Очищений антигенний поліпептид, препарат, здатний створити у чутливого хазяїна захисну імунологічну реакцію на інфікування e. granulosus, молекула днк, молекула кднк, рекомбінантний вектор експресії (варіанти),

1 Очищенный антигенный полипептид с молекулярной массой в интервале 23-25 кДа при определении методом НДС-ПАГЭ, включающий аминокислотную последовательность Leu Ее Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gin Glu Туг Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Aig Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asa Leu Thr Pro Val Giy Ser Gin Gly Пс Arg leu Ser Trp Glu Val Gin His Leu Scr Asp Leu Lys Gly Thr Asp He Ser Leu Lys Ala Va! Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Туг Lys Arg Gin и который способен создавать у восприимчивого хозяина защитную иммунологическую реакцию на инфицирование Е granulosus или его пептидный фрагмент или вариант, обладающие эквивалентной с ним иммунологической активностью 2 Очищенный антигенный полипептид по п 1,отличающийся тем, что состоит из аминокислотной последовательности Leu De Lea Pbe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gin Glu Tyr Lys Giy Met Gly Val Glu Tbr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Pbe Asn Leu Thr Pro Val Giy Ser Gin Gly lie Arg Leu Ser Trp Glu Val Gin His Leu Ser Asp Leu Lys GJy Tbr Asp He Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gin . 3 Очищенный антигенный полипептид по п 1, отличающийся тем, что состоит из аминокислотной последовательности Gin Leu Cys Leu De Leu Phe Ala Thr Scr Val Leu Ala Gin Glu Tyr Lys Gly Met GJy VaJ Glu Thr Axg Thr Tlir Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asa Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly He Arg Leu Ser Trp Gic Val Gia His Leu Ser Asp Leu Lys Giy Thr Asp He Scr Leu Lys Ala Val Asa Pro Scr Asp Pro Leu Val Тут Lys Arg Gin . 4 Очищенный антигенный полипептид по п 1, отличающийся тем, что включает аминокислотную последовательность Gin Leu Cys Leu Be Leu Phe Aia Thr Scr Val Leu Ala Gin Giu Тут Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly Ее Arg Leu Ser Trp Glu Val Gin His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Пе Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gia Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gia Leu Thr He Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Тут Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr He Leu GSy Phe Thr Val Asp Пе Glu Tbr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Giu Ser Thr Val Mel Thr Ser Giy Ser Ala Leu Thr Ser Ala Пе Ala Gly Pfae Val Phe Ser Cys Пс Val Val Val Leu Thr . 5 Очищенный антигенный полипептид по п 1, отличающийся тем, что состоит из аминокислотной последовательности О (О ю 45946 12 Молекула ДНК по п 10, отличающаяся тем, Gin Leu Cys Leu He Leu Phe Ala Thr Set Val Leu Ala Gin Glu что содержит ДНК-последовательность Тут Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly He Arg Leu Ser Trp Glu Val G b His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp He Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg G b Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gin Leu ТЬг He Gly Giu Leu Lys Pro Ser Tbr Leu Tyr Lys Met Thr Val GJu Ala Val Lys Aia Lys Lys Thr He Leu Giy Phe Thr Val Asp He Giu Thr Pro Arg AJa Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Giy Ser Ala Leu Thr Ser Ala He Ala Giy Phe Val Phe Ser Cys Ue Val Val Val Leu Thr . 