Антигензв’язувальна молекула з афінністю до plgf

1. Антигензв’язувальна молекула з афінністю до PLGF, яка відрізняється тим, що вона містить ділянки CDR, що відповідають SEQ ID NO:17-22. 2. Антигензв’язувальна молекула за п. 1, яка є молекулою, вибраною з групи, що складається з Fab, Fab' або F(ab')2, розчинної або заякореної в 2 (19) 1 3 94707 4 утворення спайок, захворювань ока, легеневої гіпертензії і судинної кровотечі. 16. Спосіб за п. 15, в якому вказаний рак вибраний з групи, яка складається з раку товстої кишки, раку молочної залози, раку підшлункової залози і меланом. 17. Застосування антигензв’язувальної молекули за п. 1 для скринінгу сполук з адитивним ефектом відносно інгібування PLGF при лікуванні раку. 18. Застосування антигензв’язувальної молекули за п. 1 як діагностичного засобу in vitro. 19. Застосування антигензв’язувальної молекули за п. 1 для виробництва лікарського засобу для лікування і/або профілактики небажаного ангіогенезу при патологічному стані у ссавця. Галузь винаходу Даний винахід належить до нових антитіл і їх фрагментів і похідних, зокрема, придатних для інгібування ангіогенезу при патологічних станах. Винахід також належить до ліній клітин, які продукують специфічні антитіла. Даний винахід належить до фармацевтичних композицій, що містять антитіла, фрагменти і/або похідні за винаходом, і належить до способів профілактики і лікування ангіогенезу і/або судинної кровотечі там, де вони є небажаними як, наприклад, при формуванні пухлини, захворюваннях ока, легеневій гіпертензії і запальних розладах, і способів профілактики і лікування кісткових порушень, таких як остеопороз. Передумови винаходу Патологічне формування кровоносних судин додає внесок в патогенез множини захворювань з високою захворюваністю і смертністю. Виявлення механізмів, які лежать в основі росту судин, могло б дозволити розробити терапевтичні стратегії для стимулювання росту судин в ішемізованих тканинах або для придушення їх утворення в пухлинах. У нещодавніх дослідженнях з направленого впливу на гени в ембріонах ідентифікували деякі механізми, залучені до початкового формування ендотеліальних каналів (ангіогенез) і їх подальшого дозрівання за допомогою покриття гладком'язовими клітинами (артеріогенез). З'являються дані про те, що різні молекулярні механізми можуть опосередковувати ріст кровоносних судин при патологічних станах, але молекулярні учасники залишаються значною мірою невідомими. Встановлено, що фактор росту ендотелію судин (VEGF) залучений до розвитку і патологічного росту судинної мережі (Ferrara N. et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 237, 1-30). Більше того, також показано, що плацентарний фактор росту (PLGF), гомолог VEGF, є специфічним модулятором VEGF при багатьох патологічних станах, таких як ішемічна ретинопатія, утворення пухлин, запа-/льні розлади і набряк. Показано, що миші PLGF мають порушений ангіогенез і артеріогенез при захворюванні (Carmeliet P. et al., 2000, J. Pathol. 190, 387-405), в той час як фізіологічний ангіогенез у нормальних здорових тварин залишається незачепленим. Таким чином, інгібітори PLGF мають величезний потенціал для лікування захворювань, при яких ангіогенез або артеріогенез додають внесок в патогенез захворювання. У даній галузі відомі інгібітори PLGF, такі як козячі поліклональні антитіла проти PLGF людини (R&D Pharmaceuticals, Abingdon, UK) і курячі поліклональні антитіла (Gassmann et al., 1990, Faseb J. 4, 2528). Ці антитіла застосовують для досліджень за допомогою вестерн-блотингу, гістохімії і імунопреципітації. У WO 01/85796 описане застосування інгібіторів PLGF, включаючи моноклональні антиPLGF антитіла, для лікування або профілактики захворювань, таких як утворення пухлин. Більш конкретно, описане одержання мишачих моноклональних антитіл, які повністю інгібують зв'язування PLGF-2 миші зі своїм рецептором Flt-1, де антитіло Mab-PL5D11 відібране, як таке, що має найбільш ефективну інгібіторну активність. Описане застосування антитіл в моделях патологічного ангіогенезу на тваринах. Антитіла, одержані у тварин, мають характеристики, які можуть значно обмежувати їх застосування для лікування людини. Як чужорідні білки, вони можуть викликати відповідь на імуноглобуліни (які для мишачих антитіл означають людські антитіла проти миші або НАМА), яка знижує або нейтралізує їх терапевтичну ефективність і/або провокує алергічні або гіперчутливі реакції у пацієнтів, як показано в Jaffers et al., 1986 (Transplantation 1986 41:572). У той час як застосування людських моноклональних антитіл могло б дозволити це обмеження, виявилося важким одержати великі кількості людських антитіл проти людини за допомогою загальноприйнятої технології гібридом. Таким чином, в даній галузі застосували рекомбінантну технологію для конструювання «гуманізованих» антитіл, які зберігають високу афінність зв'язування моноклональних антитіл тваринного походження, таких як мишачі, але мають знижену імуногенність у людини. Зокрема, запропоновані химерні антитіла, в яких варіабельну область (V) антитіл, що не належать до людини, з'єднували з константною (С) областю антитіл людини. Способи одержання таких химерних імуноглобулінів детально описані в патенті США 5770198. У інших спробах знизити імуногенність мишачих антитіл, на антитіла людини переносили тільки область, яка визначає комплементарність (CDR), тобто області гіперваріабельності в Vобластях, а не повний V-домен. Такі гуманізовані антитіла відомі як CDR-прищеплені антитіла. Конструювання CDR-прищеплених антитіл, які розпізнають більш складні антигени, дало в результаті антитіла, що мають активність зв'язування значно більш низьку, ніж у нативних негуманізованих антитіл. У багатьох випадках показано, що єдиного введення CDR, які не належать до людини, в кістяк людських антитіл недостатньо для збереження повної активності зв'язування. Незважаючи на те, що для ідентифікації ключових амі 5 нокислот, які розглядаються в конструюванні гуманізованих антитіл, потрібна ускладнена комп'ютерна модель мишачих антитіл, що представляють інтерес, і для такого конструювання запропоновані загальні теоретичні принципи, у всіх випадках спосіб необхідно адаптувати і оптимізувати для конкретних антитіл, що не належать до людини, які представляють інтерес. Отже, зберігається потреба в (моноклональних) антитілах, які оптимально інгібують зв'язування PLGF людини зі своїм рецептором. Більше того, такі антитіла також повинні бути неімуногенними в тому значенні, що вони не можуть викликати НАМА (або мають невелику схильність до цього). Суть винаходу Даний винахід належить до нових моноклональних антитіл і їх похідних, націлених на PLGF і здатних інгібувати зв'язування PLGF зі своїм рецептором. Дані ліганди є першими, для яких показали інгібування PLGF людини при патологічному стані in vivo. Більш конкретно, антитіла і їх похідні згідно з даним винаходом здатні зменшувати розмір пухлини і васкуляризацію тканини пухлини людини in vivo. Антитіла за даним винаходом надають альтернативу антиангіогенним способам лікування, націленим на використовуваний в цей час VEGF, з тією важливою перевагою, що побічні ефекти, які викликаються інгібуванням фізіологічного ангіогенезу, пов'язані з даними способами лікування, значно знижені. Даний винахід належить до антигензв'язувальних молекул, зокрема моноклональних антитіл, їх фрагментів або похідних, включаючи гуманізовані антитіла і фрагменти антитіл, які зв'язуються з тим же епітопом PLGF, що і антитіла, позначені тут як 16D3. Першою метою даного винаходу є надання нових моноклональних антитіл, які здатні зв'язуватися з PLGF і мають здатність інгібувати функціонування PLGF, більш конкретно, антитіл, відмінних тим, що їх варіабельна область важкого ланцюга містить послідовність SEQ ID NO:2 або послідовність, яка має щонайменше 80%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно 95% ідентичність послідовності з нею в межах областей CDR, і/або тим, що їх варіабельна область легкого ланцюга містить послідовність SEQ ID NO:4 або послідовність, яка має щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з нею в межах областей CDR, як, наприклад, антитіло 16D3 або його похідні. Додатково або альтернативно, в іншому варіанті здійснення, антигензв'язувальні молекули за даним винаходом мають ідентичність послідовності у варіабельних областях важкого і/або легкого ланцюгів за межами областей CDR, які щонайменше на 70%, зокрема щонайменше на 80%, більш конкретно щонайменше на 90%, найбільш конкретно щонайменше на 95% ідентичні послідовностям SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:4, відповідно. