Композиція і лікарський засіб, які містять ідуронат-2-сульфатазу, і спосіб їх отримання

Реферат: Винахід належить до композиції, яка містить рекомбінантну ідуронат-2-сульфатазу (ІДС), де цистеїновий залишок у положенні 59 в амінокислотній послідовності ІДС перетворений у формілгліцин (FGly), винахід також стосується лікарського засобу, що містить ІДС, та способу їх одержання. UA 109949 C2 (12) UA 109949 C2 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки Даний винахід стосується композиції для лікування синдрому Хантера, який містить рекомбінантну людську ідуронат-2-сульфатазу (яка надалі в цьому документі називається ІДС, IDS), лікарського засобу, який містить її, і способу їх отримання. Більш конкретно композиція для лікування синдрому Хантера відповідно до даного винаходу містить як активний інгредієнт ІДС, яка має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1, де цистеїновий залишок у положенні 59 в амінокислотній послідовності ІДС SEQ ID NO: 1 перетворений у формілгліцин (FGly: 2-аміно-3-оксопропіонова кислота) у молярному співвідношенні 65 % або вище, переважно у молярному співвідношенні 75 % або вище і більш переважно у молярному співвідношенні 80 % або вище. Крім того, ІДС, що міститься в композиції для лікування синдрому Хантера, містить манози-6-фосфат у кількості від 2,0 до 4,0 моль із розрахунку на моль ІДС, переважно у кількості від 2,3 до 3,5 моль і більш переважно у кількості від 2,5 до 3,0 моль. Спосіб отримання композиції для лікування синдрому Хантера відповідно до даного винаходу містить: (1) культивування рекомбінантного клітинного штаму, трансформованого геном, який кодує ІДС, представлену в SEQ ID NO: 1, і отримання культури; і (2) очищення культури за допомогою аніонообмінної хроматографії, гідрофобної хроматографії, катіонообмінної хроматографії і афінної хроматографії, відмінний тим, що рекомбінантний клітинний штам культивується у присутності гідролізату і катіонообмінна хроматографія виконується із застосуванням елююючого буфера із pH від 4,0 до 6,0. Маючи перевагу над загальноприйнятими продуктами з точки зору безпеки і фармацевтичної ефективності, терапевтична композиція, яка містить ІДС, і лікарський засіб, який містить її, можуть бути ефективно застосовані для лікування синдрому Хантера. Рівень техніки, який передує винаходу Синдром Хантера або мукосахаридоз II типу є лізосомальною хворобою накопичення (LSD), в якій мукополісахариди, також відомі як глікозаміноглікани (ГАГ, GAG), не руйнуються правильно і накопичуються в організмі через нестачу ІДС. У міру того як ГАГ продовжує накопичуватися у всіх клітинах організму, різні ознаки синдрому Хантера стають більш явними. Фізичні прояви для деяких людей із синдромом Хантера включають характерні риси обличчя і велику голову. Показовими серед симптомів синдрому Хантера є збільшена черевна порожнина внаслідок гепатомегалії або спленомегалії, глухота, порок клапана серця, обструктивне захворювання дихальних шляхів і апное уві сні. Також основні суглоби можуть бути схильні до впливу синдрому Хантера, приводячи до тугорухливості суглобів і обмеженого переміщення. У деяких випадках синдрому Хантера залучення центральної нервової системи приводить до затримок у розвитку і проблем із нервовою системою. Відомо, що синдром Хантера зустрічається із частотою 1 на 162000 і є генетичним порушенням у вигляді пов'язаного із Xхромосомою рецесиву і таким чином приводить до сильних страждань як сім'ї, так і хворого. Виконувалися різні випробування відносно лікування синдрому Хантера, включаючи трансплантацію кісткового мозку, замісну ферментну і генну терапію. Хоч трансплантація кісткового мозку здатна зупинити більшість симптомів, складно знайти HLA (людський лейкоцитарний антиген), придатний всім хворим. Крім того, трансплантація кісткового мозку є складною хірургічною операцією, яка супроводжується декількома несприятливими ефектами, включаючи те, що життя хворого знаходиться під ризиком того, що HLA підібраний неправильно. Генна терапія синдрому Хантера доставляє нормальний ген ІДС в організм за допомогою вірусного вектора такого, як аденовірусний або ретровірусний або невірусний вектор. Однак генна терапія залишається експериментальною технологією і не застосовувалася клінічно. При замісній ферментній терапії синдрому Хантера вводиться вироблений зовнішнім чином ІДС, і вона має перевагу, яка полягає в простоті. Однак ферментне заміщення повинне бути отримуваним постійно, із чого виходить висока вартість. Elaprase® (Елапраза®) (Shire Pharmaceuticals Group), продукована із застосуванням технології рекомбінантних ДНК, була схвалена FDA, як замісна ферментна терапія синдрому Хантера. Однак цей лікарський засіб є дорогим і має недолік, який полягає в тому, що він має недостатній ефект і безпеку. Як описано вище, хоча були розроблені різні терапії для синдрому Хантера, все ще має місце невідкладна потреба у новій терапії і агенті, який виявляє високу терапевтичну ефективність із високою безпекою. Розкриття винаходу Технічна задача 1 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Метою даного винаходу є подолання проблем, які виникли у попередньому рівні техніки, і надання композиції для терапії синдрому Хантера, яка містить рекомбінантну ІДС як активний інгредієнт, що гарантує високу терапевтичну ефективність і безпеку, вироблену поліпшеним культивуванням і процесом очищення, і лікарського засобу, який містить її. Іншою метою даного винаходу є надання способу отримання композиції для лікування синдрому Хантера і лікарського засобу, який містить її. Рішення задачі Для досягнення вищезгаданої мети даний винахід надає композицію для терапії синдрому Хантера, яка містить як активний інгредієнт рекомбінантну ІДС, яка має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1, де цистеїновий залишок у положенні 59 перетворений в формілгліцин (FGly) у молярному співвідношенні 65 % або вище, переважно у молярному співвідношенні 75 % або вище і більш переважно у молярному співвідношенні 80 % або вище. ІДС, в даному документі, також звана ідуронат-2-сульфатаза, або I2S, має молекулярну масу 56 кДа при виділенні і очищенні із людської печінки, нирки або плаценти (Bielicki J. et al. (1990) Biochem J., 271: 75-86). ІДС експресується у вигляді мономерного білка із 550 амінокислот і секретується в середовище у вигляді зрілого активного білка із 525 амінокислот після відщеплення сигнального пептиду із 25 амінокислот. Молекулярна маса ІДС змінюється із глікозилуванням і варіюється, як було виявлено, від приблизно 60 до 90 кДа при обробці ендоглікозидазою F, як виміряно ДСН-ПААГ (SDS-PAGE). ІДС містить два дисульфідні зв'язки і вісім сайтів N-глікозилування і виробляється у вигляді глікопротеїну після виникаючої посттрансляційної модифікації, при якій сайти N-глікозилування зайняті комплексними, гібридними і олігосахаридними ланцюгами із високим вмістом манози в еукаріотах. Після секретування в культуральне середовище ІДС може бути використаний як лікарський засіб після проходження через стандартні процеси виділення і очищення. ІДС може бути у формі глікопротеїнів із різними профілями глікозилування, залежно від різних факторів, включаючи, наприклад, генетичну рекомбінацію ІДС, трансформацію (наприклад, використовуваних клітинних ліній), технології культивування і очищення. У цьому винаході розкрито, що вміст манози-6-фосфату (M6P) і міра перетворення Cys-59 в FGly має великий вплив на терапевтичну ефективність і безпеку ІДС. Наявність залишків манози-6-фосфату (M6P) дозволяє специфічне зв'язування ферменту із рецепторами M6P на клітинній поверхні, приводячи до клітинної інтерналізації ферменту, направляючи лізосоми і подальший катаболізм акумульованих ГАГ. Біологічна активність ІДС також є залежною від постмодифікації збереженого цистеїну (положення 59) у формілгліцині. Якщо не вказано інше, термін "ІДС", як він використовується в даному документі, означає приєднаний до вуглеводу білок ІДС, тобто, глікозиловану ІДС. ІДС за даним винаходом переважно має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, але не обмежується нею. Фахівець, який має звичайні знання в даній галузі (який надалі в цьому документі називається "звичайний фахівець") повинно бути очевидно, що поки зберігається цільова активність ІДС, будь-яка амінокислотна послідовність, у якій відбуваються мутації, такі як вставка, делеція і заміна, у деяких амінокислотних залишках амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 1 попадають у обсяг даного винаходу. У використовуваному значенні в даному документі термін "профіль глікозилування" ІДС стосується профілю олігосахаридів, які зв'язані