, манітол, декстрин, цукор, гліцин, лактозу або полівінілпіролідон або інші добавки такі як, антиоксиданти або інертний газ, стабілізатори або рекомбінантні протеїни (наприклад, сироватковий альбумін людини) придатні для введення in vivo. Типовий склад придатний для ліофільного сушіння рекомбінантного MVA містить 10 тМ Tris-буфер у, 140mМ NaCI, 18.9г/л Декстрин (MM 36.000-40.000), 45г/л Сахарози, 0.108g/l моногідрату калієвої солі L-глютамової кислоти із рН 7.4. Потім скляна ампула запаювалася й могла зберігатися при температурі від 4°С до кімнатної протягом декількох місяців. Однак, доки нема потреби, ампули зберігаються при температурах нижче -20°С. Для вакцинації або терапії ліофілізат може бути розведений у від 0,1 до 0,5мл водного розчину, переважно води, фізіологічного розчину або Trisбуферу, та введено системно або локально, наприклад, парентерально, внутрішньом'язево або іншим шляхом введення відомим обізнаному про 12 фесіоналу. Спосіб введення, доза та кількість введень може бути оптимізована відомим чином особою обізнаною в даній галузі. Отже, згідно відповідної реалізації, винахід відноситься до способу впливу, переважно індукування імунологічної відповіді в живому тілі тварини, включаючи людину, що включає введення вірусу, композиції або вакцини, згідно даного винаходу тварині або людині, що лікується. Якщо рекомбінантний вірус є рекомбінантним MVA, вакцинні дози типово містять принаймні 102, переважно, принаймні 104, більш переважно, принаймні 106, ще більш переважно, від 108 до 109 TCID50 (tissue culture infectious dose - доз інфікування тканинної культури) вірусу. Також, винахід стосується способу введення, принаймні, двох кодуючи послідовностей в клітини-мішені, що включає інфікування клітин-мішеней вірусом згідно даного винаходу. Клітини-мішені можуть бути клітинами в котрих вірус здатний реплікуватися або клітини які можуть бути інфіковані рекомбінантним вірусом, однак в котрих вірус не реплікується, таких як всі типи клітин людини у випадку рекомбінантного MVA. Також винахід відноситься до способу одержання пептиду, протеїну та/або вірусу, що включає інфікування клітини-хазяїна рекомбінантним вірусом згідно даного винаходу, наступним культивуванням інфікованих клітин-хазяїнів за сприятливих умов, й після того наступним виділенням та/або збагаченням протеїну та/або вір усів вироблених вказаною клітиною-хазяїном. Якщо це призначено для вироблення, тобто, ампліфікації вірусу, згідно даного винаходу, клітина має бути клітиною, в якій вірус здатен реплікуватися, такою, як клітини CEF або ВНК, у випадку рекомбінантного MVA. Якщо це призначено для вироблення пептиду/протеїну, кодованого даною кодуючої послідовністю, експресія котрої контролюється промотором ATI або його похідним, клітина може бути будь-якою клітиною, яка може бути інфікована рекомбінантним вірусом та яка дозволяє експресування пептиду/протеїну, кодованого поксвірусом. Також, винахід стосується клітин інфікованих вірусом згідно даного винаходу. Фіг.1 та Фіг.2: Схематичне представлення рекомбінантного векторів pBN70 (Фіг.1) та pBN71 (Фіг.2) F1A137L = Фланк 1 регіону вставки; F2A137L = Фланк 2 регіону вставки; F2rpt = повтор Фланку 2; ргАТІ = промотор ATI; pr7.5 = р7.5 промотор; GUS = кодуючого регіону GUS; NS1 = NS1 кодуючого регіону; NPTII = неоміцинова резистентність; IRES = зовнішній сайт рибосомального входу; EGFP = регіон, що кодує протеїн посиленої зеленої флюоресценції; AmpR = ген резистентності до ампіциліну. Фіг.3: Аналіз RT-PCT для визначення експресії гену NS1 в клітинах інфікованих MVA-mВN30 (Фіг.3А) або MVA-mBN31 (Фіг.3В). В усіх випадках коли було проведено PCR праймер був специфічний до гену NS1. 