Спосіб виявлення трансформанта сої pdab9582.814.19.1

Реферат: Винахід належить до способу визначення трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 методом ПЛР. UA 114481 C2 (12) UA 114481 C2 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Перехресне посилання на споріднену заявку Дана заявка заявляє пріоритет попередньої заявки на патент № 61/511658, поданої 26 липня 2011 р., яка повністю включена в даний опис винаходу як посилання. Рівень техніки Гени, які кодують Cry1F і Cry1Ac synpro (Cry1Ac), здатні надавати трансгенним рослинам стійкості до комах, наприклад, стійкості до лускокрилих комах, і ген, що кодує РАТ (фосфинотрицинацетилтрансферазу), здатний надавати трансгенним рослинам стійкості до гербіциду фосфинотрицину (глуфосинат). РАТ був успішно експресований в сої як селектований маркер при створенні стійких до комах трансгенних сільськогосподарських культур і білка, що надає трансгенним культурам стійкості до гербіциду глуфосинату в промисловому масштабі. Відомо, що на експресію чужорідних генів в рослинах впливає їх локалізація в геномі рослини, ймовірно, внаслідок структури хроматину (наприклад, гетерохроматину) або близькості регулюючих транскрипцію елементів (наприклад, енхансерів) до сайту інтеграції (Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421:477, 1988). У той же час наявність трансгена в інших положеннях в геномі по-різному впливає на загальний фенотип рослини. З вказаної причини часто необхідно дослідити велике число трансформантів, щоб виявити трансформант, який характеризується оптимальною експресією введеного гена. Наприклад, встановлено, що рослини і інші організми можуть характеризуватися широким діапазоном зміни рівнів експресії введеного гена в різних трансформантах. Крім того, можуть мати місце відмінності в просторових або часових паттернах експресії, наприклад, відмінності у відносній експресії трансгена в різних тканинах рослини, які не відповідають паттернам, передбачуваним на основі регулюючих транскрипцію елементів, присутніх в конструкції введеного гена. Тому звичайно отримують сотні і тисячі різних трансформантів, які досліджують з метою виявлення єдиного трансформанта, що характеризується необхідними рівнями експресії трансгена і паттернами, придатними для промислових цілей. Трансформант, який має необхідні рівні або паттерни експресії трансгена, придатний для інтрогресії даного трансгена в інші генетичні середовища в результаті ауткроссингу стандартними методами селекції. Потомство таких гібридів зберігає характеристики експресії трансгена первинного трансформанта. Така методика дозволяє гарантувати надійну експресію гена в цілому ряді сортів, добре адаптованих до місцевих умов зростання. Необхідний метод, який дозволяє виявити наявність конкретного трансформанта і визначити можливість збереження в потомстві гібрида трансгена або групи трансгенів, які представляють інтерес. Крім того, метод виявлення конкретного трансформанта повинен задовольняти вимогам випробування до надходження на ринок і маркування продуктів харчування, які отримуються з рекомбінантних сільськогосподарських культур, наприклад, у випадку контролю за станом навколишнього середовища, контролю ознак сільськогосподарських культур в польових умовах або контролю продуктів, отриманих з сільськогосподарських культур, а також для гарантії відповідності положенням або умовам договору. Трансгенний трансформант можна виявити будь-яким методом виявлення нуклеїнової кислоти, відомим в даній галузі, який включає, не обмежуючись ними, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) або гібридизацію ДНК з використанням зондів до нуклеїнових кислот. Вказані методи виявлення звичайно основані на часто використовуваних генетичних елементах, таких як промотори, термінатори, гени-маркери і т. д., оскільки кодуюча область є взаємозамінною для багатьох конструкцій ДНК. Внаслідок цього такі методи не дозволяють розрізнювати різні трансформанти, зокрема, такі трансформанти, які були отримані при використанні однієї конструкції ДНК або дуже схожих конструкцій, якщо не відома послідовність фланкуючої ДНК, розташовані поруч зі вставленою гетерологічною ДНК. Наприклад, трансформантспецифічний аналіз методом ПЛР описаний в заявці на патент США № 2006/0070139 для трансформанта кукурудзи DAS-59122-7. Необхідний простий і чутливий метод ідентифікації трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. Суть винаходу Даний винахід стосується способу виявлення нового об'єкта трансформації трансгенної сої, стійкої до комах і толерантної до гербіцидів, який був визначений як трансформант сої pDAB9582.814.19.1. Як частина даного винаходу щонайменше 2500насінин лінії сої, які містять трансформант pDAB9582.814.19.1, було депоновано в Американську колекцію типових культур (АТСС) за адресою: 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Вказаний депозит був зареєстрований в АТСС як патентний депозит РОТА-12006 21 липня 2011 р. Даний депозит був 1 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зроблений і буде зберігатися відповідно до умов Будапештського договору про міжнародне визнання депонування насіння для цілей патентної процедури. ДНК рослин сої, які містять даний трансформант, включає з'єднувальні/фланкуючі послідовності, розглянуті в даному описі винаходу, які визначають локалізацію ДНК, введеної в геном сої. Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 можна діагностувати на основі SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2. Зокрема, трансформант сої pDAB9582.814.19.1 можна діагностувати на основі послідовностей, які оточують місця з'єднання в положенні 1400/1401 п. о. і 1536/1537 п. о. SEQ ID NO:1 і 152/153 п. о. SEQ ID NO:2. У нижченаведеному абзаці приведені приклади послідовностей, що включають вказані місця з'єднання, характерні для ДНК сої, що містить трансформант рDAB9582.814.19.1. Даний винахід стосується способу виявлення трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 в зразку, що містить ДНК сої, який включає: (а) приведення вказаного зразка в контакт з першим праймером довжиною щонайменше 10 п. о., який вибірково зв'язується з фланкуючою послідовністю в положенні 1-1400 п. о. SEQ ID NO:1 або її комплементом, і з другим праймером довжиною щонайменше 10 п. о., який вибірково зв'язується з вставковою послідовністю в положенні 1401-1836 п. о. SEQ ID NO:1 або її комплементом; (b) дослідження амплікона, утвореного між вказаними праймерами; або приведення вказаного зразка в контакт з першим праймером довжиною щонайменше 10 п. о., який вибірково зв'язується з вставковою послідовністю в положенні 1-152 п. о. SEQ ID NO:2 або її комплементом, і з другим праймером довжиною щонайменше 10 п. о., який вибірково зв'язується з фланкуючою послідовністю в положенні 153-1550 п. о. SEQ ID NO:2 або її комплементом; і (с) дослідження амплікона, утвореного між вказаними праймерами. Інший варіант здійснення винаходу стосується молекули виділеної ДНК, що дозволяє діагностувати трансформант сої pDAB9582.814.19.1. Такі молекули включають, крім SEQ ID NO:1 і 2, ділянку довжиною щонайменше 25 п. о., що містить 1400-1401 п. о. SEQ ID NO:1, і щонайменше 10 п. о. SEQ ID NO:1 в кожному напрямку від місця з'єднання в положенні 1400/1401 п. о.; амплікони довжиною щонайменше 25 п. о., що містять 152-153 п. о. SEQ ID NO:2, і щонайменше 10 п. о. SEQ ID NO:2 в кожному напрямку від місця з'єднання в положенні 152-153 п. о. Як прикладів можна привести 1385-1415 п. о. SEQ ID NO:1; 1350-1450 п. о. SEQ ID NO:1; 1300-1500 п. о. SEQ ID NO:1; 1200-1600 п. о. SEQ ID NO:1; 137-168 п. о. SEQ ID NO:2; 103-203 п. о. SEQ ID NO:2 і 3-303 п. о. SEQ ID NO:2 і їх комплементи. Даний винахід також стосується аналізів, що дозволяють виявити даний трансформант в зразку (наприклад, в зразку сої). Вказані аналізи можуть бути основані на послідовності ДНК рекомбінантної конструкції, введеної в геном сої, і на геномних послідовностях, фланкуючих інсерційний сайт. У об'єм даного винаходу також входять набори і умови виконання вказаних аналізів. Даний винахід частково стосується клонування і аналізу послідовностей ДНК крайових областей, що утворюються в результаті інсерції Т-ДНК з pDAB9582 в лініях трансгенної сої. Вказані послідовності є унікальними. На основі вставкових і з'єднувальних послідовностей можуть бути створені і були створені трансформантспецифічні праймери. Аналіз методом ПЛР показав, що вказані трансформанти можуть бути ідентифіковані внаслідок аналізу ампліконів ПЛР, створених при використанні наборів трансформантспецифічних праймерів. Таким чином, для ідентифікації ліній сої, що містять трансформант за даним винаходом, можуть бути використані вищезгадані і інші споріднені методи. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO:1 є 5'-кінцевою фланкуючою крайовою послідовністю ДНК трансформанта сої 9582.814.19.1. Нуклеотиди 1-1400 є геномною послідовністю. Нуклеотиди 1401-1535 є реаранжированою послідовністю з pDAB9582. Нуклеотиди 1536-1836 є вставковою послідовністю. SEQ ID NO:2 є 3'-кінцевою фланкуючою крайовою послідовністю ДНК трансформанта сої 9582.814.19.1. Нуклеотиди 1-152 є вставковою послідовністю. Нуклеотиди 153-1550 є геномною послідовністю. SEQ ID NO:3 є послідовністю ДНК з pDAB9582, яка приведена нижче в таблиці 1. SEQ ID NO:4 є олігонуклеотидним праймером 81419_FW3, що використовується для підтвердження 5'-кінцевої крайової геномної ДНК. SEQ ID NO:5 є олігонуклеотидним праймером 81419_RV1, що використовується для підтвердження 3'-кінцевої крайової геномної ДНК. 2 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:6 є олігонуклеотидним праймером 81419_RV2, що використовується для підтвердження 3'-кінцевої крайової геномної ДНК. SEQ ID NO:7 є олігонуклеотидним праймером 81419_RV3, що використовується для підтвердження 3'-кінцевої крайової геномної ДНК. SEQ ID NO:8 є олігонуклеотидним праймером 5'IREnd-01, що використовується для підтвердження 5'-кінцевої крайової геномної ДНК. SEQ ID NO:9 є олігонуклеотидним праймером 5'IREnd-02, що використовується для підтвердження 5'-кінцевої крайової геномної ДНК. SEQ ID NO:10 є олігонуклеотидним праймером AtUbi10RV1, що використовується для підтвердження 5'-кінцевої крайової геномної ДНК. SEQ ID NO:11 є олігонуклеотидним праймером AtUbi10RV2, що використовується для підтвердження 5'-кінцевої крайової геномної ДНК. SEQ ID NO:12 є олігонуклеотидним праймером 3'PATEnd05, що використовується для підтвердження 3'-кінцевої крайової геномної ДНК. SEQ ID NO:13 є олігонуклеотидним праймером 3'PATEnd06, що використовується для підтвердження 3'-кінцевої крайової геномної ДНК. SEQ ID NO:14 є підтвердженою послідовністю трансформанта сої 9582.814.19.1, яка включає 5'-кінцеву геномну фланкуючу послідовність, вставку Т-ланцюга pDAB9582 і 3'-кінцеву геномну фланкуючу послідовність. SEQ ID NO:15 є олігонуклеотидним праймером 81419_3'F, що використовується для виконання аналізу TAQMAN з метою виявлення 3'-кінцевого краю трансформанта сої 9582.814.19.1. SEQ ID NO:16 є олігонуклеотидним праймером 81419_3'R, що використовується для виконання аналізу TAQMAN з метою виявлення 3'-кінцевого краю трансформанта сої 9582.814.19.1. SEQ ID NO:17 є олігонуклеотидним зондом 81419_3'P, що використовується для виконання аналізу TAQMAN з метою виявлення 3'-кінцевого краю трансформанта сої 9582.814.19.1. Вказаний зонд має флуоресцентну частину FAM, додану до 5'-кінця, і гасник MGB, доданий до 3'-кінця. SEQ ID NO:18 є олігонуклеотидним праймером GMS116F, що використовується для виконання аналізу TAQMAN з метою виявлення ендогенного еталонного гена GMFL01-25-J19 (GenBank: A286292.1). SEQ ID NO:19 є олігонуклеотидним праймером GMS116R, що використовується для виконання аналізу TAQMAN з метою виявлення ендогенного еталонного гена GMFL01-25-J19 (GenBank: AK286292.1). SEQ ID NO:20 є олігонуклеотидним зондом GMS116, що використовується для виконання аналізу TAQMAN з метою виявлення ендогенного еталонного гена GMFL01-25-J19 (GenBank: AK286292.1). Вказаний зонд має