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу, антитіло є гуманізованим антитілом, більш конкретно гібридним антитілом, найбільш конкретно мишачим/людським гібридним антитілом, більш 94707 6 конкретно гібридним мишачим 16D3/людським IgG1k або IgG4k. Альтернативно, гуманізоване антитіло є тим, яке містить області CDR мишачого антитіла 16D3 за даним винаходом, здатні зв'язуватися з PLGF, вбудовані в кістяк людських антитіл. Інший варіант здійснення даного винаходу належить до антигензв'язувальних фрагментів мишачого антитіла 16D3 або його похідних, таких як його гуманізоване антитіло, такі як, як необмежувальні приклади, Fab, Fab' або F(ab')2, сполучення щонайменше двох областей (CDR), що визначають комплементарність, розчинна або заякорена в мембрані одноланцюгова варіабельна область або одиночний варіабельний домен. Конкретні варіанти здійснення таких антигензв'язувальних фрагментів включають фрагменти, які містять щонайменше дві CDR 16D3 або їх похідні, або, більш конкретно щонайменше дві CDR, вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY), SEQ ID NO:18 (IYPGSGNT), SEQ ID NO:19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NO:20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO:21 (WAS) і SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT), або які містять щонайменше дві послідовності, які мають щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з ними. Конкретний варіант здійснення винаходу належить до надання одноланцюгових варіабельних фрагментів (scFv) мишачого антитіла 16D3 і гуманізованих scFv, які здатні інгібувати активність PLGF. Найбільш конкретно, даний винахід належить до scFv, що містять амінокислотну послідовність SEQ ID NO:24 або SEQ ID NO:26, або послідовність, яка має щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з нею в межах CDR, здатних зв'язуватися з PLGF. Ще однією метою даного винаходу є надання ліній клітин, які продукують моноклональні антитіла за даним винаходом, більш конкретно, лінії клітин 16D3, яка продукує антитіло 16D3, а також інших ліній клітин, які здатні продукувати антигензв'язувальні молекули, що походять з 16D3 або його фрагментів, наприклад, внаслідок рекомбінантної технології. Ще однією метою даного винаходу є надання фармацевтичної композиції для профілактики або лікування (небажаного) ангіогенезу при патологічних станах або порушеннях у ссавців, або для профілактики або лікування резорбції кістки, яка містить антитіло проти PLGF, яке є 16D3 або фрагментом або похідним, більш конкретно, гуманізованою версією 16D3 або його антигензв'язувальним фрагментом в суміші з фармацевтично прийнятним носієм. Конкретний варіант здійснення винаходу є фармацевтичною композицією, яка містить антигензв'язувальний фрагмент 16D3 або його похідне, яке вибране з групи, що складається з Fab, Fab' або F(ab')2, розчинної або заякореної в мембрані одноланцюгової варіабельної частини або одиночного варіабельного домену. Найбільш конкретні варіанти здійснення даного винаходу належать до фармацевтичних композицій, що міс 7 тять антигензв'язувальний фрагмент, який містить щонайменше дві CDR, вибрані з групи, яка складається з SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY), SEQ ID NO:18 (IYPGSGNT), SEQ ID NO: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NO:20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO:21 (WAS) і SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT), або щонайменше дві CDR, які мають щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з двома різними послідовностями, вибраними з групи, яка складається з SEQ ID NO:17-22. Конкретний варіант здійснення цих композицій належить до фармацевтичних композицій, що містять scFv антитіла 16D3 за винаходом, більш конкретно, що містять scFV, який містить щонайменше дві CDR, вибрані з групи, яка складається з SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY), SEQ ID NO:18 (IYPGSGNT), SEQ ID NO:19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NO:20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO:21 (WAS) і SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT), або щонайменше дві послідовності, які мають щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з двома різними послідовностями, вибраними з групи, яка складається з SEQ ID NO:17-22, як, наприклад, scFv, що містить SEQ ID NO:24. Найбільш конкретно, фармацевтична композиція містить гуманізований scFv 16D3, такий як, як необмежувальні приклади, гуманізований scFv, що містить SEQ ID NO:26 або послідовність, яка має щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з нею в межах CDR, здатної зв'язуватися з PLGF. У ще одному конкретному варіанті здійснення фармацевтичної композиції згідно з винаходом, терапевтично ефективна кількість іншого антиангіогенного засобу включена на доповнення до антигензв'язувальної молекули, здатної зв'язуватися з PLGF за винаходом. Найбільш конкретно, в зв'язку з цим передбачені антиангіогенні засоби, такі як інгібітори VEGF і bFGF, найбільш конкретно, антиVEGF антитіла. Іншою метою даного винаходу є надання нуклеотидних послідовностей, що кодують антигензв'язувальні фрагменти антитіл, які зв'язуються з описаним тут PLGF, більш конкретно, нуклеотидні послідовності, що кодують варіабельні області важкого і легкого ланцюгів 16D3, що продукується лінією клітин 16D3. Найбільш конкретно, передбачена нуклеотидна послідовність, що кодує варіабельні області SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:4. Крім того, полінуклеотидні послідовності, що кодують антигензв'язувальні фрагменти, які містять щонайменше дві CDR 16D3, більш конкретно, полінуклеотиди, що кодують щонайменше дві CDR, вибрані з групи, яка складається з SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY), SEQ ID NO:18 (IYPGSGNT), SEQ ID NO:19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NO:20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO:21 (WAS) і SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT), або кодуючі послідовності, що містять щонайменше дві CDR, які мають щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно 94707 8 щонайменше 95% ідентичність послідовності з SEQ ID NO:17-22. Конкретні варіанти здійснення нуклеотидних послідовностей за даним винаходом надані в SEQ ID NO:1, 3, 5 і 6. Інші конкретні варіанти здійснення включають нуклеотидні послідовності, що кодують scFv 16D3 і його гуманізовані версії, найбільш конкретно, послідовність SEQ ID NO:23 і SEQ ID NO:25, і послідовності, які мають щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з ними, найбільш конкретно, в межах областей, що кодують області CDR scFv. Однак, потрібно мати на увазі, що існує множина нуклеотидних послідовностей, які попадають в об'єм даного винаходу в результаті виродженості генетичного коду. Іншою метою даного винаходу є надання способу лікування і/або профілактики небажаного (або патологічного) ангіогенезу при патологічному стані у ссавця, де спосіб включає введення ссавцеві, потребуючому такого лікування або профілактики, терапевтично ефективної кількості активного інгредієнта, який є антитілом 16D3 за даним винаходом або його антигензв'язувальним фрагментом або похідним, найбільш конкретно, scFv, як тут описано. Зокрема, придатними для способів за даним винаходом є гуманізовані антитіла і фрагменти антитіл, такі як scFv 16D3 або їх похідні. Конкретний варіант здійснення способу за винаходом належить до лікування і/або профілактики патологічних станів, таких як, як необмежувальні приклади, рак, запалення, захворювання ока, легенева гіпертензія і судинна кровотеча. Конкретною метою даного винаходу є надання ефективного і безпечного лікування (тобто без побічних ефектів) патологічного ангіогенезу, більш конкретно, при рості пухлини, запаленні, захворюваннях ока або судинній кровотечі у ссавців, більш конкретно у людини. Найбільш конкретно, спосіб за даним винаходом придатний для лікування і/або профілактики солідних пухлин, більш конкретно для лікування і/або профілактики раку товстої кишки, раку молочної залози, раку підшлункової залози і меланом. Інші застосування антитіл і антигензв'язувальних фрагментів за даним винаходом належать до імунологічного детектування PLGF в зразках з людини як мічених направляючих груп в способах діагностики і для скринінгу сполук з додатковим ефектом інгібування PLGF при лікуванні раку. Даний винахід заснований на несподіваному відкритті нових лігандів, а саме, нових мишачих і гуманізованих моноклональних антитіл і їх фрагментів, похідних і гомологів, які дуже ефективно інгібують PLGF. Найбільш конкретно, даний винахід належить до лігандів, здатних зменшувати ріст пухлини, найбільш конкретно, здатних зменшувати розмір пухлини на 20%-50%. Короткий опис креслень Наступний опис, що не передбачає обмеження винаходу описаними тут конкретними варіантами здійснення, можна зрозуміти в зв'язку з супровідними фігурами, наведеними тут як посилання, на яких: 9 Фіг. 1: Зв'язування антитіла 16D3 (А) або гуманізованого антитіла 16D3 (hu16D3) (В) з PLGF-2 людини (одержаного в Pichia) в аналізі ELISA відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. Фіг. 2: Інгібування зв'язування PLGF-2 з рецептором Flt-1 людини за допомогою антитіла 16D3 (квадрати) або гуманізованого антитіла 16D3 (трикутники) в аналізі ELISA відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. Фіг. 3: Результати експериментів на Віасоrе, де rhuPLGF-2 іммобілізований на чипі СМ5 для вивчення інгібуючої здатності антитіла 16D3 і його Fab-фрагмента, які тестуються відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. Фіг. 4: Моноклональне антитіло 16D3 інгібує ріст пухлини на моделі підшкірного трансплантата пухлини підшлункової залози DanG людини. Ліку3 вання мишей nu/nu з пухлинами приблизно 60 мм за допомогою анти-tPA («контрольний IgG») (1С8; 50 мг/кг маси тіла; n=10), анти-hPLGF 16D3 («антиhPLGF») (50 мг/кг маси тіла; n=10), анти-mPLGF (PL5D11D4) (одержаних, як описано в WO 01/85796; 50 мг/кг маси тіла; n=10), сполучення анти-hPLGF 16D3 і анти-mPLGF PL5D11D4 («антиhPLGF/анти-mPLGF») (кожне 25 мг/кг маси тіла; n=10) і «носія» (n=10) відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. (А) Розмір пухлини; (В) маса пухлини на 18 добу після інокуляції пухлини. Фіг. 5: Моноклональне антитіло 16D3 інгібує ріст пухлини на моделі підшкірного трансплантата пухлини підшлункової залози DanG людини дозозалежним чином. Лікування мишей nu/nu з пухлинами приблизно 60 мм за допомогою анти-hPLGF 16D3 (50 мг/кг = «1000 мкг»/«С», 37,5 мг/кг = «750 мкг»/«D», 25 мг/кг = «500 мкг»/«Е», 12,5 мг/кг = «250 мкг»/«F»; n=10 для кожної концентрації), контрольного IgG («1C8»/«B»; 50 мг/кг) і «носія»/«А» (n=10) відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. А: Зміна середнього розміру пухлини після інокуляції пухлинних клітин; В: середній розмір пухлини на 20 добу. Фіг. 6: Моноклональне антитіло 16D3 інгібує ріст пухлини на моделі підшкірного трансплантата пухлини молочної залози MDA-MB людини. Ліку3 вання мишей nu/nu з пухлинами приблизно 60 мм за допомогою анти-hPLGF 16D3 (50 мг/кг маси тіла; n=10) або носія три рази на тиждень відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. А: маса пухлини і В: об'єм пухлини, як визначали на 32 добу після інокуляції. Фіг. 7: Моноклональне антитіло 16D3 інгібує ріст пухлини на моделі підшкірного трансплантата пухлини товстої кишки LOVO людини. Лікування 3 мишей nu/nu з пухлинами приблизно 60 мм за допомогою анти-hPLGF 16D3 (50 мг/кг маси тіла; n=10) або носія