із вісьмома сайтами глікозилування ІДС, яка виходить в результаті (наприклад, сайти глікозилування і типи олігосахаридів). У одному варіанті здійснення ІДС, яка міститься в композиції для терапії синдрому Хантера відповідно до даного винаходу, має таку ж амінокислотну послідовність, як відома (SEQ ID NO: 1), але має інший профіль глікозилування і іншу міру перетворення цистеїну у положенні 59 у формілгліцин, як описано вище (приклади 1-5 і 1-6). Тобто ІДС, яка застосовується у композиції для терапії синдрому Хантера відповідно до даного винаходу, має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1 із перетворенням цистеїну у положенні 59 у формілгліцин (FGly) у молярному співвідношенні 65 % або вище, переважно у молярному співвідношенні 75 % або вище і більш переважно у молярному співвідношенні 80 % або вище, тоді як міра перетворення в Елапразі становить приблизно 50 % (Genet. Med. 2006:8(8):465-473). Відомо, що формілгліцин у великій мірі задіяний у здатності ІДС руйнувати субстрат, тобто активність ІДС. Таким чином, оскільки композиція за даним винаходом і загальноприйнятий агент Елапраза є різними, композиція і лікарський засіб відповідно до даного винаходу можуть виявляти велику терапевтичну ефективність відносно синдрому Хантера, ніж може загальноприйнятий агент Елапраза, через більший ступінь перетворення цитозину у формілгліцин у положенні 59 в амінокислотній послідовності ІДС. 2 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, ІДС, яка застосовується в композиції або лікарському засобі для терапії синдрому Хантера відповідно до даного винаходу, містить манози-6-фосфат у кількості від 2,0 до 4,0 моль із розрахунку на моль ІДС, переважно у кількості від 2,3 до 3,5 моль і більш переважно у кількості від 2,5 до 3,0 моль. M6P грає важливу роль у клітинній інтерналізації ІДС і подальшому напрямі у внутрішньоклітинні лізосоми. Таким чином, лікарський засіб за даним винаходом, який містить ІДС із високим вмістом M6P, забезпечує високу ефективність опосередкованого рецепторами механізму поглинання для цього ферменту і направляючи в лізосоми, за допомогою цього приводячи в результаті до ефективного катаболізму акумульованих ГАГ. Лікарський засіб для терапії синдрому Хантера, який містить ІДС відповідно до даного винаходу, може бути отриманий складанням композиції за даним винаходом із фармацевтично прийнятним носієм в придатній формі. У використовуваному в даному документі значенні термін "фармацевтично прийнятний" носій стосується нетоксичного, фізіологічно сумісного наповнювача для активного інгредієнта, який є придатним для проковтування тваринами, без надмірної токсичності, несумісності, нестійкості, роздратування, алергічної реакції і тому подібного. Композиція відповідно до даного винаходу може бути складена із придатним наповнювачем залежно від застосованого шляху введення. Лікарський засіб відповідно до даного винаходу може бути введений перорально або парентерально, але не обмежено цим. Для парентерального введення може бути використаний шлях, вибраний із трансдермального, інтраназального, внутрішньоочеревинного, внутрішньом'язового, підшкірного або внутрішньовенного шляхів. Для перорального введення може бути складена фармацевтична композиція в комбінації із придатним оральний наповнювачем в порошки, гранули, таблетки, пілюлі, пастилки, капсули, рідини, гелі, сиропи, суспензії і пластинки із застосуванням способу, відомого в даній галузі. Приклади придатного наповнювача, придатного для лікарського засобу, включають цукри, такі як лактоза, декстроза, сахароза, сорбіт, маніт, ксиліт, еритрит і мальтит, крохмалі, такі як кукурудзяний крохмаль, пшеничний крохмаль, рисовий крохмаль і картопляні крохмалі, целюлози, такі як целюлоза, метилцелюлоза, натрійкарбоксиметилцелюлоза і гідроксипропілметилцелюлоза, і наповнювачі, такі як желатин і полівінілпіролідон. Необов'язково, лікарський засіб може додатково містити дезінтегруючий агент, такий як поперечно зв'язаний полівінілпіролідон, агар, альгінова кислота або альгінат натрію. Крім того, можуть бути додатково застосовані антиагломеруючий агент, змазувальний агент, змочувальний агент, ароматний агент, емульгатор і консервант. Також композиція за даним винаходом може бути складена в комбінацію із парентеральним наповнювачем у парентеральну одиницю дозування, таку як ін'єктований препарат, трансдермальний препарат або інтраназальна інгаляція із застосуванням добре відомого в даній галузі способу. Для застосування в ін'єкції лікарський засіб повинен бути стерилізований і захищений від зараження мікроорганізмами, такими як бактерії і гриби. Приклади наповнювача, придатного для ін'єкції, можуть включати, але не обмежені ними, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь, рідкий поліетиленгліколь і т. д.), їх комбінації і/або розчинник, який містить рослинну олію або дисперсійне середовище. Більш переважно наповнювач може бути ізотонічним розчином, таким як розчин Хенкса, розчин Рінгера, який містить триетаноламін-PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин), або ін'єктованою стерильною водою, 10 % етанолом, 40 % пропіленгліколем і 5 % декстрозою. Для того, щоб захистити ін'єктований препарат від мікробного зараження, він може додатково містити антибактерійний і протигрибковий агент, такий як парабен, хлорбутанол, фенол, сорбінова кислота, тимеросал і т. д. Також ін'єктовані препарати можуть додатково містити, в більшості випадків, ізотонічний агент, такий як цукор або хлорид натрію. Такі лікарські засоби розкриті у th документі, добре відомому у фармацевтичній галузі (Remington's Pharmaceutical Science, 15 Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania). Що стосується інгаляції, лікарський засіб відповідно до даного винаходу може бути зручно доставлений у формі аерозольного розпилення із стисненої упаковки або оприскувача із використанням придатного розпилювача, такого як дихлорфторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторетан, діоксид вуглецю або придатний газ. У випадку стисненого аерозолю одиничний розмір дози може бути визначений електронним приладом для доставки виміряної кількості. Наприклад, желатинові капсули і картриджі для застосування в інгаляторі або інсуфляторі можуть бути складені в суміш сполуки, яка містить порошок, і придатної основи порошку, такої як лактоза або крохмаль для таких систем. th Інші придатні фармацевтичні наповнювачі описані Remington's Pharmaceutical Science, 19 ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995. 3 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, лікарський засіб відповідно до даного винаходу може додатково містити один або більше буферів (наприклад, фізіологічний розчин або PBS), вуглеводи (наприклад, глюкоза, маноза, сахароза або декстран), стабілізатори (гідросульфіт натрію, сульфіт натрію або аскорбінова кислота), антиоксидант, бактеріостатики, хелатуючі агенти (наприклад, ЕДТК (EDTA) або глутатіон), ад'юванти (наприклад, гідроксид алюмінію), суспендуючі ангенти, загусники і/або консерванти (бензалконійхлорид, метил- або пропілпарабен і хлорбутанол). Також композиція за даним винаходом може бути складена в одиницю дозування, яка дозволяє швидке, безперервне або уповільнене вивільнення активного інгредієнта після введення ссавцям. Ефективна кількість лікарського засобу, приготованого таким чином, може бути введена за допомогою множини шляхів, включаючи оральний, трансдермальний, підшкірний, внутрішньовенний і внутрішньом'язовий шляхи. Термін "ефективна кількість", як він використовується в даному документі, стосується кількості ІДС, яка дозволяє відстеження діагностичного або терапевтичного ефекту, який відбувається при введенні хворому. Доза лікарського засобу відповідно до даного винаходу може варіюватися залежно від різних факторів, включаючи шлях введення, тип об'єкта, що зазнає лікування, тип захворювання, яке необхідно вилікувати, шляхи введення, серйозності хвороби і віку, статі, ваги, стану і стану здоров'я пацієнта. Лікарський засіб, який містить ІДС відповідно до даного винаходу, може бути застосований із дозою від 0,1 до 10 мг/кг і переважно із дозою від 0,5 до 1,0 мг/кг із розрахунку на дозування. Спосіб отримання терапевтичної композиції відповідно до даного винаходу містить: (1) культивування рекомбінантного клітинного штаму, трансформованого геном, який кодує ІДС, представленого в SEQ ID NO: 1, і отримання культури; і (2) очищення культури за допомогою аніонообмінної хроматографії, гідрофобної хроматографії, катіонообмінної хроматографії і афінної хроматографії, де рекомбінантний клітинний штам культивується в присутності гідролізату, і