флуоресцентну частину НЕХ, додану до 5'-кінця, і гасник BHQ, доданий до 3'-кінця. Короткий опис креслень На фіг. 1 зображена плазмідна карта pDAB9582, що містить полігенний експресуючий кластер cry1F, cry1Ac і pat. На фіг. 2 показана локалізація праймерів, які використовуються для підтвердження 5'- і 3'кінцевої крайової послідовності трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. На фіг. 3 показане розташування геномної послідовності в трансформанті сої pDAB9582.814.19.1. На фіг. 4 показана локалізація праймерів і зондів, що використовуються для виконання аналізу TAQMAN трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. Докладний опис винаходу Обидва кінці інсерції трансформанта сої 9582.814.19.1 були секвеновані і досліджені. Були розроблені трансформантспецифічні аналізи. Вказаний трансформант був також картований на хромосомі 02 генома сої. Даний трансформант може бути введений в інші елітні лінії. Як було указано вище в розділі "Рівень техніки", введення і інтеграція трансгена в геном рослини передбачає утворення деяких довільних трансформантів (звідси і назва "трансформант" для даної експресованої інсерції). Тобто при використанні багатьох методів трансформації, таких як трансформація Agrobacterium, біолістична трансформація (тобто генна рушниця) і трансформація, яка опосередковується карбідом кремнію (тобто WHISKERS), неможливо прогнозувати, в яке місце генома буду введений трансген. Тому ідентифікація фланкуючої геномної ДНК рослини з обох сторін вставки може мати важливе значення для ідентифікації рослини, що містить даний інсерційний трансформант. Наприклад, можуть бути 3 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 створені праймери для ПЛР, які утворюють амплікон ПЛР в області з'єднання вставки з геномом хазяя. Такий амплікон ПЛР може бути використаний для ідентифікації унікального або відмінного типу інсерційного трансформанта. У даному описі винаходу приведені визначення термінів і приклади, які сприяють розумінню даного винаходу і допомагають фахівцям в даній галузі здійснити даний винахід на практиці. За винятком особливо обумовлених випадків терміни мають значення, відомі фахівцям в даній галузі. Номенклатура основ ДНК відповідає приведеній в розділі 37 Зводу федеральних правил, §1.822. У використаному тут значенні термін "потомство" означає потомство будь-якого покоління батьківської рослини, що містить трансформант сої pDAB9582.814.19.1. Трансгенний "трансформант" отримують шляхом трансформації рослинних клітин гетерологічною ДНК, тобто конструкцією нуклеїнової кислоти, що включає трансгени, які представляють інтерес, регенерації популяції рослин, отриманої в результаті інсерції вказаного трансгена в геном рослини, і відбору конкретної рослини, що характеризується наявністю інсерції в певному положенні в геномі. Термін "трансформант" стосується первинного трансформанта і потомства вказаного трансформанта, що включає гетерологічну ДНК. Термін "трансформант" також стосується потомства, отриманого в результаті ауткроссингу трансформанта з іншим сортом, що включає геномну/трансгенну ДНК. Навіть після повторного зворотного схрещування з батьківською формою, з якою гібрид схрещується знову, введена трансгенна ДНК і фланкуюча геномна ДНК (геномна/трансгенна ДНК) з трансформованої батьківської форми присутні в потомстві гібрида в тому ж положенні в хромосомі. Термін "трансформант" також стосується ДНК первинного трансформанта і його потомства, що включає введену ДНК і фланкуючу геномну послідовність поруч з введеною ДНК, які повинні бути передані потомству, включаючи транс ген, який представляє інтерес, в результаті схрещування однієї батьківської форми, що включає введену ДНК (наприклад, первинний трансформант і потомство, отримане в результаті самозапилення), з батьківською формою, що не містить введену ДНК. "З'єднувальна послідовність" або "крайова послідовність" заповнює ділянку, на якій ДНК, введена в геном, зв'язується з ДНК нативного генома сої, фланкуючої інсерційну ділянку, при цьому для діагностики трансформанта достатньо ідентифікувати або виявити одну або декілька з'єднувальних послідовностей в генетичному матеріалі рослини. До таких послідовностей належать послідовності ДНК, що заповнюють місця вставки трансформантів сої за даним винаходом, і фланкуючі ДНК однакової довжини. У даному описі винаходу приведені конкретні приклади таких діагностичних послідовностей; однак, інші послідовності, які перекривають місця з'єднання інсерцій або місця з'єднання інсерцій і геномної послідовності, також є діагностичними і можуть бути використані відповідно до даного винаходу. Даний винахід частково стосується ідентифікації таких фланкуючих, з'єднувальних і вставкових послідовностей. У об'єм даного винаходу входять відповідні праймери і амплікони ПЛР. Відповідно до даного винаходу для виявлення або ідентифікації промислових сортів трансгенної сої або ліній, виділених з ліній трансгенної сої, що є приватною власністю, можуть бути використані методи ПЛР із застосуванням ампліконів, розташованих поруч з введеною ДНК і її крайові послідовності. Фланкуючі/з'єднувальні послідовності дозволяють діагностувати трансформант сої pDAB9582.814.19.1. На основі вказаних послідовностей були створені трансформантспецифічні праймери. Аналіз методом ПЛР показав, що вказані лінії сої можна ідентифікувати в різних генотипах сої внаслідок аналізу ампліконів ПЛР, утворених при використанні вказаних наборів трансформантспецифічних праймерів. Таким чином, вищезгадані і інші споріднені методи можуть бути використані для унікальної ідентифікації ліній сої. Послідовності, ідентифіковані в даному описі винаходу, є унікальними. Методи виявлення за даним винаходом особливо корисні в поєднанні з селекцією рослин для визначення потомства рослин, що включає даний трансформант, який був отриманий після схрещування батьківської рослини, що включає трансформант, який представляє інтерес, з іншою лінією рослин з метою надавання вказаному потомству однієї або декількох додаткових ознак. Вказані методи ПЛР дозволяють ефективно розробляти програми селекції сої і контролювати якість, зокрема, промислового насіння трансгенної сої. У цей час також можуть бути створені і використані набори для виявлення методом ПЛР вказаних ліній трансгенної сої. Вказані методи також дозволяють реєструвати і зберігати продукти. Крім того, фланкуючі/геномні послідовності сої можуть бути використані для специфічної ідентифікації положення кожної вставки в геномі. Така інформація може бути використана для створення систем молекулярних маркерів, специфічних до кожного трансформанту. Вказані 4 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовності можуть бути використані для прискореної селекції і отримання даних про зчеплення генів. Інформація про фланкуючі послідовності може бути далі використана для вивчення і дослідження процесів інтеграції трансгенів, визначення сайтів для інтеграції трансгенів в геномі, сортування трансформантів, визначення стійкостітрансгенів і їх фланкуючих послідовностей і експресії генів (особливо відносно сайленсингу генів, паттернів метилування трансгенів, впливу положення і можливих елементів, які визначають експресію, таких як MAR [області приєднання матриці] і тому подібних). У світлі даного опису винаходу повинно бути зрозуміло, що в об'єм даного винаходу входить насіння, депоноване в АТСС під номером, вказаним в абзаці [0005]. Даний винахід також стосується рослини сої, стійкої до гербіцидів, вирощеної з насіння, депонованого в АТСС під номером, вказаним в абзаці [0005]. Даний винахід далі стосується частин вказаної рослини, таких як листя, зразки тканин, насіння, вироблене вказаною рослиною, пилок і тому подібні (які включають cry1F, cry1Ac, par і SEQ ID NO:1 і 2). У використаному тут значенні термін "соя" означає вид Glycine max і включає всі сорти даного виду, які можуть бути отримані шляхом селекції рослини сої. Молекули ДНК за даним винаходом можуть бути використані як молекулярні маркери при здійсненні методу селекції з використанням маркерів (МАВ). Молекули ДНК за даним винаходом (такі як маркери AFLP, маркери RFLP, маркери RAPD, SNP і SSR) можуть бути використані в методах, що дозволяють ідентифікувати генетично зв'язані агрономічно корисні ознаки, відомі в даній галузі. Ознаки стійкості до комах і гербіцидів можуть бути прослідковані в потомстві гібрида рослини сої за даним винаходом (або в її потомстві і в будь-якому іншому культиварі або сорті сої) за допомогою методів МАВ. Молекули ДНК є маркерами даної ознаки, і методи МАВ, добре відомі в даній галузі, можуть бути використані для відстеження ознаки стійкості до гербіцидів в рослинах сої, якщо щонайменше одна лінія сої за даним винаходом або її потомство було батьком або предком. Способи за даним винаходом можуть бути використані для ідентифікації будь-якого сорту сої, що має трансформант за даним винаходом. У використаному тут значенні термін "лінія" означає групу рослин, які характеризуються незначною або відсутністю спадкової мінливості серед особнів відносно щонайменше однієї ознаки. Такі лінії можуть бути створені декількома поколіннями самозапилення і селекції або вегетативного розмноження з однієї родової форми за допомогою методів з використанням культур тканин або клітин. У використаному тут значенні терміни "культивар" і "сорт" є синонімами і означають лінію, яка використовується для промислового виробництва. Термін "стійкість" або "стійкий" застосовно до певного компонента означає збереження даного компонента з покоління в покоління, переважно протягом щонайменше трьох поколінь. Термін "комерційна корисність" означає хорошу потужність рослини і високу фертильність, завдяки яким фермери можуть вирощувати дану сільськогосподарську культуру з використанням звичайних сільськогосподарських машин і можуть екстрагувати з насіння олію з описаними компонентами за допомогою звичайного подрібнюючого і екстрагуючого обладнання. Термін "агрономічно елітна" означає лінію, яка має необхідні агрономічні характеристики, такі як врожайність, дозрівання, стійкість до хвороб і тому подібні, крім стійкості до комах і гербіцидів, завдяки наявності одного або декількох трансформантів за даним винаходом. Будьякі і всі вказані агрономічні характеристики і дані можуть бути використані для ідентифікації таких рослин на основі однієї ознаки, частини діапазону або всього діапазону характеристик, що використовуються для визначення таких рослин. Як повинно бути зрозуміло фахівцеві в даній галузі в світлі даного опису винаходу, переважні варіанти наборів для виявлення ознак за даним винаходом можуть включати, наприклад, зонди і/або праймери, призначені для створення і/або включаючі "з'єднувальні послідовності" або "перехідні послідовності" (де геномна фланкуюча послідовність сої стикується зі вставковою послідовністю). Наприклад, даний набір включає полінуклеотидні зонди, праймери і/або амплікони, створені для ідентифікації однієї або обох з'єднувальних послідовностей (де вставка стикується з фланкуючою послідовністю), представлені в приведеній вище таблиці. Однією спільною особливістю такого набору є наявність одного праймера, який гібридизує у фланкуючій області, і одного праймера, який гібридизує у вставці. Такі праймери часто мають довжину, яка дорівнює щонайменше приблизно ~15 залишкам. Вказані праймери можуть бути використані для створення/ампліфікації амплікона, що виявляється, який вказує на наявність трансформанта за даним винаходом. Праймери можуть 5 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бути використані для створення амплікона, що заповнює (і що включає) вищезгадану з'єднувальну послідовність. Праймер, який "забезпечує з'єднання" в фланкуючій послідовності, звичайно не гібридизує на відстані більше приблизно 1200 основ або за межами з'єднання. Таким чином, типові фланкуючі праймери включають щонайменше 15 залишків ланцюга в межах 1200 основ фланкуючих послідовностей від початку вставки. Тобто в об'єм даного винаходу входять