три рази на тиждень відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. А: маса пухлини і В: об'єм пухлини, як визначали на 30 добу після інокуляції. Фіг. 8: Моноклональне антитіло 16D3 інгібує ріст пухлини на моделі підшкірного трансплантата пухлини меланоми Ме12а людини. Лікування ми3 шей nu/nu з пухлинами приблизно 60 мм за допомогою анти-hPLGF 16D3 (50 мг/кг маси тіла; n=10) або носія три рази на тиждень відповідно до варі 94707 10 анта здійснення даного винаходу. Маса пухлини, як визначали на 53 добу після інокуляції. Фіг. 9: Моноклональне антитіло 16D3 запобігає зниженню маси тіла на моделі підшкірного трансплантата пухлини підшлункової залози DanG людини. Лікування мишей nu/nu з пухлинами приблизно 3 60 мм за допомогою анти-hPLGF 16D3 (50 мг/кг маси тіла; n=10), контрольного IgG, сполучення анти-hPLGF і анти-mPLGF (кожне 25 мг/кг маси тіла; n=10) і носія (n=10) відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. Масу пухлини віднімали від маси тіла перед обчисленням процентної частки зниження маси тіла. Світлі стовпчики: маса тіла на першу добу лікування; темні стовпчики: маса тіла на останню добу лікування. Фіг. 10: Моноклональне антитіло 16D3 і авастин мають додатковий ефект на інгібування росту пухлини на підшкірній пухлині підшлункової залози DanG людини. Лікування мишей nu/nu з пухлинами 3 приблизно 60 мм за допомогою анти-hPLGF 16D3 (37,5 мг/кг, 25 мг/кг, 12,5 мг/кг маси тіла; n=10 для кожної концентрації), контрольним IgG (1C8; 50 мг/кг), авастином (15 мг/кг і 5 мг/кг маси тіла, внутрішньочеревинно два рази на тиждень, n=10 для кожної) і сполученням анти-hPLGF (12,5 мг/кг маси тіла) і авастину (5 мг/кг маси тіла; n=10) відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. Мишей умертвляли після 20 діб інокуляції пухлини, і визначали об'єм пухлини. Фіг. 11: Нуклеотидні і амінокислотні послідовності варіабельних частин мишачого антитіла 16D3 відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. А. Нуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну частину важкого ланцюга; В. Нуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну частину легкого ланцюга; С. Амінокислотна послідовність варіабельної частини важкого ланцюга; D. Амінокислотна послідовність варіабельної частини легкого ланцюга. Підкреслені нуклеотиди або амінокислоти, які можна модифікувати для цілей гуманізації згідно з одним з варіантів здійснення винаходу. Фіг. 12: Нуклеотидні і амінокислотні послідовності гуманізованих варіабельних частин 16D3 відповідно до варіанта здійснення даного винаходу. А. Нуклеотидна послідовність, що кодує гуманізовану варіабельну частину важкого ланцюга; В. Нуклеотидна послідовність, що кодує гуманізовану варіабельну частину легкого ланцюга; С Амінокислотна послідовність гуманізованої варіабельної частини важкого ланцюга; D. Амінокислотна послідовність гуманізованої варіабельної частини легкого ланцюга. Підкреслені нуклеотиди або амінокислоти, модифіковані для цілей гуманізації. Фіг. 13: Зображення вектора для експресії гуманізованих 16D3 scFv в клітинах 293. Фіг. 14: А: Зв'язування scFv16D3 і гуманізованих scFv16D3 з PLGF; В: Інгібування зв'язування huPLGF-2 зі своїм рецептором huFlt-1 за допомогою scFv16D3 і гуманізованих scFv16D3 (В). Фіг. 15: А: Амінокислотна послідовність scFv мишачого антитіла 16D3; В: Амінокислотна послідовність гуманізованого scFv антитіла 16D3. Підкреслені області за межами варіабельної області важкого і легкого ланцюгів. 11 Фіг. 16: Зображення вектора для експресії гуманізованого 16D3 Fab в клітинах 293 відповідно до варіанта здійснення винаходу. Фіг. 17: А: Зв'язування гуманізованого Fab 16D3 з huPLGF в аналізі ELISA відповідно до варіанта здійснення даного винаходу; В: Інгібування зв'язування huPLGF-2 зі своїм рецептором huFlt-1 за допомогою гуманізованого Fab16D3. Визначення Термін «16D3», як застосовують тут, належить до моноклонального антитіла проти PLGF, яке продукує лінією клітин, депонованих в BCCM/LMBP під номером LMBP 6399CB. Термін «фрагмент антитіла» належить до компонента частини молекули антитіла, який один або в сполученні з іншими фрагментами здатний зв'язуватися з антигеном, проти якого одержане відповідне антитіло. Типовими фрагментами антитіла є Fab, Fab', F(ab')2, Fv або scFv, які часто зберігають афінність до антигену, яка порівнянна з повним антитілом. Фрагменти меншого розміру містять області, що визначають комплементарність, або CDR, такі як CDR1, CDR2 і CDR3 важкого або легкого ланцюга і/або двох або більше їх сполучень. Термін «похідне» застосовують тут для позначення антигензв'язувальної молекули, яка відповідає модифікації вихідного антитіла (наприклад того, яке продукується гібридомною лінією клітин) або його фрагмента, без значного порушення зв'язування з антигеном. Типові модифікації включають модифікації амінокислотної послідовності вихідного антитіла або модифікації функціональних груп, присутніх в амінокислотній послідовності, наприклад, в контексті гуманізації, для зв'язування антитіла або його фрагмента з іншими молекулами, такими як мітки або буси, або для модифікації глікозилування. Таким чином, похідні включають в себе, як необмежувальні приклади, гуманізовані антитіла, гібридні антитіла, антитіла або інші антигензв'язувальні молекули, які одержані за допомогою пересадки або введення однієї або декількох варіабельних областей і/або CDR вихідного антитіла на кістяк іншого антитіла або фрагмента з того ж або іншого виду. Похідні антитіла містять альтернативні структури однієї або декількох CDR антитіла, що дає антигензв'язувальну молекулу, таку як синтетичний поліпептид. «Гуманізоване антитіло або фрагмент антитіла», як застосовують тут, належить до молекули антитіла або його фрагмента, в яких, в порівнянні з вихідним антитілом, амінокислоти заміщені для того, щоб мати більшу схожість з антитілом людини. Більшість цих заміщень будуть знаходитися в кістяку антитіла або фрагмента антитіла, тобто в областях, які не зв'язуються з антигеном. Однак передбачено, що в межах CDR, також можна замістити амінокислоти, які не приймають або, швидше усього, не беруть участь в зв'язуванні з антигеном. «Реконструйоване» антитіло або фрагмент антитіла або «гібридне антитіло», як застосовують тут, належить до антитіла, яке містить частини щонайменше двох різних антитіл, які можуть, не обов'язково, походити з того ж або з різних видів. 94707 12 Як правило, гібридне антитіло людини може являти собою людську константну область одного антитіла, зв'язану з гуманізованою варіабельною областю іншого антитіла (які направлені проти цікавлячого антигену), або кістяк людського антитіла з одного антитіла, в якому амінокислотні послідовності в антигензв'язувальних областях заміщені послідовностями іншого антитіла, наприклад, антитіла, що не належить до людини, направленого проти цікавлячого антигену людини. Більш конкретно, антигензв'язувальні області одного (що звичайно не належать до людини) антитіла, які мають афінність до цікавлячого антигену, такі як одна або декілька CDR або їх варіабельні області або частини, вводять в кістяк іншого (звичайно людського) антитіла (наприклад, CDRприщеплених антитіл). Термін «гомологія» або «гомологічний», як застосовують тут з посиланням на дві або більше антигензв'язувальних молекул за даним винаходом, належить до здатності антигензв'язувальних молекул зв'язуватися з одним і тим же антигеном, більш конкретно, з одним і тим же епітопом. Здатність двох антигензв'язувальних молекул зв'язуватися з одним і тим же епітопом можна оцінити визначенням того, чи можуть антигензв'язувальні молекули конкурувати одна з одною за зв'язування з одним і тим же антигеном, наприклад, в конкурентнозв'язувальному аналізі. Зв'язування з антигеном гомологічних антигензв'язувальних молекул повинно здійснюватися зі схожою специфічністю. «Ідентичність послідовності» двох послідовностей, як застосовують тут, належить до кількості положень з ідентичними нуклеотидами або амінокислотами, діленій на кількість нуклеотидів або амінокислот в більш коротких послідовностях при вирівнюванні двох послідовностей. Переважно, вказана ідентичність послідовностей вище, ніж 70%-80%, переважно 81-85%, більш переважно 86-90%, особливо переважно 91-95%, найбільш переважно 96-100%, більш конкретно є 100%. Внаслідок, як правило, обмеженого внеску кістяка варіабельних областей в зв'язування з антигеном, ідентичність послідовності частіше за все визначають тут відносно послідовності у областях, що визначають комплементарність, або CDR, тобто відносно кодуючих нуклеотидних послідовностей і амінокислотних послідовностей, які утворюють CDR. Таким чином, коли послідовність, як визначають, має, наприклад, 80% ідентичність послідовності протягом специфічної послідовності «в межах CDR», це призначене для визначення ідентичності послідовностей між двома послідовностями тільки відносно послідовностей, що утворюють CDR. Термін «PLGF» застосовують тут для позначення плацентарного фактора росту. PLGF, як виявили, в основному існує у вигляді двох сплайсованих варіантів або ізоформ, PLGF-1 з 149 амінокислот і PLGF-2 з 170 амінокислот, який містить вставку з 21 амінокислоти в С-кінцевій області, але також виявлені інші ізоформи. Термін «інгібіторний» при посиланні на антитіло до PLGF або його фрагмент або похідне застосовують, щоб указати, що антитіло, фрагмент або 13 похідне здатні інгібувати зв'язування PLGF зі своїм рецептором Flt-1. Докладний опис Даний винахід буде описаний з посиланням на визначені варіанти здійснення і на визначені фігури, але даний винахід цим не обмежений, а обмежений тільки формулою винаходу. Даний винахід належить до антигензв'язувальних молекул, зокрема моноклональних антитіл, їх фрагментів або похідних, які зв'язуються з тим же епітопом PLGF, що і антитіло, позначене тут як антитіло 16D3. «Антитіло 16D3», продуковане лінією клітин LMBP 6399CB, виробляється проти PLGF людського походження і зв'язує PLGF людини (обидві ізоформи PLGF-1 і PLGF-2). Антитіло 16D3 інгібує зв'язування PLGF людини зі своїм рецептором Flt-1, інгібуючи активність PLGF. Саме