катіонообмінна хроматографія виконується із застосуванням елююючого буфера із pH від 4,0 до 6,0. Більш конкретно спосіб отримання терапевтичної композиції відповідно до даного винаходу містить: (1) трансформування клітини-хазяїна експресійним вектором, який несе ген ІДС для отримання рекомбінантного клітинного штаму; (2) культивування рекомбінантного клітинного штаму в присутності гідролізату в безсироватковому середовищі і отримання культури; (3) очищення ІДС із культури за допомогою аніонообмінної хроматографії, гідрофобної хроматографії, катіонообмінної хроматографії і афінної хроматографії, при цьому вказана катіонообмінна хроматографія виконується із застосуванням елююючого буфера із pH, який варіюється від 4,0 до 6,0; і (4) комбінування очищеної ІДС із фармацевтично прийнятним носієм. У способі стадія (1) направлена на створення рекомбінантного клітинного штаму введенням експресійного вектора, який несе ген ІДС в клітину-хазяїна. Амінокислотна послідовність ІДС і ген, який кодує ІДС, відомі в даній галузі. Ген, який кодує ІДС, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, є переважним, але не наданий як обмежуючий приклад. Якщо амінокислотна послідовність зберігає активність ІДС, яку передбачається внести із метою даного винаходу, навіть при мутуванні за допомогою вставки, делеції і/або заміни яких-небудь амінокислотних залишків в амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 1, її ген може бути застосований в даному винаході. Експресійний вектор, який несе ген, може бути отриманий із застосуванням стандартного способу, відомого в даній галузі. Крім того, експресійний вектор може містити маркерний ген, який дозволяє введення гена, який буде ідентифікований. Приклади маркерного гена включають ген дигідрофолатредуктази (dhfr), але не обмежені ним. Переважним є вектор pJK-dhfr-Or2-IDS (фіг. 2). Клітини-хазяїна, придатні для стадії (1), можуть бути тваринними клітинами, і їх приклади містять, але не обмежені ними, клітини яєчників китайського хом'ячка (CHO), людські ембріональні ниркові клітини (HEK), клітини нирок новонародженого хом'яка (BHK), клітини нирок мавпи 7 (COS7) і клітини NSO, при цьому клітини CHO є переважними. Клітинні лінії CHO є одними із найбільш широко використовуваних у виробництві біомедичних продуктів завдяки їх високим швидкостям клітинного росту і продуктивності, легкості генетичного маніпулювання, швидкій проліферації у великомасштабних суспензійних культурах і високій адаптації до безбілкового середовища. Трансформація на стадії (1) може бути здійснена відповідно до протоколу, відомого в даній галузі. У способі стадія (2) направлена на культивування рекомбінантного клітинного штаму, фіксуючого вектор для експресії ІДС в ньому в безсироватковому середовищі. Культивування 4 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 може бути здійснене в середовищі і при умовах, оптимізованих для виду клітини-хазяїна. Переважним є безсироваткове середовище. Будучи вільними від сироваток (наприклад, бичачих сироваток), такі середовища виключають імовірність індукування побічних явищ або ризиків, пов'язаних із сироватками. У одному варіанті здійснення даного винаходу культивування рекомбінантного клітинного штаму, трансформованого експресійним вектором ІДС, може бути додатково збільшене у масштабі. Наприклад, рекомбінантний клітинний штам за даним винаходом може бути культивований у колбі і потім збільшений в масштабі до сотень - тисяч літрів в біореакторі. Стадія культивування здійснюється в присутності гідролізату, який є важливим для визначення вмісту формілгліцину. Переважно гідролізат додається у такій кількості, щоб була сформована кінцева концентрація 0,1-0,0 г/л. Гідролізат, придатний в даному винаході, може бути гідролізатом, отриманим гідролізацією тваринного або рослинного матеріалу. Більш конкретно, гідролізат може бути отриманим гідролізацією щонайменше одного, вибраного із групи, яка складається із, але не обмеженої цим, сої, картоплі, пшеничного насіння і дріжджів. У способі стадія (3) направлена на очищення ІДС із клітинної культури за допомогою аніонообмінної хроматографії, гідрофобної хроматографії, катіонообмінної хроматографії і афінної хроматографії. Переважно чотири хроматографічні процеси можуть бути виконані в такому порядку. Однак звичайному фахівцеві повинно бути очевидно, що порядок може бути змінений, якщо потрібно. Нарівні із порядком хроматографічних процесів смоли і значення pH елююючих буферів мають важливе значення у визначенні профілю глікозилування і вмісту формілгліцину в ІДС. Передбачається, що аніонообмінна хроматографія видаляє барвники і різні домішки із клітинної культури, і вона виконується на колонці, наповненій смолами Q Sepharose®, із застосуванням елююючого буфера із pH від 5,5 до 7,5. Передбачається, що гідрофобна хроматографія видаляє барвники і домішки, які залишаються після аніонообмінної хроматографії. Вона виконується на колонці, наповненій смолами феніл Sepharose®, із використанням елююючого буфера із pH від 5,0 до 7,0. Передбачається, що катіонообмінна хроматографії відбирає високий вміст формілгліцину і видаляє домішки, які залишилися. Вона виконується на колонці, наповненій катіообмінними смолами, із застосуванням елююючого буфера із pH від 4,0 до 6,0. Приклади катіообмінних смол, придатних в даному винаході, можуть включати CM Sepharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow, S Sepharose Fast Flow і Capto MMC, всі від GE Healthcare, але не обмежені ними. Переважно pH елююючого буфера варіюється від 4,0 до 6,0. Передбачається, що афінна хроматографія видаляє гліцерин, який застосовується в катіонообмінної хроматографії, і концентрує об'єм елюатів. Вона виконується на колонці, наповненій смолами Blue Sepharose™, із застосуванням елююючого буфера із pH від 6,0 до 8,0. Умови для кожного типу хроматографії можуть бути оптимально модифіковані звичайним фахівцем. Відносно конкретних умов хроматографії зразком можуть бути умови, здійснені для прикладу 1-5, описаного далі. Спосіб отримання композиції, яка містить ІДС як активний інгредієнт відповідно до даного винаходу, може додатково містити інактивування вірусів, які можуть бути включеними до складу композиції. Інактивація може бути здійснена різними шляхами і переважно витримуванням культури при pH 3,0-4,0 або при високому значенні pH протягом заздалегідь визначеного проміжку часу. Процес інактивування може відбуватися під час процесу очищення, переважно під час хроматографії і більш переважно між гідрофобною хроматографією і катіонообмінною хроматографією. Після хроматографічних процесів отримана таким чином активна фракція може бути сконцентрована і відфільтрована для збирання ІДС, яка може бути використана як активний інгредієнт фармацевтичної композиції. Композиція може бути змішана із фармацевтично прийнятним носієм і складена у придатну форму дозування. Композиція, яка містить ІДС, приготовану за способом відповідно до даного винаходу, має переваги над загальноприйнятими ІДС композиціями, які полягають у наступному: 1) вона виявляє більш високу фармацевтичну ефективність через більш високий вміст формілгліцину, 2) вона може більш ефективно катаболізувати ГАГ, акумульовані всередині лізосом, 3) у ній відсутня сироватка тваринного походження, і таким чином вона є безпечною і 4) вона є безпечною і ефективною через її чистоту 99,9 % або вище. Переважні ефекти винаходу Композиція, яка містить рекомбінантну ІДС, і лікарський засіб, який містить її, відповідно до даного винаходу, є переважними по фармацевтичній ефективності і безпеці у порівнянні із 5 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 загальноприйнятим агентом Елапраза і таким чином може бути ефективно застосовані для терапії синдрому Хантера. Короткий опис креслень Фіг. 1 є зображенням, яке ілюструє схему конструювання вектора pJK-dhfr-IDS S1, що застосовується для конструювання вектора для експресії ІДС. Фіг. 2 є зображенням, яке ілюструє схему конструювання вектора для експресії ІДС pJK-dhfrOr2-IDS із pJK-dhfr-IDS S1 фіг. 1. Фіг. 3 є блок-схемою, яка ілюструє виділення і очищення ІДС, із трансформованих CHODG44. Фіг. 4 є фотографією, яка демонструє результат ДСН-ПААГ ІДС для аналізу N-кінцевої послідовності, де маркер був розділений в треку M, глікозилована ІДС у треку 1, PNGase F у треку 2 і деглікозилована ІДС у треку 3. Фіг. 5 є блок-схемою, яка ілюструє процес здійснення аналізу амінокислотної послідовності ІДС. Фіг. 6 є зображенням, яке демонструє амінокислотну послідовність ІДС за даним винаходом, як це проаналізовано за допомогою MALDI-MS/MS і LC-ESI-MS/MS. Фіг. 7 є ОФ-ВЕРХ хроматограмою