13 85379 А) М: маркер молекулярної маси; смуга 1: аналіз із плазмідою pBN70 (позитивний контроль); смуга 2: аналіз без додавання нуклеїнових кислот (негативний контроль); смуга 3: PCR із RNA виділеною з клітин ВНК інфікованих MVA-mBN30 без додавання зворотньої транскриптази; смуга 4: RTPCR із RNA виділеною з клітин ВНК інфікованих MVA-mBN30; смуга 5: PCR із RNA виділеною з клітин ВНК інфікованих MVA-BN без додавання зворотньої транскриптази; смуга 6: RT-PCR із RNA виділеною з клітин ВНК інфікованих MVA-BN. В) М: маркер молекулярної маси; смуга 1: PCR із RNA з клітин інфікованих mBN31; смуга 2: RTPCR із RNA з клітин інфікованих різними рекомбінантними MVA які мають в геномі ген NS1; смуга 3: PCR із RNA з клітин інфікованих MVA-BN; смуга 4: PCR із RNA з клітин інфікованих BN31 (без додавання зворотньої транскриптази); смуга 5: PCR із RNA з клітин інфікованих різними рекомбінантними MVA, які мають в геномі ген NS1 (без додавання зворотньої транскриптази); смуга 6: PCR із RNA з клітин інфікованих MVA-BN (без додавання зворотньої транскриптази); смуга 7: аналіз із плазмідою pBN71 (позитивний контроль); смуга 8: аналіз без додавання нуклеїнових кислот (негативний контроль); Приклад Наступний приклад глибше проілюструє даний винахід. Має бути добре зрозуміло особі обізнаній в даній галузі, що наданий приклад ні в якому разі не може бути тлумачено як обмеження застосовності технології наданої даним винаходом до цього прикладу. Стабільна вставка двох чужорідних генів, регульованих промотором Cowpox ATI в одиночному сайті геному MVA Метою цього прикладу було продемонструвати, що вставка двох чужорідних генів регульованих промотором ATI є стабільною. Наступний приклад демонструє стабільність рекомбінантного MVA, який містить у вірусному геномі дві копії промотору ATI. Для цього промотор ATI коров'ячої віспи було злито із геном GUS (Е. соїі β-Глюкуронідаза) та неструктурним геном 1 (NS) вірусу тропічної лихоманки, відповідно. Для порівняння ген GUS також було злито із природним промотором вірусу коров'ячої віспи pr7.5. ATI промотор-NSI гену експресійної касети, а також ATI промотор-GUS гену експресійної касети або р7.5 промотор-GUS гену експресійної касети було вбудовано в рекомбінантний вектор, який містив послідовності гомологічні до геному MVA. (Фіг.1 та 2). В одержаних плазмідах pBN70 (ATI промоторNSI гену експресійної касети та ATI промотор-GUS гену експресійної касети) та pBN71 (ATI промоторNSI гену експресійної касети та р7.5 промоторGUS гену експресійної касети) експресійні касети були фланковані послідовностями гомологічними до послідовностей в геномі MVA в які були вставлені експресійні касети. Гомологічні послідовності спрямовували вставку експресійних касет в міжгенний регіон (IGR) 136-137 геному MVA. Клітини CEF були інфіковані MVA-BN та трансфіковані pBN70 та pBN71, відповідно. В клітинах гомологічна рекомбінація, що відбувалася між геномом MVA 14 та рекомбінаційною плазмідою призводила до появи рекомбінантних геномів MVA. Рекомбінанти були піддані декільком циклам бляшкової очистки й були пасажовані на клітини CEF (загальна кількість пасажів включаючи бляшкову очистку: 20). Рекомбінанти було перевірено на стабільність, експресію вставлених генів та послідовність рекомбінантного конструктів MVA, які містили два різних набори двох промоторів. Аналіз послідовності, PCR та функціональні тести показали, що рекомбінантні фрагменти вбудовано правильно та те, що вставки, навіть коли промотор ATI було вбудовано двічі в геном, є стабільними та функціональними. Матеріали: Первинні клітини CEF; MVA-BN із титром 108 ТСЮ5о/мл; трансфекційний набір Effectene (Qiagen); клітинне культуральне середовище VPSFM (Gibco BRL); G418 (Gibco BRL); DNA набір швидкого очищення крові Nucleospin (Macherey Nagel); полімераза Triple Master DNA (Eppendorf); Oligos (MWG); Набір для секвенування DCTS Quickstart (Beckman Coulter). Методи: Рекомбінаційні вектори pBN70 та pBN71 (Фіг. 1 та 2) були клоновані згідно стандартних протоколів, відомих особі, обізнаній в даній галузі. 