праймери, що включають послідовність відповідної довжини, яка складається з (або гібридизує з) пар основ 800-1400 SEQ ID NO:14 і/або пар основ 13897-14497 SEQ ID NO:14. Праймери для вставки можуть бути створені аналогічним чином в будь-якому місці вставки, але для створення таких праймерів можуть бути також використані пари основ 1400-2000 SEQ ID NO:14 і/або пари основ 13297-13896 SEQ ID NO:14. Фахівцеві в даній галузі повинне бути також відомо, що праймери і зонди можуть бути створені з можливістю гібридизації в стандартних умовах гібридизації і/або ПЛР, коли праймер або зонд не є повністю комплементарними приведеній послідовності. Тобто допустимий деякий ступінь помилкового спарювання. Наприклад, в праймері, який складається приблизно з 20 нуклеотидів, звичайно один, два або близько того нуклеотидів можуть не зв'язуватися з протилежним ланцюгом, якщо помилково спарена основа знаходиться всередині або біля кінця праймера, протилежного амплікону. Нижче приведені різні прийнятні умови гібридизації. У зондах також можуть бути використані синтетичні аналоги нуклеотидів, такі як інозин. Також можуть бути використані пептидні зонди нуклеїнових кислот (PNA), а також ДНК- і РНК-зонди. Важливо, щоб такі зонди і праймери дозволяли діагностувати (однозначно ідентифікувати і виявляти) наявність трансформанта за даним винаходом. Потрібно зазначити, що при ампліфікації методом ПЛР можуть виникати помилки, які викликають, наприклад, незначні помилки секвенування. Тобто, за винятком особливо обумовлених випадків, послідовності, приведені в даному описі винаходу, були визначені внаслідок створення довгих ампліконів з геномних ДНК сої, після чого амплікони клонували і секвенували. У послідовностях, створених і визначених таким чином, цілком ймовірно, можуть бути виявлені невеликі відмінності і незначні розходження, пов'язані з численними циклами ампліфікації, необхідними для створення амплікона достатньої довжини для секвенування з геномних ДНК. Фахівцеві в даній галузі повинно бути зрозуміло, що в об'єм даного винаходу входять будь-які коректування, необхідні в зв'язку з виникненням звичайних помилок секвенування або розходжень вказаних типів. Потрібно також зазначити, що можливе видалення деякої геномної послідовності, наприклад, при введенні послідовності в процесі створення трансформанта. Таким чином, фланкуючі послідовності за даним винаходом можуть дещо відрізнятися від геномних послідовностей, представлених, наприклад, в базі даних GENBANK. Компоненти "вставки" послідовності ДНК показані на фігурах і більш детально розглянуті нижче в розділі "Приклади". Полінуклеотидні послідовності ДНК вказаних компонентів або їх фрагменти можуть бути використані як ДНК-праймери або зонди при здійсненні способів за даним винаходом. Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються способів виявлення трансгена/інсерційної області генома в рослинах, насінні і подібних частинах рослини сої, і композицій для здійснення вказаних способів. Створені послідовності ДНК, що включають 5'-кінцеву з'єднувальну послідовність трансгена/інсерційної області генома за даним винаходом (між 800-1400 парами основ SEQ ID NO:14), їх сегменти, комплементи приведених послідовностей і будь-які їх сегменти. Створені послідовності ДНК, що включають 3'-кінцеву з'єднувальну послідовність трансгена/інсерційної області генома за даним винаходом (між 13897-14497 парами основ SEQ ID NO:14), їх сегменти, комплементи приведених послідовностей і будь-які їх сегменти. З'єднувальна послідовність інсерційної області заповнює місце з'єднання між гетерологічною ДНК, введеною в геном, і ДНК з клітини сої, фланкуючої інсерційний сайт. Такі послідовності дозволяють діагностувати даний трансформант. На основі вказаної вставки і крайових послідовностей можуть бути створені трансформантспецифічні праймери. Аналіз методом ПЛР показав, що лінії сої за даним винаходом можуть бути ідентифіковані в різних генотипах сої шляхом аналізу ампліконів ПЛР, створених за допомогою наборів трансформантспецифічних праймерів. Для ідентифікації ліній сої за даним винаходом можуть бути використані вищезгадані і інші споріднені методи. Таким чином, амплікони ПЛР, отримані з таких пар праймерів, є унікальними і можуть бути використані для ідентифікації вказаних ліній сої. Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються послідовностей ДНК, що включають суміжний фрагмент нового трансгена/інсерційної області генома. У об'єм даного винаходу 6 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 входять послідовності ДНК, що включають полінуклеотиди вставкової послідовності трансгена достатньої довжини і полінуклеотиди геномної послідовності сої достатньої довжини, з однієї або більше ніж з трьох вищезгаданих рослин сої, і/або послідовності, придатні для використання як послідовності праймерів з метою отримання амплікона, що дозволяє діагностувати одну або декілька вказаних рослин сої. Споріднені варіанти здійснення винаходу стосуються послідовностей ДНК, що включають щонайменше 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше суміжним нуклеотидів частини трансгена послідовності ДНК, ідентифікованої в даному описі винаходу (такої як SEQ ID NO:1 і її сегменти), або її комплементів, і фланкуючої послідовності ДНК сої аналогічної довжини з вказаних послідовностей або їх комплементів. Такі послідовності можуть бути використані як ДНК-праймери при здійсненні методів ампліфікації ДНК. Амплікони, отримані з допомогою вказаних праймерів, дозволяють діагностувати будь-які трансформанти сої за даним винаходом. Тому даний винахід також стосується ампліконів, отриманих з допомогою таких ДНК-праймерів і гомологічних праймерів. Даний винахід також стосується способів виявлення в зразку ДНК, що відповідає трансформанту сої за даним винаходом. Такі способи можуть включати: (а) приведення зразка, що включає ДНК, в контакт з набором праймерів, які при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з ДНК щонайменше одного з вказаних трансформантів сої, утворюють амплікон, що дозволяє діагностувати вказаний трансформант; (b) виконання реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з утворенням амплікона; і (с) виявлення отриманого амплікона. Інші способи виявлення за даним винаходом включають спосіб виявлення в зразку ДНК, що відповідає вказаному трансформанту, який включає: (а) приведення зразка, що включає ДНК, в контакт з праймером, який гібридизує в суворих умовах гібридизації з ДНК щонайменше одного з вказаних трансформантів сої і не гібридизує в суворих умовах гібридизації з ДНК контрольної рослини сої (ДНК трансформанта, який не представляє інтерес); (b) гібридизацію зразка і зонда в суворих умовах гібридизації; і (с) виявлення гібридизації зонда з вказаної ДНК. Набори для виявлення ДНК можуть бути створені з використанням композицій за даним винаходом і методів, добре відомих в галузі виявлення ДНК. Вказані набори можуть бути використані для ідентифікації ДНК трансформанта сої за даним винаходом в зразку і в процесі селекції рослин сої, що містять вказану ДНК. Набори включають послідовності ДНК, гомологічні або комплементарні ампліконам, розглянутим в даному описі винаходу, або послідовності ДНК, гомологічні або комплементарні ДНК, що міститься в генетичних елементах трансгена трансформантів за даним винаходом. Вказані послідовності ДНК можуть бути використані при здійсненні реакцій ампліфікації ДНК або як зонди в процесі гібридизації ДНК. Набори можуть також містити реагенти і речовини, необхідні для виконання даного методу виявлення. Термін "зонд" означає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, до якої приєднана стандартна детектована мітка або репортерна молекула (така як радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентна речовина або фермент). Такий зонд є комплементарним ланцюгу нуклеїнової кислоти-мішені у випадку даного винаходу, ланцюгу геномної ДНК одного з вказаних трансформантів сої з рослини сої або зразка, що включає ДНК даного трансформанта. Зонди за даним винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди і інші речовини зонда, які специфічно зв'язуються з послідовністю ДНК-мішені і можуть бути використані для виявлення вказаної послідовності ДНК-мішені. Термін "праймери" означає виділені/синтезовані нуклеїнові кислоти, які гібридизовані з ланцюгом комплементарної ДНК-мішені методом гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібрида між праймером і ланцюгом ДНК-мішені і потім подовжені по ланцюгу ДНК-мішені полімеразою, наприклад, ДНК-полімеразою. Пари праймерів за даним винаходом використовують для ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших стандартних методів ампліфікації нуклеїнових кислот. Зонди і праймери звичайно складаються з 7 UA 114481 C2 5 10 15 20 або або більшого числа полінуклеотидів. Такі зонди і праймери специфічно гібридизують з послідовністю-мішенню в суворих умовах гібридизації. Зонди і праймери за даним винаходом переважно мають повну схожість послідовності з послідовністю-мішенню, хоч стандартними методами можуть бути створені зонди, відмінні від послідовності-мішені, але які зберігають здатність гібридизувати з послідовностями-мішенями. Методи отримання і використання зондів і праймерів описані, наприклад, в публікації Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Пари праймерів для ПЛР можуть бути виділені з відомої послідовності, наприклад, за допомогою комп'ютерних програм, призначених для вказаної мети. Праймери і зонди на основі фланкуючих послідовностей ДНК і вставкових послідовностей за даним винаходом можуть бути використані для підтвердження (і при необхідності для корекції) розглянутих послідовностей стандартними методами, наприклад, методами повторного клонування і секвенування таких послідовностей. Зонди і праймери нуклеїнових кислот за даним винаходом гібридизують в суворих умовах з послідовністю ДНК-мішені. Для ідентифікації ДНК з трансгенного трансформанта в зразку можуть бути використані будь-які стандартні методи гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. Молекули нуклеїнових кислот або їх фрагменти можуть специфічно гібридизувати з іншими молекулами нуклеїнових кислот в певних умовах. Як указано в даному описі винаходу, 8 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дві молекули нуклеїнових кислот можуть специфічно гібридизувати одна з одною, якщо такі молекули здатні утворювати непаралельну дволанцюжкову структуру нуклеїнової кислоти. Вважається, що молекула нуклеїнової кислоти є "комплементом" іншої молекули нуклеїнової кислоти, якщо вказані молекули є повністю комплементарними. Як указано в даному описі винаходу, молекули є "повністю комплементарними", якщо кожний нуклеотид однієї молекули комплементарений нуклеотиду іншої молекули. Дві молекули вважаються "мінімально комплементарними", якщо вказані молекули здатні гібридизувати одна з одною з достатнім ступенем стійкості для збереження гібрида щонайменше в умовах зниженої суворості. Аналогічним чином молекули вважаються "комплементарними", якщо вказані молекули здатні гібридизувати одна з одною з достатнім ступенем стійкості для збереження гібрида в стандартних суворих умовах. Стандартні суворі умови гібридизації описані в публікації Sambrook et al., 1989. Відхилення від повної комплементарності допустимі, якщо такі відхилення повністю не анулюють здатність молекул утворювати дволанцюжкову структуру. Молекула нуклеїнової кислоти, яка може бути використана як праймер або зонд, повинна мати достатньо комплементарну послідовність, здатну утворювати стійку дволанцюжкову структуру при певних концентраціях розчинника і солі. У використаному тут значенні по суті гомологічна послідовність є послідовністю нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизує з комплементом послідовності нуклеїнової кислоти, що порівнюється в суворих умовах гібридизації. Термін "суворі умови" застосовно до гібридизації зонда до нуклеїнової кислоти з нуклеїновою кислотою-мішенню (тобто з конкретною