невідновлених і відновлених ІДС зразків, яка демонструє положення дисульфідних зв'язків в ІДС. Фіг. 8 є зображенням, яке демонструє положення дисульфідних зв'язків в ІДС за даним винаходом, проаналізовані за допомогою MALDI-MS. Фіг. 9 є зображенням, яке демонструє положення дисульфідних зв'язків у ІДС за даним винаходом, проаналізовані за допомогою MALDI-MS/MS. Фіг. 10 є зображенням, яке вказує положення дисульфідних зв'язків у ІДС за даним винаходом, отриманим за допомогою MALDI-MS/MS. Фіг. 11 є фотографією, яка демонструє ІДС, розділену в ДСН-ПААГ після обробки різними ферментами глікозидгідролазами для перевірки глікозилування ІДС за даним винаходом. Фіг. 12 є хроматограмами HPAEC-PAD, які демонструють вміст манози-6-фосфату у ІДС за даним винаходом. Фіг. 13 є ексклюзійною хроматограмою, яка демонструє чистоту ІДС за даним винаходом. Фіг. 14 є іонною хроматограмою, яка демонструє каталітичну активність ІДС за даним винаходом на природному субстраті. Фіг. 15 є графіком Лайнуївера-Берка, який демонструє співвідношення клітинного поглинання кількостей ІДС у порівнянні із кількістю ІДС, доданого до клітин нормальних фібробластів. Фіг. 16 є діаграмою, яка демонструє кількість ІДС за даним винаходом, інтерналізовану у клітини нормальних людських фібробластів і клітини хворих, які страждають від синдрому Хантера. Фіг. 17 є зображенням, яке демонструє вимірювання вмісту формілгліцину в ІДС за даним винаходом. Фіг. 18 є зображенням, яке демонструє ІЕФ (ізоелектричне фокусування) точки ІДС за даним винаходом перед і після катіонообмінної хроматографії, де M розділяється у треку M, завантажуваний зразок для катіонообмінної хроматографії у треку 1, елюат катіонообмінної хроматографії у треку 2 і регенерований розчин після катіонообмінної хроматографії у треку 3. Виконання винаходу Більш повне розуміння даного винаходу може бути досягнуте за допомогою наступних прикладів, які наведені для ілюстрації, але не повинні тлумачитися, як обмежуючі даний винахід. Приклад 1: Препарат ІДС Отримання гена Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК, PBMC) виділяли із людської крові, як описано раніше [S. Beckebaum et al., Immunology, 2003, 109:487-495]. Сумарну РНК виділяли із МКПК відповідно до протоколу, описаного раніше [M.J. Holland et al., Clin. Exp. Immunol., 1996, 105:429-435]. Для того, щоб сконструювати кДНК бібліотеку із сумарної РНК, одноланцюгову кДНК синтезували із застосуванням праймера oligo(dT) за допомогою набору для синтезу одноланцюгової кДНК (Boehringer mannheim). У зв'язку із цим оброблену DEPC дистильовану воду додавали у пробірки Еппендорф, які містять 1 мкг сумарної РНК таким чином, щоб утворився кінцевий об'єм 12,5 мкл. Потім 1 мкг 20 пмоль праймера oligo(dT) додавали у пробірку, після чого йшло інкубування при 70 °C протягом 2 хв. і охолоджування. До цієї реакційної суміші додавали 4 мкг реакційного буфера, 1 мкг dNTP, 1 мкг інгібітору рибонуклеаз і 1 мкг зворотної транскриптази, яка потім реагувала при 42 °C протягом однієї години для 6 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 синтезу одноланцюгової кДНК. ПЛР виконували із кДНК як матрицю у присутності праймерів SEQ ID NO: 2-4 для ампліфікації гена людського ІДС. У цьому випадку кожний праймер конструювали так, щоб він містив сайт розпізнавання ферментом рестрикції для застосування у клонуванні генів. Конструювання експресійного вектора А. Конструювання вектора pJK-dhfr-IDS-S1 Сигнальну послідовність легкого ланцюга антитіла (отриманого із частини людського легкого ланцюга IgG) як некодуючу послідовність вбудовували в 5'-кінець гена ІДС, отриманого у прикладі перед ПЛР. Після того, як отриманий за допомогою цього ПЛР продукт розділяли на гелі електрофорезом, людський ген ІДС виділяли із застосуванням набору для виділення із гелю. Виділений ген ІДС і вектор pJK-dhfr-Or2 (Aprogen) розщеплювали EcoRV і ApaI і лігували один із одним при 16 °C протягом 20 годин. Рекомбінантний вектор, отриманий таким чином, трансформували в Е. coli (DH5α), які потім наносили на чашку із LB, яка містить 50 мкг/мл ампіциліну і інкубували протягом ночі. Колонії, які виросли на чашках, відбирали і культивували таким чином, щоб виділити із них плазміду (фіг. 1). В. Конструювання рекомбінантної людської плазміди для експресії ІДС Для того, щоб замінити некодуючу послідовність плазміди, сконструйованої вище, на сигнальну послідовність, рекомбінантну людську ІДС субклонували у векторі JK-dhfr-Оr2. Із цією метою вектор pJK-dhfr-IDS S1 розщеплювали EcoRV і ApaI для отримання неповного гена ІДС (1233 п. о.), який потім вбудовували у вектор pJK-dhfr-Or2, раніше оброблений такими ферментами рестрикції, для конструювання вектора pJK-dhfr-IDS-S2. Для того, щоб ввести некодуючу послідовність і сигнальну послідовність на 5'-кінець, прямий праймер ІДС N1 (SEQ ID NO: 5) і зворотний праймер ІДС 4 (SEQ ID NO: 7) використовували для ПЛР із вектором pJKdhfr-IDS-S1 як матрицю. Після старту при 94 °C протягом 5 хв. ПЛР виконували із 30 циклами із 94 °C протягом 1 хв., 55 °C протягом 30 с і 72 °C протягом 40 с і закінчували подовження при 72 °C протягом 10 хв. ПЛР ампліфікація привела в результаті до неповного гена ІДС, який складався із 448 п. о. Цей ген застосовували як матрицю для ПЛР, яку виконували знову у присутності прямого праймера ІДС N2 (SEQ ID NO: 6) і зворотного праймера ІДС 4 (SEQ ID NO: 7) при таких же умовах, як описано вище. Це привело в результаті до синтезу фрагмента ДНК довжиною 476 п. о. Згодом вектор pJK-dhfr-IDS-S2 і рекомбінантний фрагмент гена людської ІДС (476 п. о.) окремо розщеплювали EcoRV. Продукти розщеплення розділяли в гелі електрофорезом із отриманням вектора і фрагмента ІДС довжиною 476 п. о. Ці вектор і вставку лігували при 16 °C протягом 12 годин у присутності T4 ДНК лігази для конструювання плазміди pJK-dhfr-Or2-IDS. Ці процедури проілюстровані на фіг. 2. Для підтвердження конструювання плазміди для експресії ІДС DH5 трансформували pJKdhfr-Or2-IDS і культивували протягом 24 годин на чашці із LB, яка містить ампіцилін (50 мкг/мл). Із колоній, утворених таким чином, виділяли плазміду і розщеплювали для вимірювання розміру вставки. Також проводили секвенування основ із застосуванням праймера T7 (SEQ ID NO: 8). Відбір рекомбінантного людського штаму для експресії ІДС А. Трансфекція CHO-DG44 CHO-DG44 застосовували як клітину-хазяїна для експресування ІДС за даним винаходом. Мутантна клітина яєчника китайського хом'ячка CHO-DG44 несе подвійну делецію для ендогенного гена dhfr (дигідрофолатредуктаза), який кодує фермент DHFR. Фермент DHFR залучений до перетворення фолату через дигідрофолат (FH2) у тетрагідрофолат (FH4), який залучений до de novo синтезу нуклеїнової кислоти. Рівень dhfr у клітинах залежить від концентрації метотрексату (MTX). Метотрексат, який структурно подібний до фолієвої кислоти, субстрат DHFR, конкурує із фолієвою кислотою за зв'язування дигідрофолатредуктази так, що велика частина дигідрофолатредуктази втрачає свою активність у присутності метотрексату. Отже, якщо клітини не ампліфікують достатню кількість dhfr, вони вмирають, оскільки вони не можуть синтезувати нуклеїнову кислоту, необхідну для їх життя. Навпаки, якщо ампліфікація є достатньою, клітини можуть виживати при високій концентрації метотрексату через те, що в них відносно багато dhfr. Ця система може бути застосована по відношенню до тваринних клітин для відбору трансфікованої клітинної лінії, яка може ампліфікувати ген dhfr і таким чином цільовий структурний ген. З цією метою ген dhfr вбудовували як ампліфікований маркер у вектор для експресії ІДС pJK-dhfr-Or2-IDS, отриманий в прикладі 1-2, і проводили ампліфікацію гена із використанням метотрексату і гена dhfr. 7 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У зв'язку із цим клітинну лінію DG44 (отриману від Dr. Chaisin, Columbia University) суспендували 10 мл DMEM/F12 (доповненої нуклеотидами і нуклеозидами і 10 % фетальної бичачої сироватки (FBS)) і збирали центрифугуванням при 1000 об./хв. протягом 5 хв. Клітини інокулювали в 50 мл культурального середовища у колбу Т-175 і інкубували при 37±1 °C в інкубаторі із 5±1 % CO2. За один день перед трансфекцією культуральне середовище для клітини DG44 видаляли із колби Т-175, і клітини промивали два рази PBS і від'єднувати 5 трипсинізацією. Потім їх сіяли із щільністю 5×10 клітин у колбу Т-25 і культивували при 37±1 °C протягом 24 годин у інкубаторі із 5±1 % CO2. Бактерійне або грибкове зараження перевіряли під оптичним мікроскопом, виконували ПЛР-ELISA для перевірки того, чи заражені клітини мікоплазмою. Безмікробні клітини DG-44 трансфікували вектором для експресії ІДС