антитіло 16D3 і його фрагменти або похідні, а також нуклеотидні послідовності, що кодують антитіло, фрагменти або похідні, можна, таким чином, застосовувати для інгібування PLGF як в терапевтичному контексті, так і на моделі у тварин для цілей тестування або скринінгу. Альтернативно, антитіло можна застосовувати для детектування і/або визначення кількості PLGF або in vivo, ex vivo, або in vitro. Таким чином, даний винахід належить до різних застосувань антигензв'язувальних молекул за винаходом і нуклеотидних послідовностей, що їх кодують. Винахід, далі, належить до способів одержання антигензв'язувальних молекул за винаходом і до ліній клітин, здатних продукувати ці антигензв'язувальні молекули. Перший аспект даного винаходу належить до ліній клітин, які продукують антигензв'язувальні молекули за винаходом, більш конкретно, ліній клітин, які продукують моноклональні антитіла, здатні зв'язуватися з тим же антигеном, що і 16D3 або їх фрагменти або похідні. Конкретний варіант здійснення цього аспекту винаходу являє собою гібридомну лінію клітин, також позначувану як «лінія клітин 16D3», яка продукує моноклональне антитіло 16D3 і яка депонована в BCCM/LMBP (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Plasmid Collection Laboratorium voor Moleculaire Biologie, University of Ghent K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, BE by Thromb-X th on March 29 , 2005) під інвентарним номером LMBP 6399CB. Даний винахід далі належить до ліній клітин, які продукують моноклональні антитіла, що походять з моноклонального антитіла 16D3. Такі лінії клітин можна одержати модифікацією послідовності, що кодує моноклональне антитіло 16D3, найбільш конкретно, кодуючої послідовності, що кодує незв'язуючі антиген області 16D3. Тут описані способи для визначення природи модифікацій, які потрібно одержати, і приклади придатних модифікацій. Другий аспект винаходу належить до антигензв'язувальних молекул, здатних зв'язуватися з тим же антигеном, що і антитіло 16D3. Більш конкретно, винахід належить до антитіла, позначеного 16D3, яке продукується лінією клітин 16D3, описаною вище, і їх гомологів, фрагментів і похідних, здатних до зв'язування з PLGF і інгібування активності PLGF. 94707 14 Таким чином, конкретний варіант здійснення даного винаходу належить до антитіла проти PLGF людини, моноклонального антитіла 16D3, як ті, які продукує лінія клітин LMBP 6399CB, і фрагментів цього антитіла. Моноклональне антитіло 16D3 характеризується амінокислотною послідовністю варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів, як описано в SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:4, відповідно. Згідно з конкретним варіантом здійснення, даний винахід належить до фрагментів, більш конкретно антигензв'язувальних фрагментів антитіла 16D3. Такі фрагменти включають в себе, як необмежувальні приклади, Fab, Fab', F(ab')2, CDR, пептиди з послідовністю частини антитіла або його CDR, одиночні варіабельні домени і їх сполучання. Фрагменти Fab, Fab' і F(ab')2 можна одержати протеолітичним розщепленням моноклональних антитіл з використанням способів, добре відомих в даній галузі, таких як описані в Stanworth et al., Handbook of Experimental Immunology (1978), vol. 1 chapter 8 (Blackwell Scientific Publications). Такі фрагменти, які зберігають здатність зв'язуватися з антигеном, втратили ряд властивостей батьківських антитіл, таких як активація комплементу або здатність зв'язуватися з рецепторами Fc-гамма. Більш конкретно, даний винахід належить до фрагментів, що містять варіабельні області важких і легких ланцюгів 16D3, відповідних SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:4, відповідно. Інший конкретний варіант здійснення винаходу належить до фрагментів, що містять області (CDR) 16D3, які визначають комплементарність, і їх похідні. Два частіше за все використовувані способи ідентифікації CDR являють собою IMGT і KАВАТ, і фрагменти, що містять більше однієї CDR будь-якого типу з 16D3, передбачені в контексті винаходу, а також похідних 16D3, що містять ці фрагменти або CDR. Згідно з ідентифікацією CDR за допомогою IMGT, області CDR всередині варіабельних областей 16D3 відповідають SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY), SEQ ID NO:18 (IYPGSGNT), SEQ ID NO: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NO:20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO:21 (WAS) і SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT). Таким чином, даний винахід належить до фрагментів антитіла 16D3, що містять одну або декілька CDR 16D3, як представлено на SEQ ID NO:17- SEQ ID NO:22. Інший конкретний варіант здійснення винаходу належить до фрагментів 16D3, які є розчинними або заякореними в мембрані одноланцюговими варіабельними частинами 16D3. Одноланцюговий варіабельний фрагмент (scFv) є генетично сконструйованим фрагментом антитіла, який звичайно складається з варіабельного важкого ланцюга (VH) і легкого ланцюга (VL) імуноглобуліну, або його частин, сполучених разом гнучким пептидним лінкером. Не обов'язково, scFv містять області CDR антитіла, що представляє інтерес і каркасні області іншого антитіла. Амінокислотна послідовність областей каркаса scFv і/або CDR, не обов'язково, гуманізована для зниження антигенності для застосування як лікарського засобу у людей. Винахід належить до scFv 16D3 і його гуманізованої версії, що містить SEQ ID NO:24 і SEQ ID NO:26, відповідно. Способи одержання одноланцюгових 15 варіабельних частин антитіл відомі фахівцеві і описані тут в прикладі 6. Наприклад, спосіб може включати ампліфікацію послідовностей ДНК варіабельних частин важких і легких ланцюгів людини в окремих реакціях і клонування з подальшою вставкою лінкерної послідовності з п'ятнадцяти амінокислот, наприклад, (Gly4 Ser)3, між VH і VL за допомогою двостадійної полімеразної ланцюгової реакції (PCR) (див., наприклад, Dieffenbach and Dveksler, "PCR Primer, a laboratory manual" (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, USA). Одержаний фрагмент можна потім вставити у придатний вектор для експресії одноланцюгового варіабельного фрагмента у вигляді розчинного або експонованого на фазі поліпептиду. Цього можна досягнути способами, добре відомими фахівцям в даній галузі, такими, як описано в Gilliland et al., Tissue Antigens (1996) 47:1-20. Даний винахід також належить до фрагментів 16D3, які є антигензв'язувальними пептидами, характерними для гіперваріабельних областей антитіла 16D3 або їх сполучань. Такі пептиди можна одержати синтезом з використанням прикладного синтезатора біосистем, наприклад, синтезатора поліпептидів, такого як модель 9050, доступна від Milligen (USA), або модель схожого рівня техніки. Інший варіант здійснення винаходу належить до похідних антитіла 16D3 або їх фрагментів. Більш конкретно, винахід належить до антитіл, що містять варіабельну область важкого ланцюга і/або варіабельну область легкого ланцюга, як показано на SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:4, відповідно, але константні області яких відрізняються від константних областей 16D3. Додатково або альтернативно, похідні антитіла 16D3 за даним винаходом містять щонайменше дві CDR 16D3, як представлено на SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY), SEQ ID NO:18 (IYPGSGNT), SEQ ID NO:19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NO:20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO:21 (WAS) і SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT), в той час як каркасні області між CDR і/або константні області відрізняються. Згідно з одним з варіантів здійснення винаходу похідні антитіла 16D3 або їх фрагменти надані такими, що мають щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з варіабельною областю важкого і легкого ланцюга 16D3, представленою на SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:4, відповідно. Найбільш конкретно, даний винахід належить до похідних антитіла 16D3 або його фрагментів, що містять варіабельну область важкого ланцюга і/або область легкого ланцюга, яка має щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності до SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:4, відповідно, в межах області CDR. Ідентичність послідовності всередині каркасних областей може складати, без обмеження, менше 80%. Також передбачені похідні, що містять щонайменше дві CDR, які мають щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайме 94707 16 нше 95% ідентичність послідовності з послідовностями SEQ ID NO:17-22, відповідно. Згідно з іншим варіантом здійснення винахід належить до похідного scFv 16D3, що містить послідовність, яка має щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з SEQ ID NO:24, і послідовність, яка має щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з SEQ ID NO:26, найбільш конкретно всередині області CDR. Згідно з іншим варіантом здійснення винахід належить до похідних 16D3 або їх фрагментів, які є гуманізованими. Такі гуманізовані похідні 16D3 є гомологами в тому, що вони зберігають афінність зв'язування з PLGF. Згідно з конкретним варіантом здійснення гуманізовані похідні 16D3 також зберігають здатність інгібувати активність PLGF. Гуманізації антитіл, що не належать до людини, досягають заміною однієї або декількох амінокислот в кістяку антитіла, тобто тих амінокислот, які не залучені до зв'язування антитіла з антигеном, щоб мати більшу схожість з кістяком антитіла людини. Передбачені різні типи або рівні гуманізації. Конкретні варіанти здійснення винаходу належать до антитіл або фрагментів, в яких цілі області, більш конкретно константна(і) область(і) антитіла, що не належить до людини, або фрагмента замінена(і) константною(ими) областю(ями) антитіла людини для того, щоб одержати химерні (наприклад, людські/мишачі) антитіла або фрагменти. Інші конкретні варіанти здійснення є антитілами, в яких антигензв'язувальні амінокислоти (наприклад, дві або більше CDR) антитіла проти PLGF, що не належить до людини, введені в кістяк антитіла людини (наприклад, CDR-прищеплені антитіла). Способи сполучання області, що визначає