5´105 клітин CEF було висіяно на кожну реакцію трансфекції в лунки 6-лункової планшетки та витримано в VP-SFM протягом ночі при 37°С та 5% СO2. Клітини були інфіковані MVA-BN (mоі 1.0) в 0.5мл VP-SFM на лунку та інкубовано протягом 1 години при кімнатній температурі в шейкері. Трансфекція лінеаризованої pBN70 та 71 була проведена, як описано в протоколі виробника (Qiagen). Отримані рекомбінантні віруси були пасажовані декілька разів за селективних умов (G418, 300пг/мл) та були виділені одиночні бляшки, ампліфіковані та тестовані допоки не було генеровано очищені клони. Аналізований вірус було остаточно пасажовано 20 разів. Результати: 1. Конструювання рекомбінантних вірусів Були створені два рекомбінантні MVA, що експресуються NSI-та GUS-послідовностями під контролем двох різних промоторних комбінацій (ATINS1/ATI-GUS або ATI-NS1/p7.5-GUS). Ці послідовності разом із селекційною касетою IRES/EGFP (internal ribosome entry site/enhanced green fluorescent protein - зовнішній сайт входу рибосоми/протеїн посиленої зеленої флуоресценції) були вставлені в 136-137 сайт IGR (міжгенний регіон між ORF A136L та A137L геному MVA) геному MVA, згідно методів, відомих особі, обізнаній в даній галузі. Ці вір уси були очи щені та пасажовані 20 разів за селективних умов. Обидва рекомбінантні MVA були ампліфіковані до рівня первинної сировини (1´175cm 2 в бутлі). Послідовність промотору ATI в цьому прикладі відповідає послідовності SEQ ID.: No.1. 2. Експресія кодуючого регіону EGFP Для визначення функціональності вставленого тестового гену в IGR 136-137 проводили флуоресцентні спостереження протягом пасажування. Як 15 85379 би вставлений ген не був функціональним, то не спостерігалася б експресія EGFP. ВНК інфіковані MVA-mBN30 та MVA-mBN31 ясно вказують на те, що ген вставлений в 136-137 IGR був транскрибований. 3. PCR аналіз 136-137 IGR MVA-mBN30 та MVA-mBN31 Для виключення вмісту можливих пусти х векторів в сайті IGR 136-137 та для перевірки вмісту у вірусному геномі вставок очікуваного розміру було проведено аналіз PCR. Для цього були застосовані праймери, які зв'язувалися із регіонами, що фланкують сайти вставки. Очікуваними були смуги PCR для праймерів, які зв'язувалися у Фланку 1 та 2, які були наступними (і) 3.4kb для рекомбінантного MVA-mBN30, (ii) 3.5kb для рекомбінантного MVA-mBN31 та (ііі) 212 Ьр для пустого вектора MVA-BN. Смуги очікуваного розміру були виявлені для MVA- тВІМЗО та MVA-mBN31, що вказує на те, що рекомбінанти мають очікувану геномну структур у. Не було знайдено вірусів дикого типу в жодному з протестованих зразків MVA-mBN30 або MVA-mBN31DNA. Також, контроль порожніх векторів MVA-BN (порожній вектор) вказав на очікуваний 212bр продукт в обох рекомбінантах MVA. В негативному контролі не було виявлено сигналу. Таким чином, ефективна селекція та розділення рекомбінантних векторів від порожніх векторів MVA-BN було одержано селекційним тиском. 4. Секвенування регіону 136-137 Результати секвенування вказують на те, що промотори mBN31 та mBN30 та промотор GUS були вставлені без змін в парах основ в сайті IGR 136-137. Для NS1 в mBN30 також не було виявлено змін в послідовності пар основ. В mBN31 NS1 мали місце чотири точкові мутації в послідовності пар основ (позиція 1315: С замість G, позиція 1582: G замість А, позиція 1961: А замість С та позиція 1963: G замість Т). Дві з них (в позиціях 1582 та 1963) не призводили до змін в амінокислотах. Незалежно від незначних відхилень з результатів секвенування чітко зрозуміло, що обидва рекомбінанти, mBN31 та mBN30, містять цілі послідовності NS1. Більше того, з даних секвенування можна зробити висновок, що ген NS1 стабільно включений в рекомбінант, mBN30 який містить два промотори ATI. Експерименти демонструють стабільність рекомбінантів, хоча у вір усний геном включено дві ідентичні промоторні послідовності. 