pJK dhfr-Or2-IDS, отриманим у прикладі 1-2, із застосуванням набору із ліпофектаміном. У зв'язку із цим 5 мкг експресійного вектора і 50 мкг ліпофектаміну окремо розбавляли у 800 мкг Opti-MEM 1, обережно змішували так, щоб не утворилося пузирів і залишали при кімнатній температурі протягом 15 хв. У той же час клітини DG44 промивали один раз стерильною PBS і три рази OptiMEM 1. До клітин DG44 обережно додавали суміш ДНК-ліпофектамін і потім 6,4 мл Opti-MEM перед інкубуванням при 37±1 °C протягом 5 годин в інкубаторі із 5±1 % CO2. Після цього інкубування проводили протягом додаткових 48 годин у середовищі, доповненому 8 мл DMEM/F12 і 1,6 мл FBS для стимулювання відновлення клітинних мембран і росту клітин. В. Відбір стійкого до генецитину (G418) клітинного штаму Культивовані клітини від'єднували 0,25 % трипсином, підраховували і засівали із щільністю 3 5×10 клітин/ямка у 96-ямкові планшети, які містять 100 мкг середовища MEM-alpha (доповненого 10 % діалізованою FBS і 550 мкг/мл G418) із розрахунку на ямку. На наступний день таке ж середовище додавали у кількості 100 мкг/ямка і клітини культивували протягом 2-3 тижнів до утворення колоній. Коли клітини виростали до 50 % конфлюентності, середовище замінювали на свіже. Після витримування протягом 3 днів культуральні середовища збирали для ферментного аналізу. Середовище замінювали 200 мкг свіжим середовищем кожні три дні. На день 3-4 після культивування нетрансфіковані клітини, тобто, клітини, які не були стійкі до генецитину, починали від'єднувати від дна 96-ямкових планшетів при спостереженні під оптичним мікроскопом. Відібрані клони культивували із послідовним перенесенням по порядку із 96ямкових планшетів на 24-ямкові планшети, 6-ямкові планшети і 100-мм чашки. Коли клітини виростали до конфлюентності 80-90 % в 100-мм чашках, рівень експресії вимірювали знову. 5 Клітини від'єднували 0,25 % трипсином, підраховували і висіювали із щільністю 5×10 клітин/ямка/3 мл в 6-ямкові планшети, зберігали протягом 3 днів і підраховували. Рівень експресії білка аналізували кількісно. Відповідно до результату аналізу відбирали 15 клонів. С. Відбір експресуючого ІДС штаму із високим рівнем експресії 15 відібраних клонів культивували із збільшеною концентрацією метотрексату для відбору клітинних штамів, у яких був ампліфікований ІДС. 6 У цьому випадку клітини інокулювали із щільністю 1×10 клітин/100 мм чашку/10 мл середовища, яке містить метотрексат, і культивували до конфлюентності 80-90 %. Одну десяту об'єму клітинної культури інокулювали знову у 100 мм чашку/10 мл. Цей процес субкультивування повторювали два рази. Клітинам дозволяли зазнати впливу щонайменше трьох пасажів так, що вони були досить адаптовані до збільшених концентрацій метотрексату. Концентрацію метотрексату збільшували від 5 нМ для клонів, відібраних після проведення аналізу протягом перших трьох днів, до 20 нМ. На кожній стадії клони, адаптовані до збільшених концентрацій метотрексату, культивували протягом трьох днів для вимірювання швидкостей клітинного росту. Рівні експресії ІДС вимірювали для відбору клітинних штамів, у яких відбулася ампліфікація гена ІДС, тобто, клітинних штамах, у яких рекомбінантна ІДС була експресована із високою швидкістю. Із відібраних клітинних штамів N14 застосовували у подальших експериментах через те, що він мав найбільший рівень експресії. D. Відбір окремого штаму для граничного розведення Існувала імовірність того, що штам N14 міг стати змішаним із іншими штамами. Отже, штам виділяли в окремий штам. Клони N14, які виживали при 20 нМ метотрексаті субклонували за допомогою граничного розведення таким чином, щоб відібрати необхідний клітинний штам. Спершу N14 інокулювали із щільністю 0,5 клітин/ямка у середовище IMDM (Gibco BRL, Cat#12200) у 96-ямкові планшети і культивували із середовищем, яке доповнюється кожні три дні. На третій день планшети спостерігали під мікроскопом для виключення ямок, у яких було сформовано дві або більше колонії із розрахунку на ямку. Ямки, у яких була сформована тільки одна колонія із розрахунку на ямку, відбирали і продовжували культивувати. Після 8 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 культивування протягом 15 днів клітини субкультивували у 96-ямкових планшетах і, коли клітини росли до конфлюентності 90 %, середовище оновлювали. У загальній складності 263 індивідуальних штами ідентифікували із штаму N14. Було виявлено, що із них штам S46 мав найбільшу ІДС активність, і він був названий N14-S46. Клітинне культивування А. Культивування у колбах для струшування Штам N14-S46 культивували у великих масштабах для вироблення ІДС за даним винаходом. Штам інокулювали у безсироваткове середовище EX-cell 302 (яке містить глутамін, сульфат декстрану і плюронік F-68) у 125-мл колбах для культивування і культивували при 37±1 °C в інкубаторі із 5±1 % CO2. Потім клітини пересіювали у співвідношенні 1:5-1:8 кожні два або три дні із використанням колб для струшування. При пасажі культуральний об'єм поступово збільшували до приблизно 2400 мл. У багатьох колбах для струшування клітини культивували до рівня, достатнього для інокулювання в ферментатор. В. Культивування у 30-л ферментаторі (робочий об'єм 20 л) 6 Коли щільність клітин в колбах для струшування досягала 1,3×10 клітин/мл, їх інокулювали у 30-л ферментатор. Під час клітинного культивування культуральні умови утримувалися наступними: вміст розчиненого кисню 10 % або вище, температура культивування 37±1 °C і pH 7,0±0,2. Якщо було потрібно, відбирали зразки клітин і спостерігали під мікроскопом. Клітинну культуру перевіряли для аналізу кількості клітин, життєздатності клітин, pH, концентрації глюкози і концентрації глутаміну. На основі результатів аналізу, коли було визначено, що клітини досить виросли, клітини інокулювали у 150-л ферментатор. С. Культивування у 150-л ферментаторі (робочий об'єм 100 л) 6 Коли клітини у 30-л ферментаторі досягали щільності 0,9×10 клітин/мл або вище, їх інокулювали у 150-л ферментатор. Під час клітинного культивування підтримувалися наступні культуральні умови: вміст розчиненого кисню 10 % або вище, температура культивування 37±1 °C і pH 7,0±0,2. Якщо було потрібно, відбирали клітинні зразки і спостерігали під мікроскопом. Клітинну культуру перевіряли для аналізу кількості клітин, життєздатності клітин, pH, концентрації глюкози і концентрації глутаміну. На основі результатів аналізу, коли було визначено, що клітини досить виросли, клітини інокулювали у 650-л ферментатор. D. Культивування у 650-л ферментаторі (робочий об'єм 500 л) 6 Коли клітини у 150-л ферментаторі досягали щільності 0,9×10 клітин/мл або вище, їх інокулювали у 650-л ферментатор. Під час клітинного культивування підтримувалися наступні культуральні умови: вміст розчиненого кисню 10 % або вище, температура культивування 34±1 °C і pH 6,9±0,2 протягом трьох днів і потім при температурі культивування 32±1 °C і pH 6,9±0,2. Якщо було потрібно, відбирали клітинні зразки і спостерігали під мікроскопом для аналізу кількості клітин, життєздатності клітин, pH, концентрацій глюкози і концентрацій глутаміну. Залежно від результату аналізу концентрації глюкози і глутаміну регулювали для продовження клітинного росту. Під час ферментування додавали гідролізат для збільшення перетворення у формілгліцин. Очищення ІДС ІДС виділяли із клітинної культури із застосуванням послідовності наступних чотирьох хроматографічних процесів. А. Збір і фільтрація культурального середовища Коли життєздатність клітин зберігалася у діапазоні 80-85 % через 10 днів після інокуляції у 650-л ферментатор, культивування зупиняли. Клітини збирали із культури із використанням фільтруючої системи Millipore POD і фільтра DOHC (Millipore) при тиску 0,9 бар або менше. Після видалення клітин супернатант відфільтровували через передфільтр (Millipore, 0,5±0,2 мкм) і 0,45±0,2 мкм фільтр і вміщували у одноразовий стерильний вініловий пакет. Зібраний культуральний розчин зберігали при 2-8 °C. В. Концентрація і діафільтрація Фільтрат, рекуперований в А, сконцентрували приблизно у 10 разів із використанням ультрафільтраційної системи (мембранна система фільтрації у тангенціальному потоці). Мембрану (обмеження: 30K, Pall), встановлену всередині ультрафільтраційної системи, промивали WFI (вода для ін'єкцій) із швидкістю потоку 20-25 л/хв. і потім врівноважували буфером (pH 7,0-8,0), який містить 20 мм фосфату натрію (моногідрат дигідрофосфату натрію і гептагідрат гідрофосфату натрію). Після врівноваження фільтрат подавали на мембрану із рекуперацією фракцій, які не проходили через мембрану. Коли рекуперований об'єм ставав приблизно 1/10 від первинного об'єму