комплементарність зв'язування («CDR»), з моноклонального антитіла, що не належить до людини, з каркасними областями людини, зокрема константною Собластю гена людини, відомі фахівцеві, як, наприклад, описані Jones et al. в Nature (1986) 321:522 або Riechmann в Nature (1988) 332:323. Альтернативно, також передбачена заміна більш обмеженої кількості амінокислот анти-PlGF антитіл, що не належать до людини, за винаходом. Конкретні варіанти здійснення винаходу належать до антитіл, які містять гуманізовані варіабельні області важкого і/або легкого ланцюга фіг. 9, або їх частин, і антитіл, які містять щонайменше дві, більш конкретно три-п'ять, найбільш конкретно всі шість CDR SEQ ID NO:17- SEQ ID NO:22. Інші варіанти здійснення винаходу належать до гуманізованих антитіл, що містять варіабельні області важкого і/або легкого ланцюга, які мають щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з SEQ ID NO:6 і SEQ ID NO:8, відповідно. Альтернативно, даний винахід належить до гуманізованих антитіл, які містять щонайменше дві, більш конкретно трип'ять, найбільш конкретно шість CDR, що мають щонайменше 80%, зокрема щонайменше 85%, 17 більш конкретно щонайменше 90%, найбільш конкретно щонайменше 95% ідентичність послідовності з SEQ ID NO:17-22, відповідно. Даний винахід, таким чином, належить до гуманізованих і/або химерних або гібридних антитіл, одержаних з мишачого антитіла 16D3. У конкретному варіанті здійснення конкретні амінокислоти мишачого антитіла 16D3 змінені мутацією для видалення імуногенних амінокислот. Таким чином, в конкретному варіанті здійснення даний винахід належить до антигензв'язувальних молекул, що містять амінокислотну послідовність варіабельної частини важкого ланцюга згідно з SEQ ID NO:2, де змінені одна або декілька з наступних амінокислот: 12V, Р9А, К40А і/або T111L. Додатково або альтернативно, гуманізовані антитіла, одержані з антитіла 16D3, є антигензв'язувальними молекулами, що містять амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга згідно з SEQ ID NO:4, де змінені одна або декілька з наступних амінокислот: S5T, S9D, A15L, K18R, R22N і/або L89V. Таким чином, згідно з конкретним варіантом здійснення, винахід належить до антигензв'язувальних молекул, що містять як амінокислотну послідовність варіабельної частини важкого ланцюга згідно з SEQ ID NO:2, де змінені одна або декілька з наступних амінокислот: 12V, Р9А, K40А і/або T111L, так і амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга SEQ ID NO:4, де змінені одна або декілька з наступних амінокислот: S5T, S9D, A15L, K18R, R22N і/або L89V. У іншому варіанті здійснення антитіло є додатково гуманізованим в тому, що (гуманізовані) варіабельні легкий і/або важкий ланцюги мишачого антитіла 16D3 вбудовані в каркас імуноглобуліну людини або сполучені з константною областю антитіла людини, більш конкретно з константною областю IgG людини. Зокрема, придатними в зв'язку з цим IgG є Igg1k (IgG1-каппа), які здатні активувати природні кілерні клітини в організмі. В конкретному варіанті здійснення даний винахід, таким чином, належить до гібридних Hu16D3 – IgG1k. Альтернативний варіант здійснення даного винаходу є гібридними Hu16D3 - гібридними IgG4k. IgGантитіла людини (і, таким чином, також гібридні антитіла, одержані з використанням кістяка і/або константних областей IgG людини) мають збільшений час напівжиття, таким чином, забезпечуючи дуже стабільні рівні в плазмі і даючи можливість суттєво зменшити частоту введення. Далі, застосування гуманізованих антитіл або похідних несе мінімальний ризик викликання імунних відповідей. Інші варіанти здійснення даного винаходу належать до антигензв'язувальних молекул, які гомологічні антитілу 16D3, або їх фрагментів, тобто антигензв'язувальних молекул, які зв'язуються з тим же епітопом, що і антитіло 16D3. У одному з варіантів здійснення гомологічні антигензв'язувальні молекули одержують спеціально імунізацією тварин, більш конкретно миші, наприклад, ін'єкцією PLGF мишам і потім злиттям лімфоцитів селезінки з лінією клітин мієломи миші, з подальшою ідентифікацією культур клітин, продукуючих антиPLGF антитіла (наприклад, скринінгом на зв'язування з PLGF), і їх клонуванням. Необов'язково, 94707 18 подальшу селекцію антитіл здійснюють на основі реактивності відносно епітопу для 16D3, або конкуренції з антитілом 16D3 або його фрагментом. Ще один аспект винаходу, таким чином, належить до способів одержання антигензв'язувальних молекул за даним винаходом. Ці способи включають в себе, як необмежувальні приклади, способи гуманізації антитіла 16D3, як представлено тут в розділі прикладів. Ще один аспект даного винаходу належить до надання нуклеотидних послідовностей, що кодують антигензв'язувальні молекули за даним винаходом, найбільш конкретно, їх антигензв'язувальні області. Конкретні варіанти здійснення винаходу належать до нуклеотидних послідовностей, що кодують варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, SEQ, що визначаються ID NO:2 і SEQ ID NO:4, відповідно, як, наприклад, як необмежувальні приклади, нуклеотидні послідовності SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:3, відповідні послідовностям лінії клітин 16D3, що кодують область важкого і легкого ланцюгів антитіла 16D3. Також в контексті даного винаходу представлені нуклеотидні послідовності, які кодують одну або декілька областей CDR моноклонального антитіла 16D3, як ідентифіковані на SEQ ID NO:17-22. Конкретні варіанти здійснення винаходу включають послідовність, що кодує scFv і гуманізований scFv 16D3, як, наприклад, як необмежувальні приклади, SEQ ID NO:23 і SEQ ID NO:25, відповідно. Винахід також належить до нуклеотидних послідовностей, що кодують описані тут похідні 16D3 і їх фрагменти. Даний винахід також належить до зондів і праймерів, здатних специфічно гібридизуватися з вказаними вище нуклеотидними послідовностями, як, наприклад, як необмежувальні приклади, праймерів, описаних в розділі прикладів. Даний винахід також належить до нуклеотидних послідовностей, які комплементарні послідовностям, що кодують описані тут моноклональні антитіла, їх фрагменти або похідні. Ще один аспект даного винаходу належить до терапевтичного застосування антигензв'язувальних молекул за даним винаходом. Даний винахід, таким чином, належить до застосування антигензв'язувальних молекул за даним винаходом як лікарського засобу. У цьому відношенні, винахід належить до фармацевтичних композицій, що містять одну або декілька антигензв'язувальних молекул за винаходом, для профілактики або лікування захворювань або розладів, в яких ангіогенез додає внесок в патологію захворювання або розладу. Отже, способи лікування і/або профілактики захворювань, в яких ангіогенез додає внесок в патологію захворювання або розладу, включають введення ссавцеві, потребуючому такого лікування або профілактики, терапевтично ефективної кількості композиції, що містить одну або декілька описаних тут антигензв'язувальних молекул. При таких захворюваннях ангіогенез також позначають як «патологічний ангіогенез». Приклади такого патологічного ангіогенезу включають ангіогенез, що спостерігається при патології кровоносних судин (атеросклероз, гемангіома, гемангіоен 19 дотеліома), кістки і суглобів (ревматоїдний артрит, синовіїт, кістково-хрящова деструкція, остеомієліт, утворення пануса, утворення остеофітів, новоутворення і метастази), шкіри (бородавки, піогенні гранульоми, ріст волосся, саркома Капоши, келоїдні рубці, алергічний набряк, новоутворення), печінки, нирок, легень, вуха і інших епітеліїв (запальні і інфекційні процеси, включаючи гепатит, гломерулонефрит, пневмонію, астму, назальні поліпи, отит і трансплантацію, регенерація, новоутворення і метастази в цих органах), при визначених патологіях матки, яєчника і плаценти (дисфункціональна маткова кровотеча, наприклад, внаслідок використання внутрішньоматкових протизаплідних пристроїв, утворення фолікулярних кіст, синдрому гіперстимуляції яєчників, ендометріозу, новоутворень), патологій мозку або нервів (новоутворення і метастази), визначених пошкоджень серцевої і скелетної мускулатури (наприклад, внаслідок працювання з перевантаженням), патологічних станів жирової тканини (ожиріння) і ендокринних органів (тиреоїдит, збільшення щитовидної залози, пересадки підшлункової залози). Патологічний ангіогенез може також додавати внесок в захворювання гематопоезу (СНІД, саркома Капоши), гематологічні пухлини (лейкоз і т. п.). При ряді захворювань ока патологічний ангіогенез, як передбачають, є важливим фактором, і, таким чином, передбачено лікування антигензв'язувальними молекулами за даним винаходом. При «ішемічних захворюваннях сітківки» знижене постачання сітківки кров'ю і киснем, периферичні частини сітківки втрачають джерело живлення і перестають нормально функціонувати. Загальними причинами ретинопатії є оклюзія центральних вен сітківки, стеноз сонної артерії, діабет (діабетична ретинопатія) і анемія (серпоподібноклітинна ретинопатія). Ретинопатію також спостерігають у недоношених дітей (ретролентальна фіброплазія). Діабетична ретинопатія є головною причиною втрати зору у пацієнтів з діабетом. У ішемізованій сітківці відбувається утворення нових кровоносних судин (неоваскуляризація). Ці судини часто утворюються на поверхні сітківки, біля зорового нерва або в передній частині ока на райдужній оболонці. Нові судини не можуть відновити приплив необхідних поживних речовин і, замість цього, можуть викликати множину проблем, таких як крововилив в склоподібне тіло, відшаровування сітківки і неконтрольована глаукома. Ці проблеми виникають внаслідок того, що нові судини є ламкими і схильними до кровотечі. При виявленні на початкових стадіях проліферативну діабетичну ретинопатію можна іноді зупинити панретинальною фотокоагуляцією. Однак в деяких випадках, хірургічна вітректомія є єдиним засобом вибору. Інші захворювання ока, при яких ангіогенез, як передбачають, грає ключову роль, являють собою хоріоїдальні і інші внутрішньоочні розлади, лейкомаляцію і новоутворення, і метастази. Хоріоїдальна неоваскуляризація являє собою утворення