послідовністю нуклеїнової кислоти, яка представляє інтерес) методом специфічної гібридизації описаний в публікації Sambrook et al., 1989, стор. 9.52-9.55. Див. також публікацію Sambrook et al., 1989, стор. 9.47-9.52 і 9.56-9.58. Таким чином, нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути використані завдяки їх здатності вибірково утворювати дуплексні молекули з комплементарними ділянками фрагментів ДНК. Залежно від передбачуваного застосування можна використовувати різні умови гібридизації для досягнення різних ступенів вибірковості зонда відносно послідовності-мішені. Для застосувань, що вимагають високої вибірковості, звичайно використовують відносно суворі умови утворення гібридів, наприклад, можуть бути вибрані умови, що характеризуються відносно низькою концентрацією солі і/або високою температурою, наприклад, що досягаються при використанні від близько 0,02 М до близько 0,15 М NaCl при температурі від близько 50ºC до близько 70ºC. Суворі умови, наприклад, можуть включати щонайменше двократне промивання фільтра для гібридизації суворим промиваючим буфером (0,2-кратний об'єм SSC, 0,1 % SDS, 65 °C). Фахівцям в даній галузі відомі відповідні суворі умови, стимулюючі гібридизацію ДНК, наприклад, 6,0-кратний об'єм хлориду натрію/цитрату натрію (SSC) при температурі близько 45ºC з подальшим промиванням 2,0-кратним об'ємом SSC при 50ºC. Наприклад, концентрація солі на стадії промивання може бути вибрана в діапазоні від умов зниженої суворості, що включають використання приблизно 2,0-кратного об'єму SSC при 50ºC, до суворих умов, що включають використання приблизно 0,2-кратного об'єму SSC при 50ºC. Крім того, температура на стадії промивання може бути підвищена від кімнатної температури, приблизно 22ºC, що створюється в умовах зниженої суворості, до температури близько 65ºC, що застосовується в суворих умовах. Можуть бути змінені як температура, так і концентрація солі, або один з параметрів, температура або концентрація солі, може залишатися постійним при зміні іншого параметра. Такі вибіркові умови допускають незначні, якщо взагалі допускають, помилкові спарювання між зондом і матрицею або ланцюгом-мішенню. Фахівцям в даній галузі добре відомі методи виявлення послідовностей ДНК шляхом гібридизації, і як приклад таких аналізів методом гібридизації можна привести патенти США №№ 4965188 і 5176995.) У особливо переважному варіанті здійснення винаходу нуклеїнова кислота за даним винаходом специфічно гібридизує в суворих умовах з одним або декількома праймерами (ампліконами або іншими послідовностями), приведеними або запропонованими в даному описі винаходу, включаючи їх комплементи і фрагменти. У одному об'єкті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом включає послідовність нуклеїнової кислоти, представлену в одній з приведених послідовностей, її комплементи і/або фрагменти. У іншому об'єкті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом включає послідовність, яка ідентична таким послідовностям нуклеїнових кислот на 80 %-100 % або 90 %-100 %. У ще одному об'єкті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом ідентична такій послідовності на 95 %-100 %. Такі послідовності можуть бути використані як маркери в процесі селекції рослин для ідентифікації потомства генетичних гібридів. Гібридизацію зонда з молекулою ДНК-мішені можна виявити 9 UA 114481 C2 5 10 15 20 різними методами, відомими фахівцям в даній галузі, які включають, не обмежуючись ними, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл і хемілюмінесцентні мітки. У випадку ампліфікації послідовності-мішені нуклеїнової кислоти (наприклад, методом ПЛР) з використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації "суворі умови" являють собою умови, в яких вказана пара праймерів гібридизує тільки з послідовністю-мішенню нуклеїнової кислоти, з якою праймер, що має відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент), повинен зв'язуватися і переважно продукувати унікальний продукт ампліфікації, амплікон. Термін "специфічний до (послідовності-мішені)" означає, що зонд або праймер гібридизує в суворих умовах гібридизації тільки з послідовністю-мішенню в зразку, що включає таку послідовність-мішень. У використаному тут значенні термін "ампліфікована ДНК" або "амплікон" означає продукт ампліфікації нуклеїнової кислоти послідовності-мішені нуклеїнової кислоти, що є частиною матриці нуклеїнової кислоти. Наприклад, для визначення наявності в рослині сої, отриманій в результаті статевого схрещування, геномної ДНК трансгенного трансформанта з рослини сої за даним винаходом, ДНК, екстрагована із зразка тканини рослини сої, може бути піддана ампліфікації нуклеїнової кислоти з використанням пари праймерів, з яких один праймер виділений з фланкуючої послідовності, локалізованої в геномі рослини поруч з інсерційним сайтом вставленої гетерологічної ДНК, і другий праймер виділений з вставленої гетерологічної ДНК, для продукування амплікона, що дозволяє діагностувати наявність ДНК трансформанта. Трансформант також можна діагностувати на основі довжини і послідовності амплікона. Довжина амплікона може дорівнювати загальній довжині пар праймерів і однієї пари нуклеотидних основ і/або загальній довжині пар праймерів і приблизно 10 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 або більшому числу пар нуклеотидних основ (плюс або мінус будь-яке число вищезгаданих приростів). Альтернативно пара праймерів може бути виділена з фланкуючої послідовності з обох сторін вставленої ДНК з утворенням амплікона, що включає всю нуклеотидну послідовність вставки. Один член пари праймерів, виділеної з геномної послідовності рослини, може бути розташований на відстані від вставленої послідовності ДНК. Вказана відстань може становити від однієї пари нуклеотидних основ приблизно до двадцяти тисяч пар нуклеотидних основ. У визначення терміну "амплікон" входять димери праймерів, які можуть бути утворені при виконанні термічної реакції ампліфікації ДНК. Нуклеїнова кислота може бути ампліфікована різними методами ампліфікації нуклеїнових кислот, відомими в даній галузі, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). У даній галузі відомі різні методи ампліфікації, які описані, нарівні з іншими публікаціями, в патенті США № 4683195 і патенті США № 4683202. Методами ПЛР можна ампліфікувати до 22 т.п.о. геномної ДНК. При здійсненні даного винаходу можуть бути використані вказані методи, а також інші методи ампліфікації ДНК, відомі в даній галузі. Послідовність ДНК-вставки або фланкуючої геномної послідовності гетерологічного трансгена з трансформанта сої за даним винаходом може бути перевірена (і при необхідності скоригована) шляхом ампліфікації таких послідовностей трансформанта за допомогою праймерів, виділених з послідовностей за даним винаходом, стандартними методами секвенування ДНК амплікона ПЛР або клонованої ДНК. Амплікон, отриманий вказаними методами, може бути виявлений різними методами. Електрофорез в агарозному гелі і фарбування бромідом етидію є загальноприйнятим, добре відомим методом виявлення ампліконів ДНК. Іншим таким методом є генетичний двійковий аналіз з використанням олігонуклеотиду ДНК, що перекриває суміжну фланкуючу геномну послідовність ДНК і вставлену послідовність ДНК. Вказаний олігонуклеотид іммобілізують в ямках мікропланшета. Після ПЛР області, яка представляє інтерес (з використанням одного праймера у вставленій послідовності і одного праймера в суміжній фланкуючій геномній послідовності), одноланцюжковий продукт ПЛР може бути гібридизований з іммобілізованим олігонуклеотидом і використаний як матриця для виконання реакції подовження на одну основу з використанням ДНК-полімерази і міченими ddNTР, специфічними до передбачуваної наступної основи. Зчитування може бути зроблене за допомогою флуоресцентного аналізу або ELISA. Сигнал вказує на наявність вставки/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу. Іншим методом є метод піросеквенування, описаний в публікації Winge, Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000. При виконанні вказаного методу створюють олігонуклеотид, який перекриває місце з'єднання суміжної геномної ДНК і вставлену ДНК. Олігонуклеотид гібридизують з одноланцюжковим продуктом ПЛР з області, яка представляє інтерес (один праймер у вставленій послідовності і однин праймер у фланкуючій геномній послідовності), і інкубують в присутності ДНК-полімерази, АТР, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5'фосфосульфату і люциферину. Окремо додають DNTP, в результаті чого виникає світловий сигнал, який вимірюють. Світловий сигнал свідчить про наявність вставки/фланкуючої послідовності трансгена внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну або декілька основ. Поляризація флуоресценції є ще одним методом, який може бути використаний для виявлення амплікона за даним винаходом. Відповідно до даного методу створюють олігонуклеотид, який перекриває місце з'єднання геномної фланкуючої послідовності і вставленої ДНК. Олігонуклеотид гібридизують з одноланцюжковим продуктом ПЛР з області, яка представляє інтерес (один праймер у вставленій ДНК і один праймер у фланкуючій геномній послідовності ДНК) і інкубують в присутності ДНК-полімерази і міченого флуоресцентним барвником ddNTP. Подовження на одну основу спричиняє включення ddNTP. Таке включення можна виміряти у вигляді зміни поляризації за допомогою флуорометра. Зміна поляризації 11 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 свідчить про наявність вставки/фланкуючої послідовності трансгена внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу. TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) є методом виявлення і кількісного визначення наявності послідовності ДНК. У короткому викладі даний метод включає створення олігонуклеотидного зонда FRET, який перекриває місце з'єднання геномної фланкуючої і вставкової ДНК. Зонд FRET і праймери для ПЛР (один праймер в послідовності вставкової ДНК і однин праймер у фланкуючій геномній послідовності) піддають циклічній обробці в присутності термостійкої полімерази і dNTP. У процесі специфічної ампліфікації taq полімераза ДНК відщеплюється і вивільняє флуоресцентну частину з гасильної частини зонда FRET. Флуоресцентний сигнал свідчить про наявність фланкуючої/вставкової послідовності трансгена внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації. Для виявлення послідовності був запропонований метод молекулярних маяків. У короткому викладі даний метод включає створення олігонуклеотидного зонда FRET, який перекриває місце з'єднання фланкуючої геномної і вставкової ДНК. Унікальна структура зонда FRET дозволяє отримати вторинну структуру, що містить флуоресцентну і гасильну частини в безпосередній близькості одну від одної. Зонд FRET і праймери для ПЛР (один праймер в послідовності вставкової ДНК і один праймер у фланкуючій геномній послідовності) піддають циклічній обробці в присутності термостійкої полімерази і dNTP. Після успішної ампліфікації методом ПЛР гібридизація зонда FRET з послідовністю-мішенню спричиняє видалення вторинної структури зонда і просторове відділення флуоресцентної і гасильної частин. Виникає флуоресцентний сигнал. Флуоресцентний сигнал свідчить про наявність фланкуючої геномної/вставкової послідовності трансгена внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації. Крім розглянутого положення в геномі сої, яке є найбільш прийнятним для інсерції, даний винахід також стосується насіння сої і/або рослини сої, що включає щонайменше одну вставку, відмінну від трансформанта сої 9582.814.19.1, в безпосередній близькості від даного положення в геномі. Один варіант здійснення винаходу стосується заміни трансформанта pDAB9582.814.19.1, розглянутого в даному описі винаходу, іншою вставкою. Для вказаної мети може бути використана, наприклад, направлена гомологічна рекомбінація. Даний метод описаний, наприклад, у WO 03/080809 A2 і відповідній опублікованій заявці на патент США (US 20030232410). Таким чином, даний винахід стосується рослин і рослинних клітин, що включають гетерологічну вставку (замість або разом з декількома копіями генів cry1F, cry1Ac або pat), фланковану повними фланкуючими послідовностями або пізнаваними частинами фланкуючих послідовностей за даним винаходом (пари основ 1-1400 SEQ ID NO:1 і пари основ 153-1550 SEQ ID NO:2). Подібним чином може бути використана для вставки додаткова копія (або додаткові копії) генів cry1F, cry1Ac або pat. Всі патенти, заявки на патент, попередні заявки і публікації, приведені в даному винаході, повністю включені в даний опис винаходу як посилання в тій мірі, в якій вони відповідають положенням даного винаходу. Приведені нижче приклади ілюструють способи здійснення винаходу і демонструють певні переважні варіанти здійснення винаходу. Вказані приклади не обмежують об'єм винаходу. Фахівцям в даній галузі повинно бути зрозуміло, що методи, описані в нижченаведених прикладах, представляють певні підходи, які використовуються для ілюстрації переважних варіантів здійснення винаходу. Однак фахівцям в даній галузі повинно бути зрозуміло в світлі даного опису винаходу, що в конкретні варіанти здійснення винаходу можуть бути внесені багато змін, що дозволяють отримати аналогічні або подібні результати, не виходячи за межі суті і об'єму винаходу. За винятком особливо обумовлених випадків всі проценти є масовими процентами і співвідношення сумішей розчинників є об'ємними співвідношеннями. За винятком особливо обумовлених випадків в даному описі винаходу використані наступні абревіатури. 