фільтрату, процедуру концентрації зупиняли. Об'єм буфера послідовно замінювався від трьох до чотирьох разів до об'єму концентрату. Якщо 9 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 електропровідність і pH потрапляли в межі критеріїв, процес зупиняли, [критерії електропровідність: =5,0 мСм/см, pH 7,0-8,0]. С. Аніонообмінна хроматографія Для видалення барвників і різних домішок із концентрату, рекуперованих в В, проводили аніонообмінну хроматографію на колонці (GE Healthcare), наповненій Q-сефарозними смолами (GE Healthcare). Колонку врівноважували врівноважуючим буфером (pH 7,0-8,0), який містить 20 мМ фосфату натрію (моногідрат дигідрофосфату натрію і гептагідрат гідрофосфату натрію). Концентрат, отриманий в В, фільтрували через 0,45±0,2 мкм фільтр (Sartorius) і завантажували із швидкістю потоку 100-120 см/год. на врівноважену колонку. Після того, як завантаження було завершено, колонку спочатку промивали врівноважуючим буфером і потім промивальним буфером (pH 5,5-7,5), який містить хлорид натрію. Згодом білок-мішень елюювали елююючим буфером (pH 5,5-7,5), який містить хлорид натрію. D. Гідрофобна хроматографія Для видалення барвників і домішок, які залишилися після аніонообмінної хроматографії, гідрофобну хроматографію виконували на колонці (GE Healthcare), наповненій фенілсефарозними смолами (GE Healthcare). Колонку врівноважували врівноважуючим буфером (pH 5,0-7,0), який містить хлорид натрію. Елюат, отриманий в С, фільтрували через фільтр 0,45±0,2 мкм (Sartorius) і завантажували із швидкістю потоку 70-100 см/год. на врівноважену колонку. Після того, як завантаження було завершено, колонку промивали врівноважуючим буфером. Згодом білок-мішень елюювали елююючим буфером (pH 5,0-7,0), який містить гліцерин. Е. Інактивація вірусу низьким pH Віруси, які можуть бути отримані із клітин хазяїна або будь-якого матеріалу, який застосовується у здійснюваних процесах, інактивували умовами низького pH. У зв'язку із цим елюат, отриманий в D, витримували протягом 2 годин при pH 3,0-4,0, до якого його кислотність доводили 25 % оцтовою кислотою. Після цього pH елюату збільшували до 4,0-5,0 із використанням 0,5 M гідроксиду натрію для застосування у наступному процесі. Інактивацію низьким pH проводили при 12±2 °C. F. Катіонообмінна хроматографія ІДС являє собою глікопротеїн із олігосахаридами і існує у вигляді ізомеру, який має відмінну ізоелектричну точку відповідно до вмісту сіалової кислоти на кінці гліканового ланцюга. Як олігосахариди із негативним зарядом сіалова кислота демонструє відмінність із точки зору міри зв'язування із катіообмінною смолою відповідно до вмісту сіалової кислоти. Із використанням цих характеристик проводили катіонообмінну хроматографію для отримання ІДС, яка демонструє високу активність (високий вміст формілгліцину) із високим вмістом сіалової кислоти і для видалення інших домішок [забруднення продукту (агрегована ІДС, оброблена ІДС), забруднення процесу (білок клітини-хазяїна)]. Більш детально колонку, наповнену катіообмінними смолами Capto™MMC (GE Healthcare), врівноважували врівноважуючим буфером із додаванням гліцерину (pH 4,0-5,0). Інактивований елюат, отриманий в Е, фільтрували через фільтр 0,45±0,2 мкм (Sartorius) і завантажували із швидкістю потоку 100-120 см/год. на врівноважену колонку. Згодом колонку промивали врівноважуючим буфером, після чого слідувала елюція елююючим буфером із доданим гліцерином (pH 4,0-6,0) із отриманням ІДС із високим вмістом сіалової кислоти (ізоелектрична точка 3,5 або менше), високою активністю (вміст формілгліцину: 80±15 %) і високою чистотою (ексклюзійна ВЕРХ, 98 % або вище). G. Афінна хроматографія Афінну хроматографію (блакитна сефароза, GE Healthcare) проводили для видалення гліцерину, який застосовується в катіонообмінній хроматографії і для зменшення об'єму елюату. Елюат, отриманий в F, фільтрували через фільтр 0,45±0,2 мкм (Sartorius) і завантажували із швидкістю потоку 100-120 см/год. в колонку, наповнену смолою блакитна сефароза (GE Healthcare), яку раніше врівноважували врівноважуючим буфером (pH 4,5-5,5) із доданим гліцерином. Після завершення завантаження колонку промивали промивальним буфером (pH 4,5-5,5) і цільовий білок елюювали елююючим буфером (pH 6,0-8,0). Н. Концентрація і заміна буфера Застосовували ультрафільтраційну систему (система мембранної фільтрації у тангенціальному потоці) для доведення концентрації білка в елюаті, отриманому в G, і для заміни буфера очищеного білка буфером лікарського засобу. Мембрану (обмеження: 10K, Pall), встановлену всередині ультрафільтраційної системи, промивали WFI (вода для ін'єкцій) із швидкістю потоку 450-650 мл/хв. і потім врівноважували буфером лікарського засобу (2,25 г/л моногідрату дигідрофосфату натрію, 0,99 г/л гептагідрату гідрофосфату натрію, 8 г/л хлориду 10 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 натрію, pH 6,0-7,0) без полісорбату 20, після чого йшло концентрування цільового білка. Об'єм буфера послідовно міняли від трьох до чотирьох разів для концентрації. Якщо електропровідність і pH потрапляли в межі критеріїв, процес зупиняли [критерії електропровідність: 15,0±3,0 мСм/см, pH 6,0-7,0]. Доводили вміст сконцентрованого розчину до 4,0±0,5 мг/мл. I. Нанофільтрація Із використанням нанофільтра (NFP, Millipore) виконували нанофільтрацію для видалення вірусів, які могли потрапити із клітини-хазяїна або будь-якого іншого матеріалу, який застосовується. Тест на цілісність для фільтра виконували після промивання нанофільтра водою для ін'єкцій. Після того, як тест на цілісність був проведений, нанофільтр врівноважували 1 л буфера лікарського засобу (2,25 г/л моногідрату дигідрофосфату натрію, 0,99 г/л гідрофосфату натрію, 8 г/л хлориду натрію, pH 6,0-7,0) без полісорбату 20. Після завершення врівноваження концентрат, отриманий в Н, пропускали через фільтр при тиску приблизно 2 бар із отриманням нанофільтрату. Після того, як фільтрація була завершена, фільтр промивали буфером лікарського засобу (постпромивальний розчин). Після комбінування нанофільтраційного розчину і постпромивального розчину вимірювали вміст білка. J. Лікарський засіб Концентрацію білка у фільтраті, отриманому в I, коректували буфером лікарського засобу без полісорбату 20. Після додавання полісорбату розчин фільтрували через фільтр 0,2 мкм із отриманням лікарського засобу. Лікарський засіб розділяли на аліквоти і зберігали у низькотемпературному морозильному апараті (-70±10 °C) до використання. K. Лікарський продукт (заповнення, етикетування, упаковка) Запас, який зберігається у низькотемпературному морозильному апараті, розморожували у водяній бані із температурою 28±1 °C і розбавляли до концентрації білка приблизно 2,05±0,2 мг/мл із використанням буфера лікарського засобу (2,25 г/л моногідрату дигідрофосфату натрію, 0,99 г/л гептагідрату гідрофосфату натрію, 8 г/л хлориду натрію, 0,23 г/л полісорбату 20, pH 6,0-7,0). Після цього розбавлений розчин фільтрували через фільтр 0,2 мкм із отриманням кінцевого нерозфасованого розчину. Цей кінцевий нерозфасований розчин наповнювали в 6-мл флакон із приблизно 3,3 г із застосуванням автоматичного заповнення. Після проходження контрольної перевірки флакона флакони упаковували із отриманням лікарського продукту. Процедура від культивування штаму до виробництва кінцевого продукту проілюстрована на фіг. 3. Порівняльний приклад 1: Препарат Елапрази Як порівняльний приклад застосовували Елапразу®, комерційно доступну рекомбінантну ІДС. Експериментальний приклад 1: Структурний аналіз і характеризація ІДС за винаходом Амінокислотне секвенування - повне секвенування Деглікозиловану ІДС розділяли ДСН-ПААГ, після чого йшло розрізання гелю. Потім продукти розщеплення, отримані в результаті обробки різними ендопротеазами (трипсин, хімотрипсин, AspN, хімотрипсин/трипсин, AspN/трипсин, GluC і GluC/трипсин) аналізували із застосуванням MALDI-MS/MS і LC-ESI-MS/MS (фіг. 5). У результаті ідентифікували загалом 525 амінокислотних послідовностей. Амінокислотні послідовності співпадали із теоретичною послідовністю людської ІДС (фіг. 6). Аналіз дисульфідних зв'язків У поліпептиді дисульфідний зв'язок є ковалентною сполукою, яка звичайно отримується зв'язуванням двох SH груп цистеїнових залишків, які відіграють важливу роль у стабілізації структури високого порядку у білків. Теоретично 525 амінокислот ІДС містять шість цистеїнових залишків, чотири із яких утворюють дисульфідні зв'язки. У цьому прикладі ідентифікували розташування цистеїнових залишків, відповідальних за дисульфідні зв'язки ІДС. Спочатку ІДС деглікозилували обробкою PNGase F для виключення інтерференції цукрів. Для того, щоб запобігти дії цистеїнових залишків, які не беруть участі в утворенні дисульфідних зв'язків, як інтерферуючий фактор, застосовували 4-вінілпіридин для перетворення ІДС у невідновлений зразок так, щоб SH-групи були обмеженими від безладного утворення S-S зв'язків. У той же час дисульфідні зв'язки розщеплювали ДТТ, після чого йшло блокування 4-вінілпіридином із отриманням відновленого зразка. Трипсин і AspN, відібрані в результаті експериментального прикладу 1-3, застосовували відносно невідновленого і відновленого зразка. Отримані таким чином пептидні фрагменти розділяли за допомогою ОФ-ВЕРХ. Хроматограми ОФ-ВЕРХ невідновленого і відновленого зразків порівнювали таким чином, щоб розпізнати піки, які виявили у невідновленому зразку, але не виявили у відновленому зразку (фіг. 7). 