Біспецифічна зв’язувальна молекула, яка зв’язується з vegf i ang2

Реферат: Винахід стосується біспецифічної зв'язувальної молекули, яка зв'язує VEGF і Ang2, у формі імуноглобулінового одиничного варіабельного домену типу VHH, вектора, клітини-хазяїна, фармацевтичної композиції, що містить зазначене антитіло та способу одержання такого антитіла. UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід належить до галузі терапії людини, зокрема, протиракової терапії, і до агентів і композицій, що застосовуються у такій терапії. Передумови створення винаходу 3 Коли пухлини досягають критичного розміру, що становить приблизно 1 мм , вони починають залежати від ангіогенезу для забезпечення надходження з кров'ю кисню і поживних речовин, що дозволяють їм продовжувати зростання. Антиангіогенні терапії стали важливим методом лікування при деяких типах пухлин. Ці терапії сфокусовані на блокаді шляху VEGF (Ferrara та ін, Nat Rev Drug Discov. 3 (5), травень 2004 р., сс. 391-400.) Шляхом нейтралізації VEGF (авастин) або його рецепторів (сутент і сорафініб). Сучасні дослідження, проведені на мишах, продемонстрували, що ангіопоетін-2 (Ang2), ліганд Tie2-рецептора, контролює ремоделювання судин, забезпечуючи функціонування інших ангіогенних факторів, таких як VEGF. Ang2 експресується краще ендотеліальними клітинами, установлеено, що має місце його сильна індукція під дією гіпоксії та інших ангіогенних факторів, і було продемонстровано, що він регулює пластичність судин пухлини, що дозволяє судинам реагувати на VEGF і FGF2 (Augustin та ін, Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), березень 2009, сс. 165-177). Встановлено, що елімінування або інгібування Ang2 призводить до зниженого ангіогенезу (Falcón та ін, Am J Pathol. 175 (5), листопад 2009, сс. 2159-2170), що узгоджується з вказаною роллю. Підвищені концентрації Ang2 у сироватці виявлені у пацієнтів з колоректальним раком (CRC), NSCLC і меланомою (Goede та ін, Br J Cancer. 103 (9), 26 жовтня 2010 р., сс. 1407-1414); Park та ін, Chest. 132 (1), липень 2007 р., сс. 200 206; Helfrich та ін, Clin Cancer Res. 15 (4), 15 лютого 2009 р., сс. 13841392.). При CRC-раку рівні Ang2 у сироватці корелюють з терапевтичною відповіддю на антиVEGF терапію. Система Ang-Tie складається з двох рецепторів (Tie1 і Tie2) і трьох лігандів (Ang1, Ang2 і Ang4) (Augustin та ін, Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), березень 2009, сс. 165-177 ). Tie2, Ang1 і Ang2 є найбільш детально вивченими представниками цього сімейства, Tie1 являє собою сирітський рецептор, а роль Ang4 у ремоделюванні судин ще підлягає вивченню. Ang2 і Ang1 опосередковують протилежні функції при зв'язуванні з Tie2 та активації. Опосередковувана Ang2 активація Tie2 призводить до активації ендотеліальних клітин, дисоціації перицитов, просочуванню з судин і індукції і розростання судин. На відміну від Ang2 передача сигналів Ang1 підтримує цілісність судин шляхом рекрутменту перицитов, підтримуючи тим самим стан спокою ендотеліальних клітин. Ангіопоетін 2 (Ang2) являє собою що секретується ліганд для тірозінкіназного Tie2рецептора з молекулярною масою 66 кДа (Augustin та ін, Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), березень 2009, сс. 165-177). Ang2 складається з N-кінцевого «coiled-coil» домену та C-кінцевого фібріногенподобного домену, останній необхідний для взаємодії з Tie2. Ang2 експресується головним чином ендотеліальними клітинами, було встановлено, що має місце його сильна індукція під дією гіпоксії та інших ангіогенних факторів, включаючи VEGF. Tie2 виявлений у ендотеліальних клітинах, гематопоетичних стовбурових клітинах і пухлинних клітинах. Встановлено, що взаємодія Ang2-Tie2 регулює пластичність судин пухлини, що дозволяє судинам реагувати на VEGF і FGF2. In vitro встановлено, що Ang2 діє у якості що має помірну ефективність мітогену, хемоаттрактанта і індуктора утворення трубочок у ендотеліальних клітинах пупкової