нових кровоносних судин, які проростають з судинної оболонки через розрив мембрани Бруха в пігментний епітелій сітківки (sub-RPE) або субретинальний простір. Локалізація, характер росту і тип (1 або 2) CNV зале 94707 20 жать від віку пацієнта і захворювання, що лежить в основі. Кровотеча і утворення ексудату відбуваються при подальшому рості, будучи причиною зорових симптомів. Хоріоїдальна неоваскуляризація (CNV) є головною причиною втрати зору. Підраховано, що CNV виникає в 5-10% короткозорості і виникає практично при всіх перфораціях судинної оболонки в ході фази лікування; більшість проходять спонтанно, але у 15-30% пацієнтів CNV може рецидивувати і приводити до геморагічного або серозного відшаровування жовтої плями з супутньою втратою зору. Термін «легенева гіпертензія» належить до розладу, при якому кров'яний тиск в легеневих артеріях є патологічно високим. За відсутності інших захворювань серця або легень її називають первинною легеневою гіпертензією. Дифузне звуження легеневих артеріол виникає в результаті патологічного артеріогенезу з подальшою легеневою гіпертензією як реакцією на підвищений опір кровотоку. Частота виникнення становить 8 на 100000 чоловік. Однак, легенева гіпертензія може також виникати як ускладнення хронічних обструктивних захворювань легень (COPD), таких як емфізема, хронічний бронхіт або дифузний інтерстиціальний фіброз, і у пацієнтів з астматичним COPD. Частота виникнення COPD становить приблизно 5 на 10000 чоловік. Ще одним прикладом захворювання, при якому ангіогенез додає внесок в патологію захворювання і при якому передбачене лікування антигензв'язувальними молекулами за даним винаходом, є група запальних розладів. «Запалення», як застосовують тут, означає місцеву неконтрольовану реакцію на пошкодження (тобто фізичне, хімічне або внаслідок інфекції) живих тканин, особливо місцеву реакцію невеликих кровоносних судин, їх вмісту і пов'язаних з ними структур. Проходження компонентів крові через стінки судин в тканині є відмітною ознакою запалення, і таким чином утворюване скупчення в тканині називають ексудатом або набряком. Будь-який патологічний процес, який ушкоджує живу тканину, як, наприклад, як необмежувальні приклади, інфекція бактеріями, перегрів, холод, механічне пошкодження, таке як розтрощення, кислоти, луги, випромінювання або інфекція вірусами може спричиняти запалення безвідносно до залученого органа або тканини. Такі «запальні захворювання» включають реакції, що варіюють від опіків до пневмонії, прокази, туберкульозу і ревматоїдного артриту. Утворення спайок після операції (РОА) є частим хірургічним ускладненням в гінекологічній, тазовій і кардіологічній хірургії. Хірургічне пошкодження тканин часто спричиняє утворення постійного рубця, який з'єднує пошкоджену тканину з іншим органом. Таким чином, на місці такого пошкодження внутрішні тканини, які в нормі залишаються розділеними, часто стають сполученими одна з одною. Ускладнення, виникаючі внаслідок утворення спайок, являють собою непрохідність кишечнику, непрохідність тонкої кишки, хронічний тазовий біль і безплідність у жінок. Термін «утворення спайок» в медичному значенні належить до зрощення, процесу щільного з'єднання або об'єд 21 нання двох поверхонь або частин. Наприклад, об'єднання протилежних поверхонь рани або протилежних поверхонь очеревини. Також спайки, у множинній кількості, можуть означати запалені зв'язки, які з'єднують протилежні серозні поверхні. Термін «спайка», як застосовують тут, також включає фібринозні спайки, які являють собою спайки, які складаються з тонких ниток фібрину, виникаючих з ексудату плазми або лімфи, або екстравазації крові. Келоїд, гладке розростання фібробластної тканини, яка виникає в області пошкодження або іноді спонтанно, є також формою спайки. Показано, що інгібування плацентарного фактора росту (PLGF) приводить до примітного пригнічення постоперативного утворення спайок (WO 03063904). Більше того, показано, що інгібування PLGF може надавати сприятливу дію (WO 2004002524) при захворюваннях, відмінних резорбцією кістки, як, наприклад, як необмежувальні приклади, остеопороз. Таким чином, згідно з конкретним варіантом здійснення, антигензв'язувальні молекули за даним винаходом, особливо, придатні для лікування і/або профілактики росту пухлини і метастазів, захворювань ока, запалення, утворення спайок і легеневої гіпертензії. Інший конкретний варіант здійснення винаходу належить до застосування антигензв'язувальних молекул за даним винаходом для профілактики і/або лікування раку, такого як, як необмежувальні приклади, рак молочної залози, легені, передміхурової залози, мозку, печінки, підшлункової залози, товстої кишки, нирки, матки або кісткового мозку. Більш конкретно, винахід належить до застосування антигензв'язувальних молекул за даним винаходом для профілактики і/або лікування солідних пухлин, таких як, як необмежувальні приклади, раку товстої кишки, раку молочної залози, раку підшлункової залози і меланом. Більш конкретно, тут представлені дані, які показують, що антитіла за даним винаходом, особливо, придатні для одержання регресії пухлин підшлункової залози людини. Показано, що антитіла за даним винаходом значно зменшують розмір пухлини in vivo; таким чином, показані зменшення розміру аж до приблизно 50%. Таким чином, даний винахід належить до способів і фармацевтичних композицій для зменшення розміру пухлини щонайменше на 20%, більш конкретно щонайменше на 30%, найбільш конкретно щонайменше на 50%. Інший конкретний варіант здійснення винаходу належить до застосування антигензв'язувальних молекул за даним винаходом в лікуванні або профілактиці кісткових розладів і, більш конкретно, для лікування станів, при яких відбувається посилена резорбція кістки, така як, наприклад, остеопороз або остеомаляція. Отже, даний винахід належить до застосування антигензв'язувальних молекул за даним винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування вищезазначених захворювань. Важливий аспект даного винаходу полягає в тому, що антитіла, їх фрагменти і похідні дають можливість лікування і/або профілактики вищеза 94707 22 значених захворювань без побічних ефектів, які відносять на рахунок або очікуваних від інших антиангіогенних способів лікування, більш конкретно, альтернативних способів лікування з використанням ангіогенних факторів, таких як VEGF. Доклінічні безпечні випробування рекомбінантних людських антитіл анти-VEGF показали, ще в 1999, що інгібування VEGF приводить до інгібування фізіологічного ангіогенезу, більш конкретно, неоваскуляризації при рості кісток в довжину і формуванні жовтих тіл (Ryan et al., 1999 Toxicologic pathology 27(1):78-86). У останніх дослідженнях описують, що інгібітори VEGF викликають регресію судин в здоровій трахеї і щитовидних залозах, яка може приводити до органної дисфункції (Baffert et al., 2004 Circ Res 94:984-992; Inai et al., 2004 Am. J. Pathol. 165:35-52). Проте, бевацизумаб, антитіла проти VEGF людини, в цей час знаходиться на ринку як супресор ангіогенезу, незважаючи на спостережувані для нього ефекти на загоєння ран, кров'яний тиск і ризик тромбозу, внаслідок загальної ефективності даного антиангіогенного способу регресії пухлин. Антитіла анти-PLGF і похідні за даним винаходом дозволяють інгібувати небажаний ангіогенез без цих спостережуваних побічних ефектів на кров'яний тиск, загоєння ран, ризик тромбозу і регресію судин в здорових органах. Конкретний варіант здійснення даного винаходу належить до фармацевтичних композицій, які містять як активний інгредієнт, моноклональне антитіло 16D3 або його фрагмент або похідне, в суміші з фармацевтично прийнятним носієм. Фармацевтична композиція за даним винаходом містить терапевтично ефективну кількість однієї або декількох антигензв'язувальних молекул. Схожим чином, даний винахід належить до способів лікування і/або профілактики, які включають введення терапевтично ефективної кількості однієї або декількох антигензв'язувальних молекул за даним винаходом. Терапевтично ефективна кількість, як застосовують тут, означає кількість в діапазоні від приблизно 0,5 мг на кілограм маси тіла (мг/кг) до приблизно 50 мг/кг, більш переважно від приблизно 1 мг/кг до приблизно 10 мг/кг ссавця, що підлягає лікуванню. Потрібно брати до уваги, що в зв'язку з великим часом на півжиття більшості людських антитіл IgG антигензв'язувальні молекули за даним винаходом, які є моноклональними антитілами даного класу, забезпечать періодичність лікування, що додає внесок у зручність для пацієнта. Згідно з ще одним аспектом винаходу, надані фармацевтичні композиції, які містять антигензв'язувальні молекули за даним винаходом і інший антиангіогенний засіб, а також способи лікування, що включають одночасне або послідовне введення антигензв'язувальних молекул за даним винаходом і іншого антиангіогенного засобу. Дійсно, для даного винаходу показаний адитивним ефект антигензв'язувальних молекул за даним винаходом і інших антиангіогенних засобів, таких як антитіла анти-VEGF, на інгібування росту пухлини. Більш конкретно, показано, що сукупне застосування антитіла 16D3 за даним винаходом і Avastin® здатне зменшити розмір пухлини аж до 23 приблизно 70%, в той час як підвищені дозування або одного Avastin®, або анти-PLGF антитіл не приводять до зменшення розміру пухлини більше ніж на 55% в тих же умовах. Інші придатні антиангіогенні засоби, а також їх звичайне дозування залежно від класу, до якого вони належать, добре відомі фахівцям в даній галузі. Приклади антиангіогенних засобів включають інгібітори VEGF, які діють безпосередньо на VEGF, такі як антитіла, направлені проти VEGF, що продаються під назвою Avastin™, або діють на рецептори VEGF. Антитіла за даним винаходом дають можливість знизити дозування, наприклад, інгібуючих VEGF антиангіогенних засобів, про які відомо, що вони викликають ряд побічних ефектів, як описано вище. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть додатково містити терапевтично ефективну кількість інших сполук/лікарських засобів, які діють на захворювання, що підлягає лікуванню, більш конкретно, інших сполук/лікарських засобів, ефективних при лікуванні росту пухлини, запалення, захворювань ока і легеневої гіпертензії. Придатні фармацевтичні носії для застосування в фармацевтичних композиціях за винаходом описані, наприклад, в Remington's Pharmaceutical th Sciences 16 ed. (1980), і їх склад добре відомий фахівцям в даній галузі. Вони включають всі без виключення розчинники, дисперсні середовища, речовини для покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби (наприклад, фенол, сорбінову кислоту, хлорбутанол), ізотонічні речовини (такі як цукри або хлорид натрію) і т. п. Додаткові інгредієнти можна включати для контролю тривалості дії активного інгредієнта моноклональних антитіл в композиції. Композиції з контрольованим вивільненням можна, таким чином, одержувати відбором придатних полімерних носіїв, таких як, наприклад, складні поліефіри, поліамінокислоти, полівінілпіролідон, співполімери етиленвінілацетату, метилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза, сульфат протаміну і т. п. Швидкість вивільнення лікарського засобу і тривалість дії можна також контролювати включенням активного інгредієнта моноклональних антитіл в частинки, наприклад, мікрокапсули, з полімерної речовини, такої як гідрогелі, полімолочна кислота, гідроксиметилцелюлоза, поліметилметакрилат і інші вищеописані полімери. Такі способи включають системи доставки колоїдного лікарського засобу, такі як ліпосоми, мікросфери, мікроемульсії, наночастинки, нанокапсули і т. д. Залежно від способу введення для фармацевтичної композиції, що містить активний інгредієнт, можуть бути потрібні захисні покриття. Фармацевтична форма, придатна для ін'єкційного застосування, включає стерильні водні розчини або колоїдні розчини і стерильні порошки для її екстратемпорального приготування. Типові носії, таким чином, включають біосумісні водні буфери, етанол, гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і їх суміші. Антигензв'язувальні молекули за даним винаходом можна вводити пацієнту будь-якими способами, які добре відомі в даній галузі, тобто перорально, інтраназально, підшкірно, 94707 24 внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, внутрішньовенно, внутрішньоартеріально, парентерально або через катетер. Згідно з конкретним аспектом даного винаходу антигензв'язувальні молекули за даним винаходом вводять за допомогою генотерапії. Заснована на антитілах генотерапія дає можливість подолати ряд потенційних обмежень, пов'язаних з введенням антитіл, як наприклад, великомасштабне виробництво, біорозподілення, швидкий кліренс крові і погане утримування моновалентних антитіл. Вироблення in vivo робить антитіла менш імуногенними і краще переносимими, і дає ефективні і стійкі рівні антигензв'язувальних молекул або їх фрагментів. Більше того, генетичні способи дають можливість надати антигензв'язувальні молекули з новими функціями. Можливість вироблення in vivo і системної доставки моноклональних антитіл різними клітинами/тканинами показали з використанням перенесення генів in vivo вірусними векторами (Pelegrin et al., 2004, Gene Ther 4:347-356). Також показане зменшення росту пухлини in vitro і in vivo генною модифікацією клітин фібросаркоми за допомогою антитіл до ламініну з антиангіогенною активністю (Sanz et al., 2001, Cancer Immunol. Immunother 50:557-565). Таким чином, згідно з цим варіантом здійснення даний винахід належить до нуклеотидів, які кодують антигензв'язувальні молекули за даним винаходом для застосування в генотерапії при лікуванні захворювань, відмінних описаним тут патологічним ангіогенезом. Зокрема, даний винахід належить до композицій, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують варіабельну область важкого ланцюга, SEQ, що визначається ID NO:2, і/або нуклеотидні послідовності, які кодують варіабельну область легкого ланцюга, SEQ, що визначається ID NO:4, для застосування в генотерапії. Більш конкретно, даний винахід належить до композицій, які містять нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1 і/або SEQ ID NO:3, відповідну послідовностям лінії клітин 16D3, що кодують область важкого і легкого ланцюгів антитіла 16D3. Також в контексті даного винаходу надані композиції, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують одну або декілька областей CDR моноклональних антитіл 16D3, як ідентифіковані на SEQ ID NO:1722. Конкретні варіанти здійснення винаходу включають послідовність, яка кодує scFv і гуманізований scFv 16D3, таку як, як необмежувальні приклади, SEQ ID NO:23 і SEQ ID NO:25, відповідно. Спосіб лікування і/або профілактики згідно з винаходом може включати далі лікування або профілактику такого ж стану патологічного ангіогенезу введенням, переважно послідовним введенням, пацієнту терапевтично ефективної кількості антиангіогенного або протипухлинного засобу, такого як описаний вище під заголовком фармацевтичних композицій. «Послідовно», як застосовують тут, означає, що ліганд за даним винаходом і відомий антиангіогенний засіб вводять пацієнту послідовно, а не одночасно. Ще один аспект даного винаходу належить до застосування антигензв'язувальних молекул за винаходом для імунологічного детектування PLGF 25 в зразках з людини і як компонентів наборів, придатних для такого детектування. Способи імунологічного детектування антигену відомі в даній галузі і включають в себе, як необмежувальні приклади, ЕІА, ELISA і RIA, і імуногістохімічні способи. Зв'язування мишачих антитіл за даним винаходом з антигеном PLGF можна детектувати опосередковано, наприклад, за допомогою мічених антитіл проти миші. Альтернативно, антитіла або їх фрагменти можна мітити безпосередньо. Конкретний варіант здійснення цього аспекту винаходу належить до застосування антитіл проти PLGF і їх антигензв'язувальних фрагментів у виявленні пацієнтів, сприйнятливих до лікування з допомогою анти-PLGF. Це представляє особливий інтерес при лікуванні раку. Ще один аспект даного винаходу належить до застосування антигензв'язувальних молекул за даним винаходом як діагностичного засобу. Показано в даній галузі, що в ряді патологічних станів посилена експресія PLGF. Більш конкретно, для ряду пухлин показана надекспресія PLGF. Гуманізовані антитіла або фрагменти антитіл за даним винаходом можна застосовувати в діагностиці цих патологічних станів, наприклад, способами візуалізації, в яких антитіла або антигензв'язувальні фрагменти за винаходом мітять і візуалізують in vivo. У даній галузі відома множина міток для візуалізації зв'язування антигензв'язувальних молекул за даним винаходом in vivo, і вони включають в себе, як необмежувальні приклади, оптичні (наприклад, флуоресцентні), металеві і магнітні мітки, для кожної з яких потрібні специфічні пристрої для детектування. Конкретний варіант здійснення цього аспекту винаходу належить до застосування антитіл за винаходом в передбаченні прогнозу захворювання і виборі прийнятого лікування. Ще один аспект даного винаходу належить до застосування антигензв'язувальних молекул за даним винаходом в моделях на тваринах при скринінгу сполук для застосування в сполученні з лікуванням анти-PLGF. Такі моделі включають в себе, як необмежувальні приклади, моделі пухлин, де досліджують ріст і розвиток пухлинних клітин людини на мишах nu/nu. Сукупне введення сполуки, що підлягає тестуванню, і антитіл або фрагмента за даним винаходом дає можливість визначити, чи має сполука адитивний ефект в порівнянні з ефектом, що спостерігається при введенні одних антитіл або фрагментів за винаходом. Також, таким чином можна визначити інші аспекти, такі як зворотна ефективність або токсичність сполуки в сполученні з антитілами анти-PLGF. Крім описаного вище терапевтичного застосування, нуклеотидні послідовності за даним винаходом, описані вище, застосовні в одержанні антитіл і інших антигензв'язувальних фрагментів, наприклад, рекомбінантними способами. Таким чином, даний винахід далі належить до способів одержання рекомбінантних антитіл і фрагментів антитіл, включаючи клонування і маніпуляцію з генами антитіл, одержання scFv і інших антигензв'язувальних фрагментів з використанням описаних тут нуклеотидних послідовностей. Опис цих способів доступний в даній галузі. Крім того, зон 94707 26 ди, що специфічно гібридизуються з нуклеотидними послідовностями за даним винаходом, можна застосовувати для скринінгу на експресію антитіл і фрагментів антитіл за даним винаходом. Даний винахід далі описаний за допомогою наступних прикладів, які наведені тільки з ілюстративними цілями. Приклади Приклад 1 Одержання і характеризація мишачих антитіл проти PLGF людини (16D3) 1. Імунізація мишей і злиття Моноклональні антитіла проти PLGF людини одержували по суті, як описано в Galfré and Milstein (Galfré F., Milstein С. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Method Enzymol. 1981; 73:3-46). Коротко, мишей з нокаутом PLGF (Luttun et al, 2002, Biochem Biophys Res. Comm. 295(2):428-34, Carmeliet et al., 2001, Nat. Med. 7:575-593 або WO 01/85796) імунізували підшкірною ін'єкцією 50 мкг рекомбінантного PLGF2 людини (продукованого в Pichia) в повному ад'юванті Фрейнда, два тижні після імунізували підшкірною ін'єкцією 50 мкг рекомбінантного PLGF людини в неповному ад'юванті Фрейнда. Зразки крові (приблизно 100 мкл) відбирали з хвостів мишей після 10 діб. Сироватки тестували на антитіла анти-huPLGF за допомогою ELISA з використанням планшетів для мікротитрування, покритих іммобілізованим PLGF людини, використанням розведених сироваток (від 1/500 до 1/8000) і козячих IgG проти миші, кон'югованих з пероксидазою хрону (HRP), для мічення. Через проміжок щонайменше 6 тижнів мишей (з високими позитивними відповідями) повторно імунізували внутрішньочеревинно 50 мкг рекомбінантного PLGF людини в сольовому розчині на 4 і 2 добу перед злиттям клітин. Клітини селезінки виділяли і піддавали злиттю з клітинами мієломи Sp2/0-Ag14. Після селекції на середовищі з гіпоксантином, аміноптерином, тимідином позитивні клони відбирали з використанням супернатантів культур в ELISA, як описано вище. 2. Очищення антитіл на ProSер vA Ultra Антитіла очищали від супернатанту культури клітин афінною хроматографією на ProSep vA Ultra (Millipore) згідно з описом виробника. Коротко, 150 мМ NaCl додавали до супернатанту, і супернатант наносили на колонку ProSep vA Ultra, яку попередньо врівноважували PBS. Колонку промивали PBS і білок, що зв'язався, елюювали 0,1 Μ гліцином pH 2,8. Елюйований білок діалізували ON проти PBS. Чистоту елюйованого білка перевіряли у відновних і невідновних умовах за допомогою SDS-PAGE. 3. Зв'язування 16D3/hu16D3 (одержаного, як описано в прикладі 2) з PLGF (див. фіг. 1) Планшети для ELISA покривали ON 1 мкг/мл huPLGF-2 (Pichia) в PBS, 100 мкл/ямка, 4°С. Після забивання 1% BSA, 1 година, кімнатна температура, додавали серійне розведення 16D3/hu16D3, 100 мкл/ямка, антитіла залишали зв'язуватися 1 годину, кімнатна температура. 