5. Аналіз експреси гену NS1 та гену GUS в рекомбінантах mBN30 та mBN31 Описані вище дані PCR та послідовності вказують на те, що ген NS1 та ген GUS містяться в геномі рекомбінантів MVA- mBN30 та 31. Для перевірки експресії цих генів з вірусного геному були проведені RT-PCR регіону NS1 та функціональний тест, а також підрахунок вироблених протеїнів GUS. 5.1 RT PCR регіону NS1 Цей експеримент було виконано для демонстрації того, що рекомбінанти MVA- mBN30 та mBN31, які містять ген NS1, вставлений в сайт IGR 136-137 функціонально експресує NS1 як mRNA. Клітини ВНК були інфіковані вірусами MVA-mBN30 та mBN31, відповідно. RNA була виділена з цих 16 клітин й використана для аналізу RT-PCR. Результати чітко вказують на те, що NS1 експресується з обох вірусів в інфікованих клітинах ВНК. Забруднення вірусною DNA може бути виключено, оскільки не було виявлено жодного сигналу PCR, коли було пропущено етап оберненої транскрипції. Водний контроль був негативним та для плазмідного позитивного контролю обох вірусів було виявлено чисті смуги PCR (Фігура 3). 5.2 Вимірювання активності GUS Для того, щоб продемонструвати експресію GUS було вбудо вано в MVA-mBN30 та mBN31 після 20 циклів пасажування GUS активність була визначена кількісно. Таблиця 1 чітко вказує на те, що GUS було експресовано в обох рекомбінантних вірусах, тоді як експресія GUS не була визначена MVA-BN без вставки. Розведення 1:2 1:10 1:100 mBN30 0,968 0,224 0,022 mBN31 0,414 0,089 0,012 BN 0,007 0,007 0,007 Таблиця 1: Вимірювання активності GUS в MVA-mBN30, MVA-mBN31 та MVA-BN після 20 пасажів. MVA-mBN30 та MVA-mBN31 були загалом пасажовані 20 разів. Клітини були інфіковані обома рекомбінантними вірусами й зібрані після 24 годин в Лізиному буфері. Активність GUS визначалася згідно методів, відомих особі, обізнаній в даній галузі. Значення активності були визначенні за абсорбцією при 415 нм. Значення 2,0 було виключено. Критерії якості: PCR аналіз IGR 136-137 Не повинні спостерігатися доріжки в смуга х негативного контролю, в позитивному контролі повинні спостерігатися лише доріжки очікуваного розміру. Для MVA-BN очікуваним є фрагмент 212bр. Секвенування та PCR регіону IGR 136-137 Ампліфікація PCR вірусної DNA-мішені із праймерами повинна виявляти одиничний фрагмент очікуваної довжини. Збирання послідовностей має давати в результаті одну цілісну послідовність, що представляє фрагмент DNA очікуваної довжини. Короткі одноланцюгові розтягнення беруться до уваги, якщо в даному регіоні не трапляються мутації. До того ж, кінці цілісної послідовності можуть бути лише одноланцюговими, беручи до уваги гетерологічну природу продуктів ампліфікації PCR. Послідовність тестового зразка має показувати гомологію >/=97% до стандартної послідовності або відповідної послідовності з бази даних. RT-PCR для NS1 Не повинні спостерігатися доріжки в смуга х негативного контролю, в позитивному контролі повинні спостерігатися лише доріжки очікуваного розміру. Для pBN71 очікуваним є 909bр фрагмент та для pBN70 очікуваним є 907bр фрагмент. Висновки: Після 20 пасажів у селективних умовах, PCR аналіз 136-137 міжгенного регіону показав відсутність забруднення пустими векторами MVA-mBN31 (ATI-NS1/p7.5-GUS) або MVA-mBN30 (ATI-NS1/ATIGUS). Для MVA-mBN30 PCR показав, що не відбулося гомологічної рекомбінації в ATI сайті. MVA 17 85379 mBN30 та mBN31 було протестовано (1) фінальною PCR для того, щоб продемонструвати, що матеріал не містить пустих векторів, та що обидва гени залишаються вбудованими, навіть коли обидва знаходяться під одним і тим же промотором у одному і тому ж IGR сайті (для mBN30), (2) секвенуванням регіону для того, щоб продемонструвати, що послідовність незмінна (3) функціональною Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 18 експресією GUS кількісним GUS аналізом та RTPCR для NS1. Результати досліджень показують, що подвійні вставки двох різних генів у один і той самий IGR під контроль одного і того ж промотору не дають в результаті рекомбінаційних подій у промоторному сайті навіть після великої кількості пасажів. Обидва вбудованих гени продемонстрували, що вони є такими, що експресуються. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601