6 Очищенный антигенный полипептид по любому из пп 1-5, отличающийся тем, что является продуісгом кодирующей их нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине 7 Очищенный антигенный полипептид по п 6, отличающийся тем, что экспрессируются в клетке-хозяине в виде слитого белка 8 Очищенный антигенный полипептид по п 7, отличающиеся тем, что экспрессируются в виде слитого белка с глутатион s-трансферазой Е С 2518 9 Препарат, способный создать у восприимчивого хозяина защитную иммунологическую реакцию на инфицирование Е granulosus, отличающийся тем, что включает компонент, выбранный из группы, включающей (a) полипептидпо п 1, (b) пептидный фрагмент (а) с эквивалентной протективной иммунологической активностью, (c) вариант (а) или (Ь), модифицированный вставкой, замещением или делецией одной или нескольких аминокислот и обладающий, по крайней мере, эквивалентной защитной иммунологической активностью 10 Молекула ДНК, отличающаяся тем, что представляет собой нуклеотидную последовательность, выбранную из группы (a) нуклеотидной последовательности, кодирующей антигенный полипептид п 1, (b) нуклеотидной последовательности, кодирующей пептидный фрагмент антигенного пептида (а), причем фрагмент обладает эквивалентной полипептиду (а) протективной иммунологической активностью, (c) нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида (а) или пептида (Ь), в котором аминокислотная последовательность модифицирована вставкой, замещением или делецией одной или нескольких аминокислот, причем вариант обладает эквивалентной полипептиду (а) или пептидному фрагменту (Ь) протективной иммунологической активностью 11 Молекула ДНК по п 10, отличающаяся тем, что содержит ДНК-последовательность GT CTC ATT TTG ТТТ GCG ACT TCA GTT TTG GCT CAG GAA TAC AAA GGA ATG GGC GTA GAG АСА AGG АСА АСА GAG ACT CCG CTC CGT AAA CAC TTC AAT TTG ACT CCT GTG GGT TCT CAG GGC ATT CGC TTA AGT TGG GAA GTC CAA CAC TTG TCT GAC CTC AAA GGA АСА GAT ATT TCT СТА AAA GCG GTG AAT CCT ТСГ GAC CCG TTA GTC TAC AAA AGA CAA . САО ттА тот сте лтт тто m аса ACT ТСА ота тта ост схо елл *ле АХА Cln L.u Су» Ъач I I ' Ъта *Ь« Ala таг «ar Vil i*u Ala Die Ola Тут ly« GOA АТО вес СТА одо АСА хаа АСА АСА ОАО АСЗ сев стс сет АЛА САС я е Cly X*e Gly Т«1 Сіп ТЪх Are Т Ы ThI вій Миє (to bail Are by* « • »Ь* ААГ TTS ACT CCT СТО CCT ЇСТ> САв ССС ATT CSC TTA ACT Ті» ОАА ОТС СЛЛ Аіп їли Thr »ro Val Cly Ваг Сія Cly II» Аго Ь*« « « *ір ОІи Val вів САС П О ТСТ ОАС СТС ЛАА 5СА АС* ЗЛІ АТТ ЇСТ СТА АЛА ОСО СТО АЛТ ССТ Вії Ь.и їаї Хир ілм. ї.у* Oly VOX Кгр Хіт ваг їли tarn Xl> V.I *j» See TCT CAC CCS TTA OTC CAC AAA АСЛ CAA ACT CCA AAA TTC TCA OAT GSA СЛЛ £>r A I D *r° b«u Val туе Ьу> Л г В Ola Vbx Xla by* >b 180кД подвергают аффинной очистки - с полосок нитроцеллюлозы, содержащих указанные антигены Очистку проводят по методике Beall J А , и М Lchell G F Идентификация конкретного антигена из кДНК библиотеки паразита применением антител, полученных аффинной очисткой из выбранных частей вестерн бдотов Journal of Immunological Methods 86, 217 - 223 (1986) Белкомносителем служит 1% сыворотка плодного ягненка Аффинно очищенные антитела промывают и затем применением перемешиваемой ячейки Амикон и, мембраны PMIO концентрируют в 10 раз ПРИМЕР 3 КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК АНТИГЕНОВ ОНКОСФЕРЫ ECINOCOCCUS GRAANOLOSUS 1 Выделение и проверка мРНК (а) Подготовка реактивов Все растворы, используемые при выделении и обработке мРНК, за исключением растворов, содержащих Трис/Трис (гидроксиметил) аминометан, Сигма, Сан-Луи, МО, СМ) обрабатывают в 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% течение ночи 0,1% диэтилпирокарбоната (ДЭРК, Сигма) и перед употреблением выдерживают в автоклаве Всю стеклянную посуду прокаливают в течение ночи при температуре 200°С или выше Общие растворы Трис получают в воде, обработанной ДЭПК и в автоклаве (в) Онкосферы Зрелые яйца Е granulosus получают и активируют прорклевыванием по методике, подробно изложенной в примере 1 Примерно 4 x 1 0 онкосфер, солюбилизируют на льду в безнуклеазном, 6М гидрохлориде гуанидина (BRL ультрачистый Бетесда Рисерч Лаборэториз, США), 0,1 М ацетате натрия с помощью тканевого гомогенизатора из стекла и тефлона Солюбилизированные онкосферы перед выделением РНК хранят при - 70°С (с) Выделение РНК Солюбилизированные онкосферы оттаивают на льду и нерастворимые вещества осаждают центрифугированием 30 минут при 4°С и ЮОООоб/мин в роторе типа 50Т, и ультрацентрифуге Бекман I 8 (Бекман, Пало, Альто, СА, США) Надосадочную жидкость наслаивают над раствором, содержащим 4,8М хлорида цезия (CsCI, BRI ультрачистый, Бетесда Рисерч Лаборэториз, Гайтерсбург, МД, США) ЮмМ ЭДТК (этилендиамминтетрауксусная кислота, динатриевая соль) в количестве 6,5мл гуанидина/5,5мл С CI на полналломерную пробирку для ротора Бекман SW40 Пробирки центрифугируют 18ч при 15°С и 35000об/мин в SW40 роторе, ультрацентрифуге Бекман L8 Надосадочную жидкость отбрасывают, а основание пробирки быстро и осторожно ополаскивают 200мкл ТюЕі (ЮмМ Трис, 1мМ ЭДТК, рН8) Осажденную РНК растворяют в 200мкл ТюЕі и вновь осаждают давлением 1 10 объема ЗМ ацетата натрия и 2,5 объема охлажденного льдом 100%-го этанола, после чего выдерживают в течение ночи при 20°С Осажденную РНК центрифугируют 15 минут при 4°С в микроцентрифуге, осадок ополаскивают 70%-ым этанолом, центрифугирование повторяют и конечный осадок сушат на воздухе Затем РНК суспендируют в 50мкл Т-юЕ-і, и ее количество, определенное по поглощению при длине волны 260нм, составляет 23мкг общей РНК Один микрограмм анализируют на 1,2% формальдегид-агарозном rene(Sambrook J Fntschee Е Р , Mamatis) Молекулярное клонирование лабораторное руководство, Коулд Спринт Нарбор Лаборэтори Пресс (1989) и находят, что РНК включает интактную рибосомную РНК (о) Очистка поли-А+ РНК 25 45946 26 + Поли-А матричную РНК очищают на содержит примерно 100000 первичных клонов олиго^Т)-целлюлозе типа 7 (Фармация ЛКБ Био(методика приведена в инструкции к набору для текнолоджи, Уппсала, Швеция) согласно инструккопирования UNI-ZAPXR, Стратаген) циям изготовителя, но особенно по методике Aviv 3 Амплификация кДНК библиотеки Н Leder P Очистка биологически активной матБиблиотеку кДНК целиком амплифицируют на ричной РНК глобина хроматографией на олиготиклетках Е coh PLKK-F' при плотности 5000 бляшмидильной кислотной целлюлозе, Рпс Nal Acad ко-образующих единиц (БОЕ) на пластинку агара + Sci 69, 1408 -1412 (1972) Элюируемую поли-А диаметром 150мм Амплифицированный фаг сомРНК осаждают вышеприведенным способом и бирают в течение ночи в 10мл SM (ЮОмМ NaCI, оса