16D3, що зв'язалися, детектували козячими IgG-HRP проти людини або козячими IgG-HRP проти миші (Sigma), 100 мкл/ямка, 1 година, кімнатна температура. Аналіз детектували за допомогою OPD. 27 4. Інгібування зв'язування PLGF з рецептором huFIt-1 (див. фіг. 2) Планшети для ELISA покривали ON 1 мкг/мл huFlt-1 (R&D Systems), 200 мкл/ямка, ON, 4°С. Після забивання 1% BSA, 1 година, кімнатна температура, додавали серійне розведення 16D3/hu16D3, 100 мкл/ямка, і додавали додатково 100 мкл/ямка huPLGF-2. Після інкубації 2 години при кімнатній температурі PLGF, що зв'язався, детектували козячими анти-huPLGF (R&D Systems), 180 мкл/ямка, 1 годину, кімнатна температура, з подальшою інкубацією з RAG-HRP (DAKO), 1 годину, кімнатна температура. Аналіз детектували за допомогою OPD. 5. Подальша характеризація 16D3 і Fab 16D3 в експериментах з Віасоrе Інгібування: rhuPLGF-2 (Pichia, ТХ) іммобілізували на чипі СМ5 з використанням хімії EDC/NHS (набір для приєднання амінів, Віасоrе), даючи 412 RU. 16D3 впорскували з подальшим упорскуванням химерного rhuFlt-1/Fc (R&D Systems). Це також здійснювали з буфером замість мишачих антитіл. Їх також впорскували в канал потоку для негативного контролю, і ці величини вже відняли. Цей аналіз здійснювали в фосфатному буфері при pH 9,6. У порівнянні з максимальним зв'язуванням rhuFlt-1 з rhuPLGF-2, сигнал rhuFlt-1 знижений, якщо спочатку впорскують 16D3 або 16D3Fab (фіг. 3). 6. Клонування і секвенування варіабельних областей 16D3 миші Виділення мРНК: мРНК гібридомних клітин 16D3 виділяли з використанням QuickPrep™ Micro mRNA Purification Kit (Amersham Biosciences). Цю мРНК використовували для одержання кДНК з використанням First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences) з праймеру pd(N)6, присутнього в наборі. PCR: Послідовності варіабельних частин важкого і легкого ланцюга одержали за допомогою PCR з набору праймерів: 8 праймерів, що починаються в лідерній послідовності, і 2 в константній області важкого ланцюга, 11 праймерів, що починаються в лідерній послідовності, і 1 в константній області легкого ланцюга. Здійснювали 8 і 11 реакцій PCR з різними сполученнями праймерів. Праймери, що використовуються для важкого ланцюга антитіла 16D3: MHVR35'-ATG GRA TGG AGC TGK АТС WTT НТС-3' (SEQ ID NO:9) MHCR15'-CAS AYM CAG GGG CCA GTG GAT AGA C-3' (SEQ ID NO: 10). Праймери, що використовуються для легкого ланцюга антитіла 16D3: MKVR35'-ATG RAG ТСА САK ACY CAG GTC TTY RTA-3' (SEQ ID NO:11) MKCR15'-GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TGG-3' (SEQ ID NO:12). Протокол PCR: денатурація 10 хв. 94°С, денатурація 30 з 94°С, відпал 30 з 55°С, елонгація 1 хв. 72°С, елонгація 5 хв. 72°С, кількість циклів 30. Виродженість послідовності SEQ ID NO:9-11 вказана з використанням загальноприйнятих ско 94707 28 рочень R=A або G, K=G або Т, W=A або Т, Н=А або С, або Т, S=C або G, Y=C або Т, М=А або С. Клонування і секвенування: продукти PCR наносили на агарозний гель, правильні смуги відбирали, очищали (QIAquick® Gel Extraction kit, Qiagen GmbH) і клонували у вектор pCR®4BluntTOPO®, що поставляється в Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen™ life technologies). Плазмідну ДНК одержували з використанням High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Diagnostics GmbH), і вставки секвенували з використанням зворотних праймерів Т7 і М13 на ABI PRISM™ 310 (ΡΕ Applied Biosystems). Нуклеотидні і амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів антитіла 16D3 показані на SEQ ID NO:1, 2, 3 і 4 (див. фіг. 11). Приклад 2 Одержання і характеризація гуманізованих антитіл проти PLGF людини (16D3) 1. Конструювання гуманізованих 16D3 Гуманізація варіабельних областей Мутації: Одержані наступні мутації для гуманізації варіабельних частин мишачого антитіла 16D3: Важкий ланцюг: I2V Р9А K40А T111L Легкий ланцюг: S5T S9D A15L K18R R22N L89V. Мутації одержані з використанням QuickChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene®). У 1 PCR могли використовувати від 1 до 5 праймерів, що містять мутації. Після трансформації колонії відбирали, і ДНК секвенували для визначення клону з найбільшою кількістю точкових мутацій. Цей клон відбирали для повторення цієї процедури до одержання всіх мутацій в послідовності. Сполучання варіабельних областей з константною областю IgG людини: За допомогою PCR одержали гуманізовані варіабельні частини важкого і легкого ланцюгів, до яких додали придатні ділянки рестрикції. Праймери для варіабельної частини легкого ланцюга: Праймер 1:5'-CCACCGGT GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CC-3' (SEQ ID NO: 13) Праймер 2:5'-CACCGTACG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC CGA G-3' (SEQ ID NO:14) Праймери для варіабельної частини важкого ланцюга: Праймер 3:5'-CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT G-3' (SEQ ID NO:15) Праймер 4:5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGC TGA GGA GAC TGT GAG CAG GG-3' (SEQ ID NO:16) 29 Протокол PCR: денатурація 5 хв. 94°C, денатурація 30 з 94°С, відпал 30 з 60°С, елонгація 30 з 72°С, елонгація 5 хв. 72°С, кількість циклів 25. Продукти PCR наносили на агарозний гель, смуги відбирали і очищали (QIAquick® Gel Extraction kit, Qiagen GmbH). Продукт PCR варіабельної частини важкого ланцюга 16D3 розщеплювали Sall, вектор pKANEO-MCS50-Hleu-var № 24, що містить повну константну частину важкого ланцюга людських антитіл (IgG4), розщеплювали Есо47lll і Sall і лігували. Продукт PCR варіабельної частини легкого ланцюга спочатку клонували у вектор pCR®4Blunt-TOPO®, що поставляється в Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen™ life technologies). Варіабельну частину легкого ланцюга відщеплювали за допомогою Agel і BsiWI і клонували у вектор pKANEO-CM30-L-var № 7, який вже містив константну частину легкого каппа-ланцюга людини. Обидва вектори об'єднували в один вектор вищеплюванням експресуючої касети легкого ланцюга з вектора з використанням Pmel і Расl і приєднанням її до вектора, що містить важкий ланцюг. Нуклеотидні і амінокислотні послідовності варіабельних частин важкого і легкого ланцюгів гуманізованих антитіл 16D3 представлені на SEQ ID NO:5, 6, 7 і 8 (див. фіг. 12). 2. Короткочасна експресія hu16D3 Hu16D3 IgG4k короткочасно експресували в клітинах НЕК 293 з використанням FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen) згідно з інструкцією виробника. Hu16D3 очищали від супернатанту з використанням афінної хроматографії на proSep vA Ultra. Чистоту очищеного hu16D3 перевіряли за допомогою SDS-PAGE у відновних і невідновних умовах. Hu16D3 далі тестували на зв'язування з huPLGF і на інгібування зв'язування HuPLGF/huFLT-1 за допомогою ELISA (див. фіг. 1 і 2). Приклад 3 Дослідження in vivo інгібування росту пухлини антитілами анти-PLGF 1. Загальний опис матеріалів і методів Культура клітин Лінії клітин Раnc02 підшлункової залози миші і лінія клітин DanG підшлункової залози людини люб'язно надані S. Rosewicz (ChariteUniversitatsmedizin Berlin, Germany). Лінії клітин MDA-MB молочної залози, LOVO товстої кишки і Ме12а меланоми людини одержані з American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). Всі клітини культивували згідно з рекомендаціями. Мишачі антитіла 16D3 анти-PLGF використовували для всіх експериментів in vivo, щоб уникнути імунної відповіді на антитіла. Експерименти на тваринах Всі процедури на тваринах повністю схвалені інституціональним комітетом з догляду за тваринами і їх використання. Самиць мишей NMRI nu/nu містили в напівстерильних умовах і, як загальноприйнято, використовували їх у віці 8-10 тижнів (приблизна маса 25 г). Для одержання джерела пухлини пухлинні клітини обробляли трипсином для одержання суспензії з одиночних клітин, яку промивали PBS. Осад після центрифугування повторно ресуспендували в 200 мкл PBS і підшкірно 94707 30 ін'єктували мишам в правий бік. Для ортотопічної 6 моделі пухлини підшлункової залози, 110 пухлинних клітин в 30 мкл PBS ін'єктували в головку підшлункової залози за допомогою черевної лапаротомії самиць мишей С57В16 у віці 9-10 тижнів. Перед процедурами мишей анестезували кетаміном (90 мг/кг маси тіла) і ксилазином (9 мг/кг маси тіла). Введення лікарських засобів (тобто антитіл, носія і т. п.) Лікування антитілами або носієм, як контроль, починали при досягненні пухлинами розміру приб3 лизно 60 мм . Антитіла P15D11D4 (WO 01/85796), 16D3, 1С8 або носій вводили у вказаних дозах внутрішньочеревинно через кожну добу. Авастин ін'єктували у вказаних дозах внутрішньочеревинно два рази на тиждень. Вимірювання пухлин Підшкірно зростаючі пухлини вимірювали через кожну добу з використанням вимірювального інструмента, і об'єми пухлин обчислювали з використанням формули p/6 (w1  w2  w2), де «w1» і «w2» являють собою найбільший і найменший діаметр пухлини, відповідно. Коли мишей забивали, ортотопічно зростаючі пухлини підшлункової залози вимірювали після черевної лапаротомії з використанням того ж способу. Статистичний аналіз Статистичний аналіз здійснювали за допомогою двостороннього критерію Стьюдента для парних спостереженьз використанням статистичного програмного забезпечення GraphPad (GraphPad Software Inc., San-Diego, CA). Всі дані представлені у вигляді середнього значення  SEM, якщо не указано інакше. *р