11 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 Для більш точного аналізу фракції у розпізнаних піках зменшували по розміру додатковою обробкою ендопептидазами і піки, які містять дисульфідні зв'язки, аналізували із застосуванням MALDI-MS (фіг. 8). Знову аналізували послідовність піків із дисульфідними зв'язками із застосуванням MALDIMS/MS (фіг. 9) для перевірки положень цистеїнових залишків, які утворять дисульфідні зв'язки серед 525 амінокислотних залишків ІДС. Як показано на фіг. 10, спостерігали, що дисульфідні зв'язки утворювалися між C146-C159 і між C397-C407. Аналіз вмісту формілгліцину ІДС руйнує гепарансульфат і дерматансульфат, обидва із яких є видом глікозаміноглікану (ГАГ). Ця руйнуюча активність не досягається, до того, як цистеїновий залишок у положенні 59 в активному сайті (Cys59) не перетворюється у формілгліцин (FGly) посттрансляційною модифікацією. Таким чином, деградуючу активність ІДС аналізували перевіркою посттрансляційної модифікації Cys59 в FGly. Для цього аналізу застосовували AQUA (абсолютний кількісний аналіз), спосіб кількісного аналізу на основі MS (Mass Spectroscopy), у якому радіоізотопномічений синтетичний субстрат (пептид AQUA) прикріплювали до зразка. Для кількісного аналізу формілгліцину у положенні Cys59 до зразка додавали серійне розведення пептиду AQUA і будували калібрувальну криву. Відношення пептиду типу FGly до пептиду типу Cys вимірювали LC-ESI-MS аналізом і наносили на калібрувальну криву AQUA для розрахунку вмісту формілгліцину. У цьому аналізі визначали перетворення Cys59 в FGly із рівнем 80±15 %. Беручи до уваги рівень перетворення Cys50 в FGly приблизно 50 % в комерційно доступному агенті Елапраза (Elaprase Science Discussion, EMEA, 2007; Genet. Med. 2006:8(8):465-473) передбачається, що терапевтична композиція, яка містить ІДС за даним винаходом, і лікарський засіб, приготований із композицією, мають набагато більшу терапевтичну активність в порівнянні із Елапразою. Ідентифікація профілю глікозилування Виконували випробування для перевірки того, чи є ІДС за даним винаходом глікозилованим і для ідентифікації профілю глікозилування, якщо він глікозилований. Із цією метою ІДС обробляли різними глікозидгідролазними ферментами, продукти розщеплення розділяли на ДСН-ПААГ і аналізували характер їх рухливості. Більш детально ІДС зразки розщеплювали комбінаціями наступних чотири глікозидгідролазних ферментів і розділяли електрофорезом в ДСН-ПААГ. Таблиця 1 Властивості ферментів, які розщеплюють цукор PNGase F Endo Н О-глікозидаза Сіалідаза 35 40 45 Функція/Властивість Відщеплює цукрову групу (N-глікан) від білка Asn у сайті розщеплення перетворений в Asp Відщеплює цукрову групу (N-глікан) від білка на відміну від PNGase F, Endo Н діє на олігосахариди із високим вмістом манози і гібридного типу Відщеплює цукрову групу (О-глікан) від білка Відщеплює кінцеві залишки сіалової кислоти N-глікану або О-глікану Як видно на фіг. 11, ІДС за даним винаходом розщеплювалася PNGase F і Endo Н, але не О-глікозидазою, яка вказує на те, що ІДС за даним винаходом являє собою N-глікозилований білок. Крім того, ІДС повністю розщеплювалася PNGase F, але зменшення її розміру було незначним при обробці Endo Н. PNGase F впливає на сайти глікозилування всіх трьох моделей, тоді як Endo Н впливає на сайти глікозилування із високим вмістом манози і гібридного типу. У сукупності ці результати вказують на те, що ІДС містить три профілі глікозилування: комплексний, високоманозний і гібридний. Аналіз вмісту манози-6-фосфату Зв'язування із M6P рецептором на клітинах манози-6-фосфату (M6P) дозволяє ІДС бути інтерналізованою в клітини і таким чином гідролізувати гепарансульфат або дерматансульфат в лізосомах. У цьому прикладі ІДС був кислотно гідролізований із трифтороцтовою кислотою (ТФК) і підданий HPAEC-PAD (Bio-LC) для кількісного аналізу манози-6-фосфату. ІДС гідролізували 6,75M ТФК, і гідролізат аналізували із застосуванням рідинної хроматографії (високоефективна аніонообмінна хроматографія із імпульсним амперометричним детектування; HPAEC-PAD). M6P, концентрація якої була вже відома, аналізували при таких же 12 UA 109949 C2 умовах, і молярні відношення M6P до глікопротеїну отримували порівнянням площ. Аналіз проводили в трьох повторах. Хроматограми стандартних речовин M6P і M6P композиції ІДС показані на фіг. 12, і молярні відношення M6P підсумовані у таблиці 2, нижче. Таблиця 2 Аналіз результатів для вмісту манози-6-фосфату № 13 14 15 Серед. CV Кількість пмоль/25 мкм М-6-P 1320,59 1241,31 1245,83 1269,25 3,51 M-6-P Час утримання (хв.) 11,25 11,23 11,23 11,24 0,09 % Кількість пмоль/25 мкм білка 428 428 428 428 Відношення М-6-P/білок (моль/моль) 3,09 2,90 2,91 2,97 0,11 5 10 15 Із даних таблиці 2 очевидно, що має місце приблизно 3 моль M6P із розрахунку на моль ІДС. Із цих результатів може бути зроблений висновок, що терапевтична композиція, яка містить ІДС за даним винаходом, і лікарський засіб, приготований із композицією, мають високу здатність катаболізувати ГАГ, акумульовані у лізосомах. Масовий аналіз Маса глікозилованої ІДС і деглікозилованої ІДС вимірювали із застосуванням MALDI-TOFMS. Обробка глікозилованої ІДС PNGase F приводила в результаті до деглікозилованої ІДС. MALDI-TOF-MS виконували із застосуванням Voyager-DE PRO Biospectrometry (Applied Biosystems, USA) в поєднанні із екстракційним лазерним мас-спектрометром із уповільненою десорбцією. Цей вимірювач був нормалізований із бичачим сироватковим альбуміном і IgG1. Результати аналізу підсумовані в таблиці 3, нижче. Таблиця 3 Результати аналізу ІДС MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS m/z 25646 38708 77360 154533 Середнє m/z 29767 34655 59313 118706 Середнє Глікозилована ІДС Заряд (z) Маса білка (Да) 3 76935 2 77414 1 77359 1 77266 77244±210 Деглікозилована ІДС Заряд (z) Маса білка (Да) 2 59532 25 Димер Примітка PHGase F 59312 59353 Димер 59399±120 Молекулярна маса 59298 Да 77244±210 Да 59399±120 Да 1 1 Зразок Теоретична Глікозилована Деглікозилована 20 Примітка Як видно із даних таблиці 3 молекулярна маса становить 77244 Да для глікозилованої ІДС і 59399 Да для деглікозилованої ІДС, яка є схожою із молекулярною масою, розрахованою на основі амінокислотної послідовності, яка становить 59298 Да. Оцінка чистоти Чистоту ІДС вимірювали із застосуванням ексклюзійної хроматографії. Ексклюзійна хроматографія являє собою хроматографічний спосіб, у якому молекули в розчині розділяються по їх відносній молекулярній масі і формі. У ексклюзійній хроматографії білки, більші, ніж розмір 13 UA 109949 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пор колонки, не можуть проникати через систему пор і проходять через колонку відразу. Отже, аналіти із меншими молекулярними масами і розмірами елююються пізніше. Для цієї хроматографії застосовували систему ВЕРХ Alliance 2695 (Waters, WI, USA) в поєднанні із детектором 2487 UV/VIS (Waters, WI, USA). Білки детектували при 214 нм і аналізували із використанням програмного забезпечення Empower 2. Аналіти завантажували на колонку TSK G3000SWXL, сполучену із колонкою TSK SWXL guard (Tosoh, Japan). ІДС після розбавлення до концентрації 1,0 мг/мл в буфері лікарського засобу завантажували в об'ємі 10 мкм на колонку. Дозволяли протікати із рухомою фазою (20 мМ натрій-фосфатний буфер, 200 мм NaCl, pH 7,0) із швидкістю потоку 0,5 мл/хв. протягом 60 хв. Результати аналізу показані на фіг. 13. Як можна бачити, мономери ІДС мали час утримання приблизно 16,4 хв. і елюювалися із 100 % чистотою. Вимірювання активності із застосуванням синтетичного субстрату Реакція ІДС із синтетичним субстратом (4-метилумбеліферил-L-ідуронід-2-сульфат Na2 (MUIdoA-2S) протягом 4 годин вивільняє сульфатну групу (первинна реакція). Після первинної реакції додавання LEBT (лізосомальні ферменти, очищені із бичачих насінників) індукує повторну ферментативну реакцію із