док вновь растворяют в 50мкл ТюЕі 8мМ MgSO4, 50мМ Трис (рН7,5 ), 0,01% мае/об желатина) Амплфицированную библиотеку объе(е) Трансляция in vitro диняют и титруют на клетках Е coh XI І-Голубой мРНК аликвотой в 5мкл транслируют in vitro (Стратаген) в присутствии изопропилтиогалактоиспользованием лизата кроличьих ретикулоцитов зида (ИПТГ) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-О(Amersham Англия) согласно инструкциям изготогалактозида (ХоАІ) согласно инструкции к набору вителя в полном реакционном объеме в 25мкл s для клонирования IIII-APXP (Стратаген) Продукт радиометят применением 37,5MKCI 35 метионина (Amersham Интернейшнл, Amersham 4 Иммуноскрининг кДНК библиотеки Англия) и исследуют электрофорезом на полиак(а) Приготовление антител-зондов риламидном геле в 10%-ном акриламидном геле в В иммуноанализе бляшек использовано два восстановительных условиях (Laemml U К ) Растипа антител-зондов, сывороточных и аффинно щепление структурных белков в ходе сборки гоочищенных антител, полученных по методике ловки бактериофага Т4, Nature 227, 680 - 685 примера 2 Сывороточные образцы обедняют от (1970) с детектированием флюорографией с по"фоновой" реакционноспособности к Е coh и/или следующей пропиткой геля Амплифай (Amersham Р- галактоз ид азе следующим образом НерекомбиАнглия) Продукты трансляции были обильными и нантный Я,дШ или A.ZAP наносят почти конфлуэнтсамыми разнообразными по размеру, включая но на приемлемый штамм Е coh (как правило, XLпродукты с молекулярной массой более 94кД I, Стратаген) Нитроцеллюлозные фильтры (Шляйхер энд Шуелл, Дассель, Германия) пропи2 Синтез - и клонирование кДНК тывают ЮмМ ИПТГ, сушат и после инкубирования (а) Синтез кДНК пластинок 4 часа при 42°С поверх каждой стороны Тридцать семь микролитров раствора мРНК в пластинки накладывают по одному фильтру ЗаТюЕі подвергают обратной транскрипции в притем пластинки выдерживают в течение ночипри сутствии L3 Р-дАТФ (Amersham) с применением 37°С к еще Збмин при 4°С Фильтры удаляют и обратной транскриптазы вируса мышином лейкеополаскивают TNT (150мМ NaCI, 0,05% Твин 20, мий Молони, а также реактивов и инструкции, ЮмМ Трис, рН8) и инкубируют в 5% обезжиренноприлагаемых к набору синтеза кДНК ZAP (Лот го молочного порошка/TNT (BLOTTO) 1час Все №UC206, каталожный №200400, Стратаген, операции инкубирования в иммуноанализе провоДжолла, США), после синтеза второй цепи аликдят при комнатной температуре (КТ°) на вращаювотное количество анализируют электрофорезом щейся платформе Каждый применяемый в иммуна 1% щелочном агарозном геле согласно инстноанализе образец разбавляют TNT плюс 20% рукции, прилагаемой к набору синтеза кДНК 2ZAP сыворотки плодного теленка (FTNT) и инкубируют кДНК была неоднородной по размеру, и при сравв чашке Петри, содержащей 20мл разбавленной нении с лямбда - Hmdlll ДНК маркерами (Промега сыворотки плюс два нитроцеллюлозных фильтра, Корпорейшн, Медисон, ВИ, США) включала подприготовленных вышеописанным способом После дающиеся обнаружению транскрипту в более, чем инкубирования 2ч нтроцеллюлозные фильтры 2000п о удаляют, и аффинно обедненная сыворотка гото(в) Клонирование кДНК ва к применению в иммуноанализе бляшек кДНК клонируют в бактериофаговый вектор Um-ZAPXR (A.ZAP) (Стратаген) в условиях, подАнтитела-зонды, полученные из сыворотки робно изложенных в инструкции изготовителя