50 п. о. ºC ДНК EDTA т.п.о. мкг мкл мл М ПЛР пара основ градуси по шкалі Цельсія дезоксирибонуклеїнова кислота етилендіамінтетраоцтова кислота тисяча пар основ мікрограм мікролітр мілілітр молярна маса полімеразна ланцюгова реакція 12 UA 114481 C2 PTU SDS SSC ТВЕ 5 10 15 20 транскрипційна одиниця рослини додецилсульфат натрію буферний розчин, що містить суміш хлориду натрію і цитрату натрію, рН 7,0 буферний розчин, що містить суміш тріс-буфера з основою, борної кислоти і EDTA, рН 8,3 Варіанти здійснення даного винаходу представлені в наступних прикладах. Потрібно зазначити, що вказані приклади приведені тільки з метою ілюстрації. На основі приведеного вище опису винаходу і прикладів фахівець в даній галузі може ознайомитися з основними характеристиками даного винаходу і, не виходячи за межі суті і об'єму винаходу, внести різні зміни і модифікації у варіанти здійснення винаходу, що дозволяють адаптувати винахід до різних застосувань і умов реалізації. Таким чином, фахівцям в даній галузі, крім вищеописаних варіантів здійснення винаходу, повинні бути очевидні багато інших модифікацій варіантів здійснення винаходу. Такі модифікації також входять в об'єм прикладеної формули винаходу. Всі публікації, приведені в даному винаході, повністю включені в даний опис винаходу як посилання. Приклади Приклад 1. Трансформація і відбір трансформанта сої pDAB9582.814.19.1, що включає Cry1F і Cry1Ac Трансгенна соя (Glycine max), що містить трансформант pDAB9582.814.19.1, була створена в результаті опосередкованої Agrobacterium трансформації експлантатів сім'ядольного вузла сої. Для ініціації трансформації був використаний штам Agrobacterium EHA101 без плеча хромосоми (Hood et al., 1993), який містить подвійний вектор pDAB9582 (фіг. 1) з селектованим маркером pat v6 і генами cry1F v3 і cry1Ac, які представляють інтерес, в області Т-ланцюга ДНК. Послідовність ДНК для вектора pDAB9582 приведена в SEQ ID NO:3, яка представлена в таблиці 1. Таблиця 1 Елементи генів, локалізовані у векторі pDAB9582 Пари основ (SEQ ID NO:3) 272-1593 1602-5048 5151-5607 5671-6187 6197-9667 9701-10157 10272-10788 10796-11347 11450-12153 25 30 35 40 Елемент конструкції Промотор AtUbi10 Cry1F 3' UTR ORF23 Промотор CsVMV Cry 1Ac 3' UTR ORF23 Промотор CsVMV PAT 3' UTR ORF1 Посилання Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493 Вищезгадане посилання Патент США № 5428147 Verdaguer et al., (1996) Plant. Mol. Biol., 31: 1129-1139 Вищезгадане посилання Патент США № 5428147 Verdaguer et al., (1996) Plant Mol. Biol., 31: 1129-1139 Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37 Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 172: 1814-1822 Опосередкована Agrobacterium трансформація була виконана за допомогою модифікованого методу, описаного в публікації Zeng et al. (2004). Насіння сої (сорти Maverick) пророщували на базальному середовищі, сім'ядольні вузли видаляли і інфікували Agrobacterium. У середовище для утворення паростків, росту паростків і вкорінення додавали цефотаксим, тиментин і ванкоміцин для видалення Agrobacterium. Для інгібування росту нетрансформованих паростків використовували глуфосинат. Відібрані паростки переносили в середовище для вкорінення, що забезпечує розвиток кореневої системи, і потім переносили в ґрунтову суміш для акліматизації паростків. Верхівкове листя відібраних паростків забарвлювали глуфосинатом для скринінгу передбачуваних трансформантів. Досліджені паростки переносили в теплицю, залишали для акліматизації і забарвлювали листя глуфосинатом для підтвердження стійкості і виявлення передбачуваних трарнсформантів. Відбирали зразки досліджених рослин і виконували молекулярні аналізи для підтвердження наявності гена селектованого маркера і/або гена, який представляє інтерес. Рослини Т 0 залишали в теплиці для самозапилення, в результаті чого було отримане насіння Т1. Трансформант сої pDAВ9582.814.19.1 був отриманий з незалежного трансформованого ізоляту. Рослини Т1 піддавали зворотному схрещуванню і використовували для інтрогресії в елітні сорти в подальших поколіннях. Даний трансформант був відібраний на основі унікальних 13 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 характеристик, таких як один інсерційний сайт, нормальне менделевське розщеплення, стійка експресія і чудова комбінація ефективності, що включає стійкість до гербіцидів і агрономічну продуктивність. У нижченаведених прикладах представлені дані, які були використані для дослідження трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. Приклад 2. Дослідження експресії білка в трансформанті сої pDAB9582.814.19.1 Були досліджені біохімічні властивості рекомбінантних білків Cry1F, Cry1Ac і PAT, експресованих в трансформантах сої 9582.814.19.1. Кількісний твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) є біохімічним аналізом, відомим в даній галузі, який може бути використаний для дослідження біохімічних властивостей білків і підтвердження експресії вказаних білків в трансформанті сої 9582.814.19.1. Приклад 2.1. Експресія білків РАТ, Cry1F і Crey1Ac в тканинах рослин З досліджуваних рослин виділяли зразки тканин сої, які використовували при виконанні аналізу експресії. Білок РАТ був екстрагований з тканин рослини сої за допомогою фізіологічного розчину з фосфатним буфером, який містив детергент твін-20 (PBST), що включає 0,5 % бичачого сироваткового альбуміну (BSA). Тканину рослини центрифугували; водний супернатант збирали, при необхідності розбавляли відповідним буфером і аналізували за допомогою набору ELISA для білка РАТ у вигляді сендвіча. Вказаний набір був використаний відповідно до протоколу, запропонованого виробником (Envirologix, Portland, ME). В результаті виконання даного аналізу був виміряний вміст експресованого білка РАТ. Білок Cry1F був екстрагований з тканин рослини сої за допомогою фізіологічного розчину з фосфатним буфером, який містив детергент твін-20 (PBST). Тканину рослини центрифугували; водний супернатант збирали, при необхідності розбавляли відповідним буфером і аналізували за допомогою набору ELISA для білка Cry1F у вигляді сендвіча. Вказаний набір був використаний відповідно до протоколу, запропонованого виробником (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). В результаті виконання даного аналізу був виміряний вміст експресованого білка Cry1F. Білок Cry1Ac був екстрагований з тканин рослини сої за допомогою фізіологічного розчину з фосфатним буфером, який містив детергент твін-20 (PBST), що включає 0,5 % бичачого сироваткового альбуміну (BSA). Тканину рослини центрифугували; водний супернатант збирали, при необхідності розбавляли відповідним буфером і аналізували за допомогою набору ELISA для білка Cry1Ac у вигляді сендвіча. Вказаний набір був використаний відповідно до протоколу, запропонованого виробником (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). В результаті виконання даного аналізу був виміряний вміст експресованого білка Cry1Ac. Детектуючий аналіз виконували для дослідження стійкості експресії і успадковуваності трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 як по вертикалі (між поколіннями), так і по горизонталі (між лініями в одному поколінні). Приклад 2.2. Експресія білків Cry1F, Cry1Ac і Pat в тканинах рослин У трансформанті сої 9582.814.19.1 були визначені рівні білків Cry1F, Cry1Ac і РАТ. Розчинні білки, що екстрагуються, виділені з тканини листа сої, вимірювали за допомогою кількісного твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). У поколіннях з Т2 до Т6 експресія трансформанта 9582.814.19.1 була стійкою (без розщеплення) і порівнянною у всіх лініях. У таблиці 2 приведений середній рівень експресії трансгенних білків в трансформанті сої 9582.814.19.1. Таблиця 2 Середній рівень експресії різних трансгенних білків в трансформанті сої pDAB9582.814.19.1 2 Рівень експресії різних білків (нг/см ) Трансформант Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 Cry1F 133 Cry1Ac 17,4 PAT 12 45 50 Приклад 3. Клонування і дослідження послідовності ДНК у вставці і фланкуючих крайових областях трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 Для дослідження і опису інсерційного сайту геномної ДНК була визначена послідовність фланкуючих крайових областей геномної Т-ДНК трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. Було встановлено, що геномна послідовність трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 містить 1400 п. о. 5'-кінцевої фланкуючої крайової послідовності (SEQ ID NO:1) і 1398 п. о. 3'-кінцевої фланкуючої крайової послідовності (SEQ ID NO:2). Ампліфікація методом ПЛР на основі крайових послідовностей трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 показала, що крайові області 14 UA 114481 C2 5 10 належать сої і з'єднувальні області являють собою унікальні послідовності трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. З'єднувальні області можуть бути використані для трансформантспецифічної ідентифікації трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. Також був досліджений інсерційний сайт Т-ланцюга шляхом ампліфікації геномного фрагмента, відповідного області ідентифікованих фланкуючих крайових послідовностей з генома нетрансформованої сої. Порівняння трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 з нетрансформованою геномною послідовністю показало, що в процесі інтеграції Т-ланцюга з вихідного локусу було видалено приблизно 57 п. о. Дослідження вставки і крайової послідовності трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 показало, що в геномі сої присутня інтактна копія Т-ланцюга з pDAB9582. Таблиця 3 Список праймерів і їх послідовностей, використаних для підтвердження геномної ДНК сої в трансформанті pDAB9582.814.19.1 SEQ ID Назва NO: праймера Розмір (п. о.) SEQ ID 81419_FW3 NO:4 30 SEQ ID 81419_RV1 NO:5 27 SEQ ID 81419_RV2 NO:6 24 SEQ ID 81419_RV3 NO:7 24 SEQ ID 5'IREnd-01 NO:8 29 SEQ ID 5'IREnd-02 NO:9 30 SEQ ID AtUbi10RV1 NO:10 29 SEQ ID AtUbi10RV2 NO:11 28 SEQ ID 3'PATEnd05 NO:12 20 SEQ ID 3'PATEnd06 NO:13 20 Послідовність (від 5' до 3') Мета підтвердження 5' крайової геномної ДНК з використанням TTTCTCCTATCCGTCAAA AtUbi10RV1 або RV2; 5'IREnd-01 або 5'IREnd-02 підтвердження 3' крайової GGGTGATTTGGTGCCAAAAGTT геномної ДНК з використанням ATGTT 3'PATEnd05 або 3'PATEnd06 підтвердження 3' крайової TGGAGGGTCATATCGCAAAAGA геномної ДНК з використанням CT 3'PATEnd05 або 3'PATEnd06 підтвердження 3' крайової GTTCTGCGTCGTGGAGGGTCAT геномної ДНК з