субстратом 4-метилумбеліферил-L-ідуронід (реагент, який залишився після вивільнення сульфатної групи в первинній реакції) для відділення метилумбеліферильної групи від L-ідуронідної групи. Оскільки 4-метилумбеліферил, що залишився, є флуорогенним, активність ІДС оцінювали вимірюванням інтенсивності флуоресценції (Ex.355 нм/Em.460 нм). У ІДС за даним винаходом було виявлено варіювання специфічної активності від 19 до 55 нмоль/хв./мкг. Ця активність вказує на те, що формілгліцин присутній у активному сайті ферменту в результаті посттрансляційної модифікації цистеїнового залишку у положенні 59 в ІДС. Вимірювання активності із використанням природного субстрату Для того, щоб визначити, чи протікає реакція із ІДС і природним субстратом, вимірювали сульфат-іони, вивільнені із субстрату (дисахарид гепарин) реакцією із ІДС. Реакційну суміш завантажували на іонну колонку (Vydac 302IC) і дозволяли протікати із рухомою фазою, фталева кислота 0,49 г/л, із швидкістю потоку 2 мл/хв., під час чого вільні сульфат-іони детектували при 290 нм у негативному режимі. Як показано на фіг. 14, підтверджували, що ІДС гідролізувала сульфат-іон із дисахариду гепарину, що вказує на те, що ІДС здатна руйнувати О-зв'язаний сульфат дерматансульфату і гепарансульфату in vivo. In vivo активність клітинного поглинання Клітинну інтерналізаційну активність ІДС вимірювали із використанням клітин нормальних фібробластів і клітин хворих синдромом Хантера. У зв'язку із цим клітини нормальних фібробластів і клітини хворих синдромом Хантера (отримані в Samsung Medical Center, Seoul, Korea) культивували і дозволяли інтерналізацію в клітини при інкубації із різними концентраціями ІДС при 37 °C протягом 20 годин в інкубаторі 5 % CO2. Після збору клітини лізували і в лізаті визначали рівень ІДС, інтерналізованої в клітини. На основі концентраційного відношення інтерналізованої ІДС до ІДС, доданої до клітин нормальних фібробластів, будували діаграму Міхаеліса-Ментен і графік Лайнуївера-Берка, із чого розраховували, що Kпоглинання (концентрація ІДС, при якій швидкість реакції дорівнювала половині максимальної швидкості, що досягається при насичуючій концентрації субстрату) становила 18,0 нМ або менше, що вказує на те, що ІДС інтерналізована в клітини зв'язуванням M6P ІДС із M6P рецепторами на клітинній поверхні (фіг. 15). Також аналізували клітинне поглинання і активність ІДС у клітинах хворого синдромом Хантера, а також клітинах нормальних людських фібробластів. Поглинання і активність ІДС були збільшеними в обох клітинах, що демонструє те, що ІДС за даним винаходом більш ефективне інтерналізована в клітини (фіг. 16). Експериментальний приклад 2: Клінічний аналіз ефекту ІДС Тридцять одного хворого із синдромом Хантера ділили на три групи, вводили ІДС за даним винаходом і аналізували параметри, пов'язані із синдромом Хантера. Елапразу®, комерційно доступний терапевтичний агент від синдрому Хантера, застосовували як позитивний контроль. Зміна рівня ГАГ у сечі (первинний контрольний параметр для перевірки правильності) Трьом групам хворих синдромом Хантера 24 тижні вводили Елапразу (0,5 мг/кг) і ІДС за даним винаходом (0,5 мг/кг і 1,0 мг/кг) і вимірювали рівні ГАГ (глікозаміноглікан) у сечі, як описано раніше (Conn. Tissue Res. Vol.28, pp 317-324, 1990.; Ann. Clin. Biochem. Vol.31, pp 147152, 1994). Вимірювання підсумовані в таблиці 4, нижче. 14 UA 109949 C2 Таблиця 4 Зміна рівня ГАГ у сечовині при введенні ІДС Група Зміна рівня ГАГ в сечі (%) 5 10 Елапраза (0,5 мг/кг) -18,7 ІДС за винаходом (0,5 мг/кг) -29,5 ІДС за винаходом (1,0 мг/кг) -41,1 У хворих синдромом Хантера, як показано в таблиці 4, рівні ГАГ в сечі були зменшені на 18,7 % при ін'єкції Елапразою, але на 29,5 % при ін'єкції ІДС за даним винаходом в тій же дозі. Крім того, при ін'єкції із дозою 1,0 мг/кг, ІДС за даним винаходом знижувала рівень ГАГ у сечі на аж до 41,1 %. Такі результати демонструють, що ІДС, за даним винаходом, є ефективним терапевтичним засобом від синдрому Хантера, захворювання, яке викликається в результаті накопичення ГАГ. 6-MWT [тест 6-хвилинної ходьби] Зміна (повторний контрольний параметр для перевірки правильності) Після того, як хворим синдромом Хантера вводили Елапразу і ІДС за даним винаходом протягом 24 тижнів, вимірювали відстані, які вони проходили за 6 хвилин відповідно із способом, описаним в AM. J. Respir. Crit. Care. Med., Vol 166, pp 111-117, 2002. Результати наведені в таблиці 5, нижче. 15 Таблиця 5 Результати тесту 6-MWT Група 6-MWT відстань (м) 6-MWT зміна (%) 20 25 30 ІДС за винаходом (0,5 мг/кг) 67,6 18,2 Елапраза (0,5 мг/кг) 5,9 1,3 ІДС за винаходом (1,0 мг/кг) 52,8 13,4 Як показано в таблиці 5, зміна 6-WMT становила тільки 1,3 % для хворих, яким вводили Елапразу, але збільшувалося до 18,2 % для хворих, яким вводили таку ж дозу ІДС за даним винаходом. Хворі із синдромом Хантера мали складності із ходьбою із-за контрактури. Однак ІДС за даним винаходом поліпшує симптоми і таким чином є ефективним для лікування синдрому Хантера. Список послідовностей SEQ ID NO: 1 амінокислотна послідовність ІДС SEQ ID NO: 2 послідовність прямого праймера ІДС-1 SEQ ID NO: 3 послідовність прямого праймера ІДС-2 SEQ ID NO: 4 послідовність зворотного праймера ІДС-3 SEQ ID NO: 5 послідовність прямого праймера ІДС-N1 SEQ ID NO: 6 послідовність прямого праймера ІДС-N2 SEQ ID NO: 7 послідовність зворотного праймера ІДС-4 SEQ ID NO: 8 послідовність прямого праймера T7 15 UA 109949 C2 16 UA 109949 C2 17 UA 109949 C2 18 UA 109949 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 1. Композиція для лікування синдрому Хантера, яка містить як активний інгредієнт ідуронат-2сульфатазу (ІДС), що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, де цистеїновий залишок у положенні 59 в амінокислотній послідовності ІДС перетворений у формілгліцин (FGly) у молярному співвідношенні 65 % або вище. 2. Композиція за п. 1, де цистеїновий залишок у положенні 59 в амінокислотній послідовності ІДС перетворений у FGly у молярному співвідношенні 75 % або вище. 3. Композиція за п. 1, де ІДС, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, містить манозо-6-фосфат у кількості від 2,0 до 4,0 моль із розрахунку на моль ІДС. 4. Композиція за п. 3, де ІДС, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, містить манозо-6-фосфат у кількості від 2,5 до 3,0 моль із розрахунку на моль ІДС. 5. Лікарський засіб для лікування синдрому Хантера, який містить композицію за будь-яким із пп. 1-4. 6. Лікарський засіб за п. 5, який містить: фармацевтично прийнятний носій; і речовину, яка вибрана із групи, що складається із буфера, вуглецю, стабілізатора, антиоксиданта, бактеріостатиків, хелатуючого агента, ад'юванта, суспендуючого агента, загусника і консерванта. 7. Спосіб отримання композиції для лікування синдрому Хантера, який включає: (1) культивування рекомбінантного клітинного штаму, трансформованого геном, який кодує ІДС, представлену SEQ ID NO: 1, і отримання культури; і (2) очищення культури за допомогою аніонообмінної хроматографії, гідрофобної хроматографії, катіонообмінної хроматографії і афінної хроматографії. 8. Спосіб отримання композиції для лікування синдрому Хантера, який включає: (1) трансформування клітини-хазяїна експресійним вектором, який несе ген ІДС, для отримання рекомбінантного клітинного штаму; (2) культивування рекомбінантного клітинного штаму в присутності гідролізату у безсироватковому середовищі і отримання культури; (3) очищення ІДС із культури за допомогою аніонообмінної хроматографії, гідрофобної хроматографії, катіонообмінної хроматографії і афінної хроматографії; і (4) комбінування очищеної ІДС із фармацевтично прийнятним носієм. 9. Спосіб за п. 7 або 8, де клітина-хазяїн є оваріальною клітиною китайського хом'ячка. 10. Спосіб за п. 7 або 8, де катіонообмінна хроматографія виконується із застосуванням елююючого буфера з рН від 4,0 до 6,0. 11. Спосіб за п. 7 або 8, де гідрофобна хроматографія виконується із застосуванням елююючого буфера з рН від 5,0 до 7,0. 19 UA 109949 C2 5 12. Спосіб за п. 7 або 8, де афінна хроматографія виконується із застосуванням елююючого буфера з рН від 6,0 до 8,0. 13. Спосіб за п. 7 або 8, де аніонообмінна хроматографія виконується із застосуванням елююючого буфера з рН від 5,5 до 7,5. 14. Спосіб за п. 7 або 8, який додатково містить інактивовані віруси при рН від 3,0 до 4,0. 15. Спосіб отримання лікарського засобу для лікування синдрому Хантера, який включає складання композиції, отриманої відповідно до способу за п. 7 або 8. 20 UA 109949 C2 21 UA 109949 C2 22 UA 109949 C2 23 UA 109949 C2 24 UA 109949 C2 25 UA 109949 C2 26 UA 109949 C2 27 UA 109949 C2 28