нааффинной очисткой (подробности см пример 2), бора для клонирования UNI-ZAPXR (Лот №18, не подвергают аффинному обеднению с нерекомкаталожный №237211, Стратаген) кДНК лигируют бинантными Я,дШ или A.ZAP и в иммуноанализе их с вектором без какого-либо отбора кДНК по разприменяют без разбавления меру Образец кДНК полностью лигируют с 1мкг (в) Иммуноанализ клонов кДНК библиотеки векторной ДНК В первичном скрининге амплифицированной (с) Упаковка in vitro бактериофага кДНК библиотеки используют два источника антиДва микролитра лигированной с вектором тел Сыворотку овцы 1486, полученную по метокДНК упаковывают в инфекционный фаг применедике примера 2, готовят вышеприведенным спонием единственной упаковочной реакции из Gigaсобом и применяют для выявления кДНК клонов, packk II Gold (Лот №1535, каталожный №200216, экспрессирующих антигены онкосферы Е granuloСтратаген) согласно инструкциям изготовителя sus кДНК библиотеку наносят на пластинки и подПолученный фагтитруют на Е coh PLLKK-F' Освергают иммуноанализу по стандартным методитальную лигированную кДНК затем упаковывают в кам, приведенным в работе Sambrook и др (см двух равнозначных реакциях, продукты трех реаквыше) Вкратце Бляшки наносят в чашках Петри ций объединяют и титруют Полученную библиодиаметром 1500мм в количестве 5000БОЕ на платеку кДНК клонов (кДНК библиотека) в ZAP титрустинку LG агарозы и NZY поверхностного агара ют в PLK-F, и согласно анализу библиотека (0,9% агара) Применяют ВВ4 и XLI Голубой 28 27 45946 штаммы Е coli (Стратаген) Клоны, связывающие (в) Субклонирование в рСЕХ-ЗЕХ антитела в испытуемой свечей сыворотке, обнаВекторной системой, выбранной для экспресруживают с помощью кроличьего антиовечьего сии антигенов Е granulosus с целью испытания IgG (тяжелая и легкая цепь), коньюгированного с вакцины, служат плазмиды серии pGEX (АМРАД щелочной фосфатазой (каталожный №313055003, Корпорейшн, Мельбурн, Австралия), экспрессиДжексон Иммуно Рисерч Лабораторна, Вест Грорующие кодируемую паразитом часть молекулы в ув, США) Коньюгат антител разбавляют в отновиде слитого белка у карбоксильного конца Schisшении 1 2000 в BLOTTO и инкубируют в количеtosoma japonicum гл угати о H-S-тра нефе разы (Smith стве 5мл на фильтр, каждый фильтр по D В Johnon К S) Очистка в одну стадию полиотдельности по 2ч Затем фильтры промывают по пептидов, экспрессируемых в Eschenchi coli в виде отдельности шестью переменами TNT в течение слитых белков с глутатион-З-трансферазой, Сепе 1ч со вращением между переменами Положи67, 31 - 40 (1988)) Чтобы иметь возможность субтельные бляшки обнаруживают с помощью бромклонировать непосредственно клонируемые кДНК хлориндолилфосфата/нитроголубого тетразолия из AZAPXR вектора, было необходимо модифици(БХИФ/НГТ) в качестве хромогенного субстрата по ровать рСЕХЗХ вектор с целью вставки XhOl сайта методике Hanow Е , Lane D , Антитела, лаборарестрикции в нисходящем направлении от Eco RI торное руковойство, Коулд Спринг Харбор Лабосайта рестрикции в pGEX полилинкере Это было ратори Пресс (1988) В общей сложности бляшки достигнуто вставкой ренатурированных олигонук129 клонов идентифицированы, как дающие предлеотидов, имеющих следующую последовательположительно положительные сигналы с сыворотность кой Каждую такую бляшку снимают с пластинки 5'ААТТСАТАСТССАСТЗ1 агара стерильной пастеровской пипеткой