використанням AT 3'PATEnd05 або 3'PATEnd06 підтвердження 5' крайової CGAGCTTTCTAATTTCAAACTAT геномної ДНК з використанням TCGGGC 81419_FW3 підтвердження 5' крайової TCCTAGATCATCAGTTCATACAA геномної ДНК з використанням ACCTCCA 81419_FW3 підтвердження 5' крайової CGGTCCTAGATCATCAGTTCATA геномної ДНК з використанням CAAACC 81419_FW3 підтвердження 5' крайової CACTCGTGTTCAGTCCAATGAC геномної ДНК з використанням CAATAA 81419_FW3 підтвердження 3' крайової GCTCCTCCAAGGCCAGTTAG геномної ДНК з використанням 81419_RV1, RV2 або RV3 підтвердження 3' крайової CCAGTTAGGCCAGTTACCCA геномної ДНК з використанням 81419_RV1, RV2 або RV3 15 UA 114481 C2 Таблиця 4 Умови ампліфікації стандартним методом ПЛР крайових областей і трансформантспецифічних послідовностей трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 Послідовністьмішень Набір праймерів 5' крайова 81419_FW3/AtUbi10RV1 5' крайова 81419_FW3/5'IREnd-01 3' крайова 3'PATEnd05/81419_RV2 3' крайова 3'PATEnd05/81419_RV3 3' крайова 3'PATEnd06/81419_RV2 3' крайова 3'PATEnd06/81419_RV3 Локус вставки 81419_FW3/81419_RV3 Попередня ДенатуСуміш денатурація для ПЛР рація (°C/сек.) (°C/хв.) D 95/3 98/10 32 цикли D 95/3 98/10 32 цикли D 95/3 98/10 35 циклів D 95/3 98/10 35 циклів D 95/3 98/10 35 циклів D 95/3 98/10 32 цикли D 95/3 98/10 32 цикли ПодовКінцеве ження подовження (°C/хв.:сек.) (°C/хв.) 68/4:00 71/10 68/4:00 72/10 68/4:00 72/10 68/4:00 72/10 68/4:00 72/10 68/4:00 72/10 68/4:00 72/10 Таблиця 5 Суміш для ПЛР, призначена для ампліфікації стандартним методом ПЛР крайових областей і трансформантспецифічних послідовностей в трансформанті сої pDAB9582.814.19.1 Суміш А для ПЛР Суміш В для ПЛР 1-кратна реакційна 1-кратна реакційна Реагент Реагент суміш (мкл) суміш (мкл) Н2О 0,8 Н2О 14,6 10-кратний буфер LA суперсуміш ACCPRIME PFX 20 2 TAQ MgCl2 (25 мМ) 0,6 dNTP (2,5 мкМ) 1,6 праймер 10 мкМ 0,2 праймер 10 мкМ 0,1 фермент, що фермент, що розщеплює гДНК 1 1 розщеплює гДНК LA Taq (50 од./мкл) 0,1 загальний об'єм: 22 загальний об'єм: 20 Суміш С для ПЛР Суміш D для ПЛР 1-кратна реакційна 1-кратна реакційна Реагент Реагент суміш (мкл) суміш (мкл) Н2О 28 Н2О 11,6 10-кратний буфер II для ПЛР 10-кратний буфер II 5 2 (з магнієм) для ПЛР (з магнієм) MgCl2 (25 мМ) 1,5 MgCl2 (25 мМ) 0,6 dNTP (2,5 мМ) 8 dNTP (2,5 мМ) 3,2 адапторний праймер для ПЛР 1 праймер 1 (10 мкМ) 0,4 (10 мкМ) Вкладений праймер GOI (10 1 праймер 2 (10 мкМ) 0,4 мкМ) ДНК-зв'язані гранули 5 матриця ДНК 0,2 La Taq (5 од./мкл) 0,5 La Taq (5 од./мкл) 1,6 загальний об'єм: 50 загальний об'єм: 20 16 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклад 3.1. Підтвердження геномних послідовностей сої 5'- і 3'-фланкуючі крайові послідовності порівнювали з повною непроцесованою геномною послідовністю Glycine max з хромосоми 02, в результаті чого було встановлено, що трансген трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 вставлений в хромосому 02 генома сої. Для підтвердження інсерційного сайта трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 в геномі сої була виконана ПЛР з використанням різних пар праймерів (фіг. 2, таблиця 3, таблиця 4 і таблиця 5). Геномна ДНК з трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 і інших трансгенних або нетрансгенних ліній сої була використана як матриця. Для підтвердження правильності 5'-кінцевих крайових послідовностей був створений праймер, що зв'язується з генним елементом промотору AtUbi10, таким як, наприклад, AtUbi10RV1, і праймер, що зв'язується з клонованою 5'-кінцевою крайовою послідовністю в хромосомі 02 генома сої, що визначається як 81419_FW3, які були використані для ампліфікації сегмента ДНК в положенні від генного елемента промотора AtUbi10 до 5'кінцевої крайової послідовності. Аналогічним чином для підтвердження клонованої 3'-кінцевої крайової послідовності був створений специфічний праймер pat, наприклад, 3' PATEnd05, і три праймери, які відповідають клонованій 3'-кінцевій крайовій послідовності, що визначаються як 81419_RV1, 81419_RV2 і 81419_RV3, які були використані для ампліфікації сегментів ДНК від гена pat до 3'-кінцевої крайової послідовності. Фрагменти ДНК передбачуваного розміру були ампліфікували тільки з геномної ДНК трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 при використанні кожної пари праймерів і не були ампліфіковані із зразків ДНК інших ліній трансгенної сої або нетрансгенного контрольного зразка. Отримані результати показують, що клоновані 5'- і 3'кінцеві крайові послідовності є фланкуючими крайовими послідовностями вставки трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 в Т-ланцюгу. Для подальшого підтвердження інсерції ДНК в геном сої методом ПЛР ампліфікували крайові послідовності сої в геномній ДНК, в яких була відсутня вставка трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 в Т-ланцюгу. Для ампліфікації сегментів ДНК, що містять локус з вбудованим Т-ланцюгом pDAB9582, був створений праймер 81419_FW3, що відповідає 5'кінцевій крайовій послідовності, і один праймер 81419-RV3, призначений для 3'-кінцевої крайової послідовності. Як і очікувалося, в результаті ампліфікації методом ПЛР пари праймерів 81419_FW3 і 81419_RV3 дозволили отримати фрагмент ДНК довжиною приблизно 1,5 т.п.о. у всіх інших контрольних лініях сої за винятком pDAB9582.814.19.1. Порівняння ідентифікованих 5'- і 3'-кінцевих крайових послідовностей трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 з повною непроцесованою геномною послідовністю Glycine max з хромосоми 02 виявило делецію з вихідного локусу приблизно 57 п. о. (фіг. 3). Отримані результати показали, що трансген трансформанта сої pDAB8294 був введений в сайт хромосоми 02 генома сої. Приклад 4. Дослідження трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 методом саузерн-блоттингу Аналіз методом саузерн-блоттингу був виконаний для визначення паттерна інтеграції трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. В результаті виконаних експериментів були отримані дані, що свідчать про інтеграцію і цілісність трансгенів cry1Ac і cry1F в геномі сої. Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 являв собою повний, простий інтеграційний трансформант, що містить одну копію РTU cry1Ac і cry1F з плазміди pDAB9582. Дані, отримані в результаті виконання саузерн-блоттингу, показали, що в геном трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 був введений фрагмент Т-ланцюга. Детальний аналіз методом саузерн-блоттингу був виконаний з використанням зондів, специфічних до генів cry1Ac і cry1F, що знаходилися в області інтеграції трансформанта pDAB9582.814.19.1 в Т-ланцюгу, і дескриптивних рестрикційних ферментів, які мають сайти розщеплення в плазміді і продукують гібридизуючі фрагменти всередині плазміди або фрагменти, що заповнюють місце з'єднання плазміди з геномною ДНК сої (крайові фрагменти). Молекулярна маса, встановлена в результаті гібридизації методом саузерн-блоттингу для комбінації рестрикційного ферменту і зонда, була унікальною для даного трансформанта і визначала його ідентифікуючі паттерни. Вказані аналізи також показали, що фрагмент плазміди був введений в геномну ДНК сої без реаранжирування PТU cry1Ac і cry1F. Приклад 4.1. Отримання зразка листя сої і виділення геномної ДНК (гДНК) Геномну ДНК екстрагували з тканини листя окремих рослин сої, які містять трансформант pDAB9582.814.19.1. Крім того, гДНК була виділена зі стандартної рослини сої сорту Maverick, генетичний фон якого типовий для даної лінії з відсутністю генів cry1Ac і cry1F. Геномну ДНК екстрагували з ліофілізованої тканини листя стандартним методом СТАВ (Sambrook et al. (1989)). Екстраговану ДНК піддавали кількісному спектрофлуорометричному аналізу, використовуючи реагент Pico Green (Invitrogen, Carlsbad, CA). Потім ДНК візуалізували на 17 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 агарозному гелі для підтвердження результатів аналізу з використанням реагенту Pico Green і визначення якості ДНК. Приклад 4.2. Розщеплення і виділення ДНК Для молекулярного дослідження трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 методом саузернблоттингу розщеплювали десять мікрограмів (10 мкг) геномної ДНК. Геномну ДНК з трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 і лінії нетрансгенної сої сорту Mavеrick розщеплювали, додаючи до кожного зразка ДНК приблизно п'ять одиниць вибраного рестрикційного ферменту на один мкг ДНК і відповідний реакційний буфер. Кожний зразок інкубували протягом ночі приблизно при 37ºC. Для окремих розщеплень використовували рестрикційні ферменти AseI, HindIII, NsiI і NdeI (New England Biolabs, Ipswich, MA). Для подвійного розщеплення одночасно використовували рестрикційні ферменти NotI і ApaL1 (New Englsnd Biolabs, Ipswich, MA). Крім того, був отриманий позитивний контрольний гібридизований зразок шляхом об'єднання плазмідної ДНК, pDAB9582, з геномної ДНК нетрансгенної сої сорту Maverick. Суміш плазмідної ДНК/геномної ДНК розщеплювали такими ж методами з використанням такого ж рестрикційного ферменту, що і експериментальні зразки. Розщеплену ДНК інкубували протягом ночі, додавали 25 мкл розчину QUICK-PRECIP PLUS (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD), після чого зразки розщепленої ДНК осаджували ізопропанолом. Осаджену ДНК ресуспендували в 15 мкл 1-кратного заповнюючого буфера (0,01 % бромфенолового синього, 10,0 мМ EDTA, 10,0 % гліцерину, 1,0 мМ тріс-буфера, рН 7,5). Зразки ДНК і маркери молекулярної маси піддавали електрофорезу в 0,85 % агарозному гелі, використовуючи 0,4-кратний буфер ТАЕ (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), під напругою 35 вольт протягом приблизно 18-22 годин для відділення фрагмента. Гелі забарвлювали бромідом етидію (Invitrogen, Carlsbad, CA) і ДНК візуалізували в ультрафіолетовому (УФ) світлі. Приклад 4.3. Перенесення методом саузерн-блоттингу і обробка мембрани Аналіз методом саузерн-блоттингу виконували відповідно до опису, приведеного в публікації Memelink, et al. (1994). Після відділення методом електрофорезу і візуалізації фрагментів ДНК гели депуринізували 0,25 М HCl протягом приблизно 20 хвилин, занурювали в денатуруючий розчин (0,4 М NaOH, 1,5 М NaCl) приблизно на 30 хвилин і потім переносили в нейтралізуючий розчин (1,5 М NaCl, 0,5 М тріс-буфера, рН 7,5) щонайменше на 30 хвилин. Перенесення методом сайзерн-блоттингу на нейлонові мембрани виконували протягом ночі, використовуючи систему тампонів з 10-кратним розчином SSC. Перенесену ДНК зв'язували з мембраною шляхом перехресного зв'язування під впливом УФ-світла, після чого мембрану швидко промивали 2-кратним розчином SSC. В результаті виконання саузерн-блоттингу були отримані мембрани, готові для гібридизації. Приклад 4.4. Мічення ДНК-зонда і гібридизація Фрагменти ДНК, зв'язані з нейлоновою мембраною, виявляли за допомогою міченого зонда (таблиця 6). Зонди були отримані в результаті включення методом ПЛР нуклеотиду, міченого дигоксигеніном (DIG), [DIG-11]-dUTP, у фрагмент ДНК, ампліфікований з плазміди pDAB9582 за допомогою праймерів, специфічних до генних елементів. ДНК-зонди були створені шляхом синтезу методом ПЛР з використанням набору для синтезу DIG-мічених зондів методом ПЛР (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) відповідно до рекомендацій виробника. Мічені зонди аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі для визначення їх якості і кількості. Потім необхідну кількість міченого зонда використовували для гібридизації з ДНК-мішенню на нейлонових мембранах з метою виявлення конкретних фрагментів методами, описаними для розчину, призначеного для простої гібридизації за допомогою DIG (DIG EASY HYB SOLUTION, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Блоти нейлонових мембран, які містять фіксовану ДНК, швидко промивали 2-кратним розчином SSC і попередньо гібридизували з 20-25 мл заздалегідь нагрітого розчину DIG EASY HYB SOLUTION в флаконах для гібридизації протягом приблизно 2 годин при температурі близько 45-55ºC в гібридизуючій печі. Розчин для попередньої гібридизації потім