вени людини (HUVEC). Ang2 індукує фосфорилювання тирозину при ектопічній експресії Tie2 у фібробластах і стимулює передачу сигналів по ходу транскрипції, таких як фосфорилювання ERK-MAPK, AKT і FAK, у HUVEC. Описано антагоністичний вплив Ang2 на індуковані Ang1 відповіді ендотеліальних клітин. Встановлено, що дефіцит Ang2 призводить у мишей до вираженого дефекту лімфатичної структури. Хоча зниження рівня Ang2 не має вирішального значення для розвитку ембріональних судин, миші з дефіцитом Ang2 мали стійкі дефекти судин у сітківці і нирці. Зазначені дані, що розглядаються поєднанні із динамічною схемою експресії Ang2 у місцях ангіогенезу (наприклад, у яєчнику), свідчать про те, що Ang2 контролює ремоделювання судин, забезпечуючи функції інших ангіогенних факторів, таких як VEGF. Система Ang2-Tie2 має вирішальне значення у процесі ангіогенного «перемикання» і на останніх стадіях ангіогенезу пухлини. Для експресії Ang2 характерна сильна підвищувальна регуляція у асоційованому з пухлиною ендотелії. Уповільнений ріст пухлин виявлений при їх імплантації у мишей з дефіцитом Ang2, насамперед на ранніх стадіях росту пухлини. Встановлено, що терапевтична блокада Ang2 за допомогою МАт до Ang2 має широкий спектр ефективності у відношенні моделей різних пухлин з використанням ксенотрансплантатів. Описано додатковий вплив МАт до Ang2 з використанням інгібіторів VEGFR2 (МАт і 1 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 низькомолекулярні інгібітори). Як узагальнено у US 2008/0014196, ангіогенез бере участь у патогенезі ряду порушень, включаючи щільні (солідні) пухлини і метастази, а також очні хвороби. Одним з найбільш важливих проангіогенних факторів є судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF), який також позначають як VEGF-A або фактор судинної проникності (VPF). VEGF належить до сімейства генів, що включає плацентарний фактор росту (PLGF), VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF E і VEGF-F. Альтернативний сплайсинг мРНК одиничного гена людського VEGF призводить до утворення щонайменше шести ізоформ (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 і VEGF206), при цьому такою, що найбільш часто зустрічається ізоформою є VEGF165. Ідентифіковано два тірозінкіназних рецептора VEGF (VEGFR), які взаємодіють з VEGF, а саме, VEGFR-1 (який також позначають як Flt-1) і VEGFR-2 (який також позначають як KDR або FIK-1). VEGFR-1 має найвищу афінність до VEGF, а VEGFR-2 характеризується трохи нижчою афінністю до VEGF. У Ferrara (Endocrine Rev., 25, 2004, сс. 581-611) представлено докладний опис VEGF, дані про його взаємодію з рецепторами і його функція при нормальних і патологічних процесах описані, наприклад, у Hoeben та ін., Pharmacol. Rev., 56, 2004, сс. 549580. Відомо, що VEGF являє собою має вирішальне значення регулятор як нормального, так і аномального ангіогенезу (Ferrara і Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18, 1997, сс. 4-25; Ferrara, J. MoL Med., 77, 1999, сс. 527-543). У порівнянні з іншими факторами росту, які беруть участь у процесах формування судин, VEGF є унікальним завдяки його високій специфічності відносно ендотеліальних клітин у судинній системі. У більшості людських пухлин виявлена надекспресія мРНК VEGF. У разі зростання пухлин ангіогенез, мабуть, має вирішальне значення для переходу від гіперплазії до неоплазії і для забезпечення харчування, необхідного для росту і метастазування пухлини (Folkman та ін, Nature 339, 1989, с. 58), що дозволяє пухлинним клітинам набувати переваги з позицій зростання порівняно зі здоровими клітинами. Таким чином, антиангіогенні терапії можуть стати важливим засобом лікування деяких типів пухлин. Ці терапії сфокусовані на блокаді VEGF-шляху (Ferrara та ін,, Nat Rev Drug Discov., 3 (5), травень 2004 г., сс. 391-400). VEGF бере участь також у патогенезі очних хвороб. Виявлено високий рівень кореляції між концентрацією VEGF у очних рідинах і наявністю активної