и пере3'СТАТСАССТСАТТАА5' носят в 0,5мл SM SM надосадочную жиднооть от Помимо введения XhOl сайта данный конструкт каждого клона, содержащую пассивно элюируесохраняет однонаправленное планирование кДНК, мый клон бактериофага, титруют по стандартной созданное в AZAPXR - векторе Модифицированметодике (SambrooK и др , см выше) и подвергают ный вектор получил обозначение рСЕХЗЕХ При повторному скринингу на пластинках диаметром модификации pGEX вектора использованы обыч75мм и фильтрах при низкой плотности (установоные методики, подробно описанные у Sambrook и чне 50 бляшек на пластинку) Из 129 исходных др (см выше) Если вкратце, то ренатурированклонов для 80 подтверждена положительная реные олигонуклеотиды обрабатывают Т4 Полинукакция, проведенная вышеописанным способом с леотид-киназой (Нью Ингланд Биолабз, Беверли, сывороткой овцы 1488 КА, США), pGEX3XflHK гидролизуют в присутствии Eco RI (Нью Ингланд Биолабз), фосфатизируАналогичным образом библиотеку подвергают ют и лигируют с обработанными киназой ренатускринингу с антителами, полученными аффинной рированными олигонуклеотидами Применением очисткой по методике примера 2 от овцы 1486 кальцийхлоридного метода Е coli JM101 трансЕдинственный положительный клон выявлен для формируют лигированной плазмидой, Отбирают фракции 2 сыворотки (соответствует антителам к трансформированные плазмидой бактериальные антигенам онкосферы в 20 - 25кД), который обоклоны, выделяют плазмидную ДНК и модификазначен, как клон S2, и один клок собран, как реацию подтверждают секвенированием соответстгирующий с фракцией 3 сыворотки (антигены з 25 вующего участка ДНК методом дидезокситерми- ЗОкД), и обозначен клоном S3 Для обоих клонов нации цепи после субклонирования в бактериофаг подтверждена положительность но вторичном MI3 Bam HI (положение 914)/Pstl (положение иммуноанализе, приведенном выше 1885) pGEX3EX вектор имеет следующую ДНККаждый клон фаза нанесен на единственную последовательность и предсказанную трансляципластинку диаметром 150мм с плотностью онную аминокислотную последовательность в 20000БОЕ/пластинку и общее количество фага области полилинкера собирают способом, приведенным выше для амплификации библиотеки ВзшН! pGEX-ЗЕХ ССА ААА TCG GAT СТО АТС GAA GGT CGT GGG АТС (с) Отбор клонов Pro Lys S«F Asp Leu He Glu Giv кц Giy He Из библиотеки клонов на основе результатов иммуноанализа клоны S2, S3, 48, 95, 101, 119 и S .t 123 отобраны для дальнейших испытаний на преtCC GGG AAT TCA TAC TOO AGT AAT TCA TCG TGA дамет выявления, способны ли экспрессируемые ho Gly Ass Ser Тут Ser Ser Asa Ser Ser "• ими антигены защитить хозяина Клоны 33, 42 и 86 ДНК плазмиды Pbluescnpt очищают от цен(для которых предшествующими не сообщенными трифугированием в CsCI (Sambrook и др , см выисследованиями заявителей установлена неспоше) и вставку кДНК вырезают следующим обрасобность создать статистически значимую защиту) зом Примерно 2мкг каждого клона pBluescnpt ДНК также отобраны для использования в качестве гидролизуют в присутствии по 10 единиц каждой контрольных из EcoRI и XhOl (Амерсхам, Англия) в 20мкл высоко 5 Субклонирование и экспрессия кДНК солевого буфера Вставку ДНК очищают в 1% агарозы, полосы ДНК вырезают и очищают с помо(а) Получение pBluuescnipt щью Генеклина (БИО101 Инк, Ла Джолла, США) Плазмида pBluuescnipt создана с помощью После