декантували і замінювали ~15 мл попередньо нагрітого розчину DIG EASY HYB SOLUTION, що містить необхідну кількість специфічних зондів, денатурованих шляхом кип'ятіння на водяній бані протягом приблизно п'яти хвилин. Стадію гібридизації потім виконували протягом ночі при температурі близько 45-55ºC в гібридизуючій печі. У кінці гібридизації зондів розчини DIG EASY HYB SOLUTION, що містять зонди, декантували в чисті пробірки і зберігали при температурі близько -20 °C. Вказані зонди можуть бути використані двічі відповідно до рекомендацій виробника. Мембранні блоти швидко споліскували і двічі промивали в чистих пластикових ємностях промивальним буфером в умовах зниженої суворості (2-кратний об'єм SSC, 0,1 % SDS) протягом приблизно п'яти хвилин при кімнатній температурі і потім двічі промивали промивальним буфером в суворих умовах (0,1-кратний об'єм SSC, 0,1 % SDS) протягом 15 хвилин при температурі близько 65ºC. 18 UA 114481 C2 5 10 15 Мембранні блоти швидко промивали 1-кратним буфером з малеїновою кислотою з набору промивальних і блокуючих буферів DIG (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) протягом приблизно 5 хвилин. Потім виконували промивання 1-кратним блокуючим буфером протягом 2 годин і інкубували з антитілом проти DIG-AP (лужна фосфатаза) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) в 1-кратному блокуючому буфері також протягом мінімум 30 хвилин. Після 2-3 промивань 1кратним промивальним буфером специфічні ДНК-зонди залишалися зв'язаними з мембранними блотами, після чого DIG-мічену еталонну ДНК візуалізували за допомогою хемілюмінесцентної системи виявлення нуклеїнової кислоти CDP-STAR (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) відповідно до рекомендацій виробника. Блоти піддавали впливу хемілюмінесцентної плівки протягом одного або декількох разів для виявлення гібридизуючих фрагментів і візуалізації молекулярних еталонів. Плівки проявляли в проявнику плівок ALL-PRO 100 PLUS (Konica Minolta, Osaka, Japan) і отримані зображення сканували. Для кожного зонда реєстрували число і розміри виявлених смуг. DIG-мічений маркер II молекулярної маси ДНК (DIG MWM II) і DIGмічений маркер VII молекулярної маси ДНК (DIG MWM VII), видимий після виявлення DIG вищеописаним методом, були використані для визначення розміру гібридизуючих фрагментів на саузерн-блотах. Таблиця 6 Локалізація і довжина зондів, використаних при виконанні аналізу методом саузерн-блоттингу Назва зонда Cry1Ac Cry1F specR OriRep trfA 20 25 30 Генетичний елемент cry1Ac cry1F Ген стійкості до спектиноміцину Ori Rep Білок ініціації реплікації trfA Довжина (п. о.) 1720 1746 750 852 1119 Приклад 4.5. Результати аналізу методом саузерн-блоттингу У таблиці 7 приведені розміри передбачуваних фрагментів і фрагментів, отриманих для певного гідролізату і зонда на основі відомих сайтів рестрикційних ферментів PTU cry1Ac і cry1F. В результаті вказаних розщеплень і гібридизацій були ідентифіковані фрагменти двох типів: внутрішні фрагменти, де відомі сайти ферментів фланкують область зонда і повністю знаходяться в інсерційній області PTU cry1Ac і cry1F, і крайові фрагменти, де відомий сайт ферменту локалізований біля одного кінця області зонда і другий сайт знаходиться в геномі сої. Розміри крайових фрагментів змінюються залежно від трансформанта, оскільки в більшості випадків сайти інтеграції фрагментів ДНК є унікальними для кожного трансформанта. Крайові фрагменти являють собою засіб локалізації сайту рестрикційного ферменту відносно інтегрованої ДНК і визначення числа інсерцій ДНК. Аналізи методів саузерн-блоттингу, виконані в декількох поколіннях сої, що містить трансформант pDAB9582.814.19.1, дозволили отримати дані, з яких виходить, що в геном трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 була введена малокопійна інтактна PTU cry1Ac і cry1F з плазміди pDAB9582. Таблиця 7 Гібридизуючі фрагменти, прогнозовані і виявлені при виконанні аналізу методом саузерн-блоттингу 1. Розміри передбачуваних фрагментів визначені на основі плазмідної карти pDAB9582. 2. Розміри виявлених фрагментів встановлені приблизно за результатами вказаних аналізів і визначені на основі виявлених розмірів фрагментів DIG-міченого маркера II і маркера VII молекулярної маси ДНК ДНК- Рестрикційні зонд ферменти AseI Розміри Розміри виявлених передбачу-ваних 2 1 фрагментів (п. о.) фрагментів (п. о.) 13476 >14000 немає немає Зразки pDAB9582 Maverick Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 pDAB9582 >7286 15326 19 ~7400 >15000 UA 114481 C2 Продовження таблиці 7 Сry1Ac NsiI немає 5 10 15 20 25 немає >9479 >10000 4550 немає ~4500 немає 4550 ~4500 8071 немає ~8000 немає 5569 ~7500 11044 немає 11000 немає >9479 >10000 7732 немає ~7700 немає 7732 ~7700 15320 немає ~15000 немає немає немає 15320 немає ~15000 немає немає немає 5239 немає ~5000 немає немає Maverick Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 pDAB9582 NotI+ApaL1 Maverick Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 pDAB9582 NdeI Maverick Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 pDAB9582 Сry1F NsiI Maverick Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 pDAB9582 HindIII Maverick Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 pDAB9582 SpecR NsiI Maverick Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 pDAB9582 trfA NsiI Maverick Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 pDAB9582 oriREP NdeI Maverick Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 немає Рестрикційні ферменти AseI і NsiI зв'язуються з унікальними сайтами рестрикції і розщеплюють їх в плазміді pDAB9582. Тому вказані ферменти були вибрані для дослідження вставки гена cry1Ac в трансформанті сої pDAB9582.814.19.1. Було передбачено, що крайові фрагменти >7286 п. о. або >9479 п. о. повинні гібридизувати із зондом після розщеплення ферментами AseI і NsiI (таблиця 7). Окремі смуги гібридизації cry1Ac близько 7400 п. о. і >10000 п. о. були виявлені при використанні відповідно AseI і NsiI. Гібридизація зонда зі смугами вказаного розміру дозволяє передбачити наявність одного сайта інсерції для гена cry1Ac в геномі трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. Рестрикційні ферменти NotI і ApaLI були вибрані для подвійного розщеплення і вивільнення фрагмента, що містить транскрипційну одиницю рослини cry1Ac (PTU, промотор/ген/термінатор) (таблиця 7). Прогнозовані фрагменти довжиною 4550 п. о. були виявлені за допомогою зонда після подвійного розщеплення ферментами NotI і ApaLI. Результати, отримані при розщепленні ферментами зразків pDAB9582.814.19.1 з подальшою гібридизацією із зондом, показали, що в геном трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 була введена інтактна PTU cry1Ac з плазміди pDAB9582. Рестрикційні ферменти NdeI і NsiI зв'язуються з сайтами рестрикції і розщеплюють їх в плазміді pDAB9582. Тому вказані ферменти були вибрані для дослідження вставки гена cry1F в трансформант сої pDAB9582.814.19.1. Було передбачено, що крайові фрагменти >5569 п. о. і >9479 п. о. повинні гібридизувати із зондом після розщеплення ферментами NdeI і NsiI (таблиця 7). Окремі смуги гібридизації cry1F >7500 п. о. і >10000 п. о. були виявлені при використанні відповідно NdeI і NsiI. Гібридизація зонда з смугами вказаного розміру дозволяє передбачити наявність одного сайту інсерції для гена cry1F в геномі трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. Рестрикційний фермент HindIII був вибраний для вивільнення фрагмента, що містить транскрипційну одиницю рослини cry1F (PTU, промотор/ген/термінатор) (таблиця 7). Прогнозований фрагмент довжиною 7732 п. о. був виявлений за допомогою зонда після 20 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 розщеплення ферментом HindIII. Результати, отримані при розщепленні ферментами зразків pDAB9582.814.19.1 з подальшою гібридизацією із зондом, показали, що в геном трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 була введена інтактна PTU cry1F з плазміди pDAB9582. Приклад 4.6. Відсутність кістякових послідовностей Аналіз методом саузерн-блоттингу був також виконаний для перевірки відсутності гена стійкості до спектиноміцину (specR), елемента OriRep і білка ініціації реплікації trfA (елемент trf А) в трансформанті сої pDAB9582.814.19.1. Передбачалася відсутність специфічної гібридизації з геном стійкості до спектиноміцину, елементом OriRep або елементом trfA при виконанні аналізу методом саузерн-блоттинг позитивного контрольного зразка (pDAB9582, введений в геномну ДНК сорти Maverick) і негативного контрольного зразка (геномна ДНК сорту Maverick). Після розщеплення ферментом NsiI і гібридизації із зондом, специфічним до specR, в позитивному контрольному зразку (pDAB9582, введений в геномну ДНК сорти Maverick) була виявлена одна смуга передбачуваного розміру, яка дорівнює 15320 п. о. Зонд до specR не гібридизував з негативним контрольним зразком і зразком, що містить трансформант сої pDAB9582.814.19.1. Аналогічним чином після розщеплення ферментом NsiI і гібридизації із зондом trfA в позитивному контрольному зразку (сорт Maverick, що містить pDAB959582) була виявлена одна смуга передбачуваного розміру, яка дорівнює 15320 п. о., яка була відсутня в негативному контрольному зразку і зразку, що містить трансформант сої pDAB9582.814.19.1. Після розщеплення ферментом NdeI і гібридизації із зондом, специфічним до OriRep, в позитивному контрольному зразку (pDAB9582, введений в геномну ДНК сорти Maverick) була виявлена інша смуга передбачуваного розміру, яка дорівнює 5329 п. о., яка була відсутня в негативному контрольному зразку і зразку, що містить трансформант сої pDAB9582.814.19.1. Отримані дані свідчать про відсутність гена стійкості до спектиноміцину, елемента OriRep і білка ініціації реплікації trfA в трансформант сої pDAB9582.814.19.1. Приклад 5. Агрономічні і польові випробування і визначення стійкості до гербіцидів Для дослідження агрономічних характеристик і ефективності трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 насіння, що містить вказаний трансформант, було посіяне на ділянку, призначену для випробування ефективності, в Санта-Ізабель, Пуерто-Ріко, в жовтні 2010 р. і лютому 2011 р. Культивар Maverick, трансформований з можливістю продукування трансформанта pDAB9582.814.19.1, був посіяний в кожному розпліднику і використаний як контрольний зразок у вказаних експериментах. Насіння для розплідника Т3 було отримане в результаті селекції однієї рослини на стадії Т2, і насіння для розплідника Т4 було отримане в результаті селекції однієї рослини на стадії Т3. У кожному поколінні було випробувано чотири лінії трансформанта. Кожну лінію висівали на дослідній ділянці шириною в 4 ряди і довжиною 229 см (7,5 фути). Відстань між рядами була така, що дорівнює 75 см (30 дюймів). Ділянки отримували додаткове освітлення протягом приблизно 2,5 тижня для компенсації короткого світлового дня в Пуерто-Ріко. Кожну ділянку обприскували глуфосинатом при нормі 411 г еквівалента кислоти/га. Одну ділянку з контрольними рослинами сорту Maverick обприскували такою ж кількістю глуфосинату, другу ділянку не обприскували і використовували як контрольну ділянку для порівняння з трансформантом за даним винаходом. Були отримані дані по схожості, зовнішньому вигляду, потужності, висоті, виляганню і дозріванню. Стійкість до гербіциду оцінювали візуально відносно хлорозу, некрозу листя і загибелі рослин (таблиця 8). Для порівняння трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 з сортом Maverick використовували тільки дані, отримані для сорту Maverick, що не обприскується гербіцидом. Для порівняння ділянок, що не обприскуються, і ділянок, що обприскуються, використовували дані, отримані для трансформанта сої pDAB9582.814.19.1, що обприскується вказаним гербіцидом, які порівнювали з даними, отриманими для контрольної ділянки, що не обприскується, на якій була посіяна соя сорту Maverick. Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 характеризувався стійкістю до гербіциду глуфосинату. На відміну від цієї рослини сорти Maverick не були стійкі до впливу вказаного гербіциду. 