проліферації кровоносних судин у пацієнтів з діабетичними та іншими пов'язаними з ішемією ретинопатіями. Крім того, у сучасних дослідженнях продемонстрована локалізація VEGF у хороідальних неоваскулярних мембранах у пацієнтів, які страждають віковою дегенерацією жовтої плями (AMD). При різних запальних захворюваннях виявлена також підвищувальна регуляція VEGF. VEGF бере участь у патогенезі ревматоїдного артриту (РА), запального захворювання, у якому ангіогенез відіграє значну роль. Розкриття ролі VEGF у ангіогенезі і різних процесах свідчить про те, що він являє собою нову потенційну мішень для терапевтичного втручання. Функцію VEGF інгібувати за допомогою малих молекул, які блокують або попереджають активацію рецепторних тірозінкіназ VEGF (Schlaeppi і Wood, Cancer Metastasis Rev., 18, 1999, сс. 473-481) і, як наслідок, надають вплив на шлях трансдукції сигналу рецептора VEGF. Цитотоксичні кон'югати, що містять бактеріальні або рослинні токсини, можуть інгібувати стимулюючу дію VEGF на ангіогенез пухлин. Наприклад, кон'югати VEGF-токсин DT385 (домени дифтерійного токсину, злиті або хімічно кон'юговані із VEGF165), ефективно інгібують ріст пухлин in vivo. Інгібування росту пухлин можна здійснювати також шляхом введення мутанта Flk-1 або розчинних VEGF-рецепторів з використанням ретровірусів. Розроблено нейтралізуючі VEGF антитіла, такі як A4.6.l і MV833, які блокують зв'язування VEGF з його рецепторами, і у доклінічних дослідженнях була продемонстрована їх протипухлинна активність (Kim та ін, Nature, 362, 1993, сс. 841-844; Folkman Nat. Med., 1, 1995, сс. 27-31; Presta та ін, Cancer Res., 57, 1997, сс. 4593-4599; Kanai та ін, Int. J. Cancer, 77, 1998, сс. 933-936; Ferrara і Alitalo, Nat. Med., 5, 1999, сс. 1359-1364; 320, 340). Огляд досліджень з використанням терапевтичних підходів, заснованих на застосуванні антитіл до VEGF, представлений у Campochiaro і Hackett, Oncogene, 22, 2003, сс. 6537-6548. У клінічних дослідженнях найбільш вивченим є антитіло A4.6.1, яке також позначають як бевацизумаб (Avastin ®; фірма Genentech, Сан-Франциско, шт. Каліфорнія). У WO 2008/101985 описані імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени верблюдових (VHH або «Nanobodies ®», представлені у даному описі), які зв'язуються з VEGF, і їх застосування для лікування станів і захворювань, що відрізняються надмірним і / або патологічним ангіогенезом або неоваскуляризацією. Таким чином, у основу даного винаходу була покладена задача розробити нові ангіогенні зв'язуючі молекули, призначені для лікування людини. 2 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ще одним об'єктом винаходу є способи попередження, лікування, полегшення і / або діагностування зазначених захворювань, порушень або станів, які у тому, що застосовують або вводять зазначені зв'язуючі молекули і композиції, що їх містять. Зокрема, об'єктом винаходу є зазначені фармакологічно активні зв'язуючі молекули, композиції та / або способи, які мають переваги у порівнянні з агентами, композиціями та / або методами, які застосовують у даний час і / або які відомі у даній галузі. Зазначені переваги включають покращені терапевтичні та / або фармакологічні властивості і / або інші які мають переваги властивості, наприклад, для цілей виготовлення, насамперед у порівнянні з канонічними антитілами, описаними вище, або їх фрагментами. Короткий виклад суті винаходу Першим об'єктом винаходу є біспеціфічні зв'язуючі молекули, краще біспеціфічні імуноглобуліни, краще імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени типу VHH і доменних антитіл, які містять щонайменше один DLL4-зв'язуючий компонент і щонайменше один Ang2зв'язуючий компонент у одній молекулі. Ці біспеціфічні зв'язуючі молекули можуть краще містити додатковий зв'язуючий компонент, краще компонент, що зв'язує сироватковий альбумін. Більш конкретно, біспеціфічна зв'язуюча молекула, пропонована у винаході, практично містить (I) Ang2-зв'язуючий компонент, який специфічно зв'язується щонайменше з одним епітопом Ang2, і (II) VEGF-зв'язуючий компонент, який специфічно зв'язується щонайменше з одним епітопом VEGF, де компоненти зчеплені один з одним таким чином, що вони одночасно зв'язуються з Ang2 і VEGF або таким чином, що вони зв'язуються у певний момент часу з Ang2 або VEGF. Таким чином, відповідно до кращих об'єктів винаходу два компоненти містять один або кілька іммуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, які можуть незалежно один від одного являти собою VHH або доменні антитіла та / або будь-який інший вид іммуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, таких як VL-домени, як вони представлені у даному описі, за умови, що кожний із зазначених іммуноглобулінових одиничних варіабельних доменів повинен зв'язуватися з антигеном, тобто Ang2 або VEGF відповідно. Згідно кращого варіанта здійснення винаходу імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени відносяться до одного і того ж типу, зокрема, всі імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени являють собою VHH або доменні антитіла. Згідно з найбільш кращим варіантом здійснення винаходу усі імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени являють собою VHH, краще гуманізовані (або «з оптимізованими послідовностями», як зазначено у даному описі) VHH. Таким чином, винахід відноситься до біспеціфічних зв'язуючих молекул, які містять (необов'язково гуманізоване або з оптимізованою послідовністю) антитіло до Ang2 типу VHH (анти-Ang2 VHH) і (необов'язково гуманізоване або з оптимізованою послідовністю) антитіло до VEGF типу VHH (анти-VEGF VHH). Однак, як має бути очевидно фахівцеві у даній галузі, даний винахід аналогічним чином ставиться до біспеціфічних зв'язуючих молекул, які включають інші анти-Ang2 або анти-VEGF імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, такі як доменні антитіла. Іншим об'єктом винаходу є нуклеїнові кислоти, що кодують біспецифічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході, а також клітини-хазяїни, які їх містять. Винахід належить і до продукту або композиції, який / яка містить або являє собою щонайменше одну біспецифічну зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході, і необов'язково один або кілька додаткових компонентів зазначеної композиції. Винахід належить і до способів отримання або створення біспеціфічних зв'язуючих молекул, нуклеїнових кислот, клітин-хазяїв, продуктів і композицій, зазначених у цьому описі. Винахід належить і до варіантів застосування біспеціфічних зв'язуючих молекул, нуклеїнових кислот, клітин-хазяїв, продуктів і композицій, зазначених у цьому описі, а також до способів попередження та / або лікування захворювань і порушень, які можна модулювати шляхом інгібування Ang2. Було встановлено, що Ang2-зв'язуючий компонент біспеціфічнихзв'язуючих молекул, пропонованих у даному винаході, зв'язується з Ang2 щонайменше у 5000 сильніше, краще у 10000 разів сильніше, ніж з Ang1 або Ang4. Це має у великій мірі дозволяти уникати блокади активації опосередковуваної Ang1 передачі сигналів, що може перешкоджати необхідній антиангіогенній дії. Встановлено також, що VEGF-зв'язуючий компонент біспеціфічних звязуючих молекул, запропонованих у винаході, зв'язується з VEGF-A із афінністю щонайменше у 1000 разів вищою, краще щонайменше у 5000 разів вищою, більш краще щонайменше у 10 тисяч разів більш високою, ніж з VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D або PLGF. Завдяки найбільш вираженому зв'язування з VEGF-A не відбувається взаємодії з передачею сигналу VEGFR3, якої модулює ангіогенез 3 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лімфатичних судин. Кращим варіантом здійснення винаходу є біспеціфічні зв'язуючі молекули, запропоновані у даному винаході, у вигляді зчеплених VHH-доменів. Зазначені молекули істотно менше канонічних антитіл і тому можуть глибше проникати у пухлину, ніж