количественного определения по поглощефлагмидного помощника из A.ZAP общего образца, нию при 260нм примерно ЮОнг вставки ДНК лигиотобранного для каждого кДНК клона согласно руют (2 единицы Т4 ДНК-лигазы, Бозрингер, Маннинструкции изготовителя, прилагаемой к набору гейм) с примерно 50нг очищенного в CSCI, для клонирования UNII-ZAPPXR (Стратаген) 30 29 45946 фосфатизированного продуїсга гидролиза рСЕХПРИМЕР 5 ДЕМОНСТРАЦИЯ ИММУНОГЕНЗЕХ ДНК в присутствии обоих EcoRI и XhOl НОСТИ Е GRANULOSUS СЛИТОГО БЕЛКА Лигированной рСЕХ-ЗЕХ кДНК (см ниже) Овцы во время первой вакцинации достигали трансформируют Е coh штамм ВВ4 (Стратаген возраста 8 месяцев, и вскармливались на пастКлонинг системе, Ла Джолла, Калифорния, США бищах, свободных от яиц Е granulosus В экспекаталожный №200259) электропорацией с примериментах применялись овцы пород Ромни и Дорнением генного пульсатора фирмы БиоРад сосет, которые рассеивались в 9 группах из 5 гласно инструкции изготовителя (БиоРад, Ричвакцинированных овец и 1 контрольной группы из монд, США) 8 овец Каждому животному вводилось 50мкг связанного с агарозой слитого белка (полученного по ПРИМЕР 4 ПРОДУЦИРОВАНИЕ СЛИТОГО методике примера 4) в смеси (1 1) солевого расБЕЛКА Е GRANULOSUS твора ТА адъюванта (Bokhout В А , van Gaalen С Отобранные клоны кДНК онкосферы Е granuVan der Heijden Ph J) Подобранная эмульсия losus субклонируют в экспрессионную плазмиду типа вода в массле Состав и применение в качерСЕХ-ЗЕХ и трансформируют Е coh штамм ВВ4 стве иммунологического адъюванта, Veterinary вышеприведенным способом Immunology and Immunpathlogy 2, 491 - 500 (1981) Экспрессией получают белок паразита, слиПолный объем инъекции в 2мл/овцу вводят полотый с глутатион-Э-трансферазой (ГСТ) Такие сливине животных подкожно, а другой половине тые белки часто растворимы, что позволяет вывнутримышечно, в обоих случаях с левой стороны делять их из лизированных клеток в Через месяц инъектирование повторяют с правой неденатурирущих условиях путем абсорбции шастороны Контрольным животным вводят экспресриками глутатион-агарозы сированную глутатион-трансферазу из рСЕХ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ GST слитый белок индуцируют и очищают по Через две недели после второй инъекции у существу применением методики Smith и Johnson, овец берут кровь и готовят сыворотку для культиGene 67, 31 - 40 (1988) использованием характервирования in vitro и для иммублотирования антиных стадий, подробно изложенных ниже гена онкосферы по методике примера 1 В тот же день овец заражают 1000 яйцами Е granulosus 1 Колонией рСЕХ трансформанта инкубируют перорально (см пример 1) 4 х 100мл LB/ампициллин среды, инкубируют в течение ночи при 37°С во встряхиваемом инкубаАУТОПСИЯ торе Через шесть месяцев после заражения овец обескровливают после оглушення пистолетом для 2 Культуры разбавляют в отношении 1 10 оглашения скота, легкие и печень удаляют для свежей LB/ампициллин средой и инкубируют исследования В печени с интервалом в 2мм де90мин при 30°С лают надрезы и тщательно на глаз определяют 3 Добавлением ЮОмМ ИПТГдо концентрации наличие цист, в легких надрезы делают с интер0,1 мМ индуцируют экспрессию валом в 4мм и для определения присутствия цист 4 Инкубирование продолжают еще 4,5 часа надрезы пальпируют В сомнительных случаях 5 Клетки собирают центрифугированием при надрезы вскрывают