21 UA 114481 C2 Таблиця 8 Порівняння трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 з сортом Maverick. Приведені значення усереднені для розсадників Т3 і Т4. Кожний розсадник, в якому була посіяна соя, що містила трансформант pDAB9582.814.19.1, обприскували глуфосинатом на стадії V3 при нормі 411 г еквівалента кислоти/га Потужність Зовнішній вигляд Схожість (від 1 = Висота Вилягання Дозрівання Трансформант (від 1 = поганий до 9 (%) погана до 9 = (см) (%) (дні) = хороший) хороша) pDAB9582.814.19.1 90 8 8 69 1 91 Maverick 82 8 8 64 1 91 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 6. Дослідження інсектицидної активності трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 Активність Cry1Ac і Cry1F в трансформанті сої pDAB9582.814.19.1 досліджували в польових умовах і теплиці проти виведених в лабораторії шкідників сої, що включають Anticarsia gemmatalis (оксамитова гусениця), Pseudoplusia includens (соєвий п'ядун) і Spodoptera frugiperda (совка трав'яна). Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 порівнювали з нетрансформованою соєю сорту Mavеrick для визначення ступеня захисту рослин, що забезпечується білками Cry1F і Cry1Ac. У теплиці досліджували рослини у віці приблизно чотирьох тижнів. Для оцінки трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 і контрольної сої сорту Maverick були використані п'ятнадцять рослин. Для кожного випробуваного виду комах (Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includeтs і Spodoptera frugiperda) з кожної рослини було зрізано по 3 листки, в результаті чого зі всіх рослин було отримано загалом 45 листових дисків для кожного виду комах. Листові диски 2 розміром 1,4 см (1,54 см ) вміщували зверху 2 % водного агару, заражали однією новонародженою личинкою і закривали перфорованою пластиковою кришкою. Загибель личинок і кількість з'їденого листка оцінювали через 4 дні після зараження. Личинки, які не реагували на обережний дотик щупом, вважалися мертвими. Пошкодження листка визначали шляхом візуальної оцінки з'їденої комахою частини листового диска в процентному обчисленні. Для оцінки рослин, що виростали в польових умовах, збирали зразки листя з рослин, вирощених з насіння на дослідних ділянках в Санта-Ізабель, Пуерто-Ріко, і відправляли зібране листя на дослідження в Індіанаполіс, шт. Індіана. Дослідна ділянка для трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 була засіяна в лютому 2011 р. і складалася приблизно з 180 рослин в чотирьох рядах. Кожний ряд був довжиною 2,3 м, і відстань між рядами була така, що дорівнює 76,2 см; окремі рослини виростали на відстані 5,1 см одна від одної в кожному ряду. У березні 2011 р. з 10 рослин сої, що містять трансформант pDAB9582.814.19.1, і з 10 рослин сорту Maverick було зрізано по одному повністю розвиненому трилиснику головного стебла, розташованому на відстані приблизно чотирьох вузлів нижче меристеми. Листя було вміщене в пластикові мішки з етикетками (по одному в кожний мішок) і запечатане. Листя в мішках було упаковане в коробки і відправлене в лабораторію. У лабораторії з кожного трилисника були виготовлені один або два листові диски з діаметром 3,33 см (1,31 дюйми), в результаті чого було отримано загалом 16 дисків. Кожний листовий диск вміщували зверху 2 % агару, заражали однією новонародженою личинкою S. frugiperda і закривали перфорованою пластиковою кришкою. Листові диски витримували в камері з контрольованим середовищем протягом 7 днів, протягом яких оцінювали загибель комах і кількість з'їденого листка. Личинки, які не реагували на обережний дотик щупом, вважалися мертвими. Пошкодження листя визначали шляхом візуальної оцінки з'їденої комахою частини листового диска в процентному обчисленні. Результати, отримані в двох експериментах, показали, що листя, що містить трансформант сої pDAB9582.814.19.1, було значно менше пошкоджене всіма перевіреними комахами, ніж контрольні рослини сорту Maverick. Таким чином, трансформант сої pDAB9582.814.19.1 має інсектицидну активність відносно широкого спектра комах. Приклад 7. Послідовність трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 SEQ ID NO:14 являє собою послідовність трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. Дана послідовність містить 5'-кінцеву геномну фланкуючу послідовність, вставку Т-ланцюга pDAB9582 і 3'-кінцеві геномні фланкуючі послідовності. У SEQ ID NO:14 залишки 1-1400 є 5'кінцевою геномною фланкуючою послідовністю, залишки 1401-1536 є реаранжированими залишками плазміди pDAB9582, залишки 1537-13896 є залишками вставки Т-ланцюга 22 UA 114481 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 pDAB9582 і залишки 13897-15294 є 3'-кінцевою фланкуючою послідовністю. З'єднувальна послідовність або перехід до 5'-кінця вставки, таким чином, знаходиться в положенні залишків 1400-1401 SEQ ID NO:14. З'єднувальна послідовність або перехід до 3'-кінця вставки, таким чином, знаходиться в положенні залишків 13896-13897 SEQ ID NO:14. Потрібно зазначити, що потомство трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 може мати послідовності, дещо відмінні від SEQ ID NO:14. У процесі інтрогресії і селекції з введенням трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 в геном рослинних клітин можливі деякі делеції або інші зміни вставки. Крім того, в процесі ампліфікації методом ПЛР можуть виникнути помилки, які можуть викликати незначні помилки секвенування. Наприклад, фланкуючі послідовності, приведені в даному описі винаходу, були визначені шляхом створення ампліконів з геномних ДНК сої, після чого амплікони були клоновані і секвеновані. Цілком можливі невеликі відмінності і незначні розходження в послідовностях, створених і визначених подібним чином, з урахуванням численних циклів ампліфікації, необхідних для створення з геномних ДНК амплікона, достатнього для секвенування. Фахівцеві в даній галузі повинно бути зрозуміло, що в об'єм даного винаходу входять будь-які коректування, необхідні внаслідок виникнення звичайних помилок секвенування або розходжень вказаних типів. Таким чином, відповідний сегмент плазмідної послідовності за даним винаходом може включати деякі незначні зміни. У об'єм даного винаходу також входить рослина, що включає полінуклеотид, що має деякий ступінь ідентичності з вставковою послідовністю за даним винаходом. Полінуклеотидна послідовність може бути ідентична послідовності SEQ ID NO:14 щонайменше на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 %. Таким чином, деякі відмінності SEQ ID NO:14 від потомства рослин з трансформантом сої pDAB9582.814.19.1 можуть бути ідентифіковані і входять в об'єм даного винаходу. Приклад 8. Трансформантспецифічний аналіз TaqMan Трансформантспецифічний аналіз TAQMAN був розроблений для виявлення трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 і визначення статусу зиготності рослин в популяції, достатної для подальшого розмноження. Трансформант сої pDAB9582.814.19.1 містить Тланцюг подвійного вектора pDAB9582 (фіг. 1). Для виявлення трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 були створені специфічні праймери і зонди TAQMAN, відповідні послідовностям ДНК, розташованим в місці 5'-кінцевого (SEQ ID NO:1) або 3'-кінцевого (SEQ ID NO:2) з'єднання вставки з геномом рослини (фіг. 4). Один трансформантспецифічний аналіз трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 спеціально призначений для виявлення фрагмента ДНК довжиною 229 п. о., що заповнює місце інтеграції в положенні 3'-кінця, і включає використання двох праймерів специфічного до мішені зонда MGB, що містить ген-репортер FAM в положенні 5'-кінця, який був синтезований в компанії Applied Biosystems (ABI). Специфічність методу TAQMAN, призначеного для виявлення трансформанта сої pDAB9582.814.19.1, досліджували відносно 7 різних трансформантів, що містять PTU Cry1Ac і Cry1F, і контрольного сорту нетрансгенної сої (Maverick) в подвійному форматі зі специфічним ендогенним еталонним геном сої GMFL01-25-J19 (кДНК Glycine max, GenBank: АК286292.1). Приклад 8.1. Виділення гДНК У даному експерименті були досліджені зразки гДНК 7 різних трансформантів сої і сортів нетрансгенної сої. Геномну ДНК екстрагували, використовуючи модифікований набір для екстракції ДНК рослин QIAGEN MAGATTRACT (Qiagen, Valencia, CA). гДНК екстрагували з листових дисків свіжої сої, по 8 на кожний зразок. Відповідно до цілей даного дослідження зразки розводили водою без ДНКази з досягненням концентрації, яка дорівнює приблизно 10 нг/мкл. Приклад 8.2. Аналіз TaqMan і результати Специфічні праймери і зонди, використані при виконанні аналізу методом TAQMAN, були створені спеціально для трансформанта сої pDAB9582.814.19.1, що досліджується методом TAQMAN. Вказані реагенти можуть бути використані в приведених нижче умовах для виявлення трансгена в трансформанті сої pDAB9582.814.19.1. У таблиці 9 приведені послідовності праймерів і зондів, які були створені спеціально для виявлення трансформанта сої pDAB9582.814.19.1. 23 UA 114481 C2 Таблиця 9 Праймери і зонди для ПЛР методом TAQMAN Назва SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17 81419_3'F 81419_3'R 81419_3'P Назва SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 5 10 15 20 25 30 Взаємодія з трансформантом-мішенню Опис Послідовність Трансформант-специфічний TATGCATAGATGCACTCGAAATCA верхній праймер Трансформант-специфічний GTTTCCACACCCTAGATCCGTATC нижній праймер Трансформант-специфічний зонд, що використовується з 5'FAM/CCGCAATATGATATTCA-MGB праймерами 81419_3'F і 81419_3'R Взаємодія з еталонним геном-мішенню Опис Послідовність GMS116F Верхній праймер GTAATATGGGCTCAGAGGAATGGT GMS116R Нижній праймер ATGGAGAAGAACATTGGAATTGC Зонд GMS116 Зонд 5'HEX/CCATGGCCCGGTACCATCTGGTC/3BHQ_1/3' Ампліфікація методом ПЛР була виконана в наступних умовах: 1-кратний буфер для ПЛР компанії Roche, 0,4 мкМ трансформантспецифічного верхнього праймера, 0,4 мкМ трансформантспецифічного нижнього праймера, 0,4 мкМ праймера GMS116F, 0,4 мкМ праймера GMS116R, 0,2 мкМ трансформантспецифічного зонди, 0,2 мкМ зонда GMS116, 0,1 % PVP, 6-20 нг гДНК в загальній кількості реакційної суміші, що дорівнює 10 мкл. Суміш ампліфікували в наступних умовах: i) 95ºC протягом 10 хвилин, ii) 95ºC протягом 10 секунд, iii) 60ºC протягом 40 секунд, iv) повторення стадій ii-iii протягом 40 циклів, v) витримування при 40ºC. ПЛР в реальному часі виконували в пристрої LIGHTCYCLER 480 компанії Roche. Аналіз даних був зроблений на основі вимірювання точки перетину (значення Ср), що визначається за допомогою програмного забезпечення LIGHTCYCLER 480, яка відповідає числу циклів ПЛР, при якому інтенсивність зміни флуоресценції досягає максимуму. Метод TAQMAN, призначений для виявлення трансформанта сої pDAB9582.814.19.1, досліджували відносно 7 різних трансформантів, що містять PTU Cry1Ac і Cry1F, і сорти нетрансгенної сої в подвійному форматі зі специфічним ендогенним еталонним геном сої GMFL01-25-J19 (GenBank: АК286292.1). Вказаний аналіз дозволяв специфічно виявляти трансформант сої pDAB9582.814.19.1 без яких-небудь помилкових позитивних результатів виявлення контрольних зразків (тобто трансформанти, що містять PTU Cry1Ac і Cry1F, і сорт нетрансгенної сої). Для виявлення трансформанта сої pDAB9582.814.19.1 можуть бути використані трансформантспецифічні праймери і зонди, причому вказані умови і реагенти застосовні для аналізів зиготності. З урахуванням проілюстрованих і описаних принципів даного винаходу фахівцям в даній галузі повинно бути зрозуміло, що у винахід можуть бути внесені зміни, які не виходять за межі таких принципів. Всі модифікації заявленого винаходу знаходяться в межах суті і об'єму прикладеної формули винаходу. Всі приведені публікації і опубліковані патентні документи включені в даний опис винаходу як посилання в тій мірі, в якій обґрунтоване включення як посилання кожної окремої публікації або заявки на патент. 24 UA 114481 C2 25 UA 114481 C2 26 UA 114481 C2 27 UA 114481 C2 28