для подверждения присутст5000хд,4°С, Юмин вия в них цист Е granulosus 6 Клеточный осадок от каждого 1 литра вновь суспендируют 15мл холодного ФБС и хранят при РЕЗУЛЬТАТЫ 20°С / - 70°С, пока не потребуется Результаты аутопсии приведены в таблице 3, в таблице 4 приведены результаты уничтожения 7 Осадок оттаивают, добавляют лизозим до онкосфер in vitro Значительную степень иммуноконцентрации 0,25мг/мл и инкубируют Юмин при сти на контрольное заражение стимулирует клон комнатной температуре S2 (97%, Р < 0,001, F = 24,04, ІЮГ), клон 48 (83%, 8 Добавляют Тритон Х-100 до концентрации Р = 0,002, F= 16,51, NDD, клон 95 (96%, РG ЙСТ CCG СТС К Т flSA СЛС С 32 набора (Фармация) с применением CsSCI - очиMet « у Val ( i k i c Arg Ч їі№ Gij Thr FtO Leu Arg Lys Ч І Ї щенной плазмидной ДНК и олигонуклетидных праймеров, происходящих рСЕХ последовательности в примерно ЗОп о в восходящем и нисхоTTC JAT TTG KT С:Т GTG GC TCT CSG G C ATT CGC TTA ACT TGG G П' Pfe йзп Leu ї!іґ ?ro Ш Gly Ser Gin Gly He Afg Lej Ser їгр дящем направлении от Eco RI сайта клонирования Олигонуклеотиды приготовлены использованием PCR-MATE391 ДНК синтезатора ізв GAA GTC c « CK T-G T C I ж e r e АЙА да лсд GST Атт тст m -гг « 1 Val І\п P u l « . Ser Asp U » bys GX? Thr A p H e S^r L (Эпплайд Биосистемс, Шостер Сити, КА США) и химикатов фирмы Эпплайд Биосистемс Внутренняя последовательность получена применением 183 Khk GC5 GTG MT CCT TCI GftC CCS ТТЙ GTC TAC SAft АСА С А А 224 прямых и обратных олигонуклеотидных праймеLys Ш Val Й " Pro Set A*p Pea ten Val T/r Ly Ara Cln ров, выявленных из внутренней кДНК(3) Информация для последовательности №3 последовательности (1) Характеристики последовательности Полная последовательность клона 95 и пред(A) Длина 74 аминокислоты сказанная аминокислотная последовательность (B) Тип аминокислота трансляционного белка приведены на Фиг 4 кДНК (C) Топология линейная клона 95 включает вставку в 715п о (не включает (2) Молекулярный тип белок нуклеотиды, появившиеся, как часть стратегии (3) Описание последовательности последоклонирования в AZAP) Данная кДНК содержит вательность №2 открытую рамку считывания в 461 п о , кодирующую предсказанный белок с молекулярной массой I Ьеа Н е Ш Fhe Ala Thr Ser Val к ч аїа Gin Gla Tyr Lys Gly 15 16592Да Следующая ДНК-последовательность вклюIS Hat Gly Val e i o ttr дгд fhr Thr Glu Thr Pro Leu Дгд Lys His 30 чена в полную последовательность клона 95, и ее происхождение определяется стратегией, применяемой при получении кДНК и клонирования в Зі Phe Asn Leti Thr Pro Val Gly Ser Gin Gly lit Дгд Leu Зег тгр 45 7.ZAPXR вектор 1 У5 - конца кДНК 46 Gla Val Gin His Leu Ser Щ Let, Lys Gly Thr Asp Ц s e r Leu 60 5'СААТТССССАССАСЗ1 у 3' - конца кДНК 5'ААААААААААААААААААСТССАСЗ1 Et Lys Ala val a s r ^ r o Ser Asp Pro Leu Val Jyz Lys Arg Gin 74 Последователь с Фиг 4 независимо подтверждена применением методики примера 6 (4) Информация для последовательности №3 ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНИНИЕ (1) Характеристики последовательности Согласно настоящему изобретению дается (A) Длина 715 пар оснований антигенный полипептид, а также активные пеп(B) Тип нуклеиновая кислота тидные фрагменты и варианты такого полипепти(C) Число цепочек одна да, эффективно создающие защитную иммуноло(D) Топология линейная гическую реакцию на инфицирование Е 4Е