зазначені канонічні антитіла. Це корисна властивість додатково посилюється за допомогою специфічних послідовностей, зазначених у цьому описі, після елімініаціі у них сайтів глікозилювання. Крім того, завдяки біспеціфічній природі (VEGF- і Ang2- зв'язуючі компоненти у одній молекулі) проникнення у пухлину обох функціональностей неминуче має бути однаковим, що повинно гарантувати, що сприятливі дії об'єднаного антагонізму VEGF і Ang2 має поширюватися на всю глибину проникнення у пухлину. Це може бути перевагою у порівнянні з застосуванням комбінації індивідуальних антагоністів до цих мішеней, оскільки глибина проникнення індивідуальних антагоністів завжди може варіюватися у деякій мірі. Іншою перевагою бажаних біспеціфічних зв'язуючих молекул, пропонованих у даному винаході, є їх більш тривалий час напівжиття у сироватці блягодаря наявності компонента, що зв'язує сироватковий альбумін, такого як зв'язуюча сироватковий альбумін молекула, представлена в даному описі. Ці та інші об'єкти, варіанти здійснення винаходу, переваги і варіанти застосування винаходу повинні стати більш зрозумілими після ознайомлення з додатково поданим нижче описом. Визначення Якщо не зазначено або визначено інше, то всі застосовувані поняття вживаються у їх звичайному значенні, прийнятому у даній галузі, яке очевидно фахівцям у даній галузі. Як посилання можна вказати, наприклад, стандартні керівництва, такі як Sambrook та ін., «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 2-е вид., тому 1-3, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Lewin, «Genes IV», вид-во Oxford University Press, New York, 1990, і Roitt та ін., «Immunology» (2-е вид.), вид-во Gower Medical Publishing, London, New York, 1989, а також документи, що стосуються загального рівня техніки, процитовані у даному описі; крім того, якщо не вказано інше, всі методи, стадії, процеси і маніпуляції, які не описані конкретно у деталях, можна здійснювати (і їх здійснювали) добре відомими методами, що має бути очевидно фахівцеві у даній галузі. І у цьому випадку також у якості посилання можна, наприклад, вказати на відомі керівництва, відомості, що стосуються загального рівня техніки, зазначені вище, і додаткові процитовані у них посилання. Поняття «біспеціфічна зв'язуюча молекула» відноситься до молекули, яка містить щонайменше одну Ang2 зв'язуючу молекулу (або «Ang2-зв'язуючий компонент») і щонайменше одну VEGF-зв'язуючу молекулу (або «VEGF-зв'язуючий компонент»). Біспецифічна зв'язуюча молекула може містити більше однієї Ang2 зв'язуючою молекули і / або більше однієї VEGFзв'язуючою молекули, що має місце у тому випадку, коли біспеціфічна зв'язуюча молекула містить біпаратопну (що буде описано нижче) Ang2-зв'язуючу молекулу і / або біпаратопну VEGF-зв'язуючу молекулу, у тій частині молекули, яка зв'язується з Ang2 або із VEGF тобто у її «Ang2 зв'язуючому компоненті» або (анти-Ang2-компоненті) або «VEGF-зв'язуючому компоненті» (або у анти-VEGF-компоненті) відповідно. Однак поняття «біспецифічний» у цьому контексті не передбачає, що з біспеціфічної зв'язуючої молекули виключаються додаткові зв'язуючі компоненти, які мають зв'язуючу специфічність відносно молекул, відмінних від VEGF і Ang2. Прикладами зазначених додаткових зв'язуючих компонентів є (але не обмежуючись лише ними) зв'язуючі компоненти, які зв'язуються з сироватковим альбуміном. Якщо не вказано інше, то поняття «імуноглобулін» і «послідовність імуноглобуліну», якщо їх використовують у контексті даного опису відносно перебуває тільки з важких ланцюгів антитіла або канонічного що складається з 4 ланцюгів антитіла, використовують у якості загальних понять, які включають повнорозмірне антитіло, його індивідуальні ланцюги, а також всі його ділянки, домени або фрагменти (включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) антигензв'язуючі домени або фрагменти, такі як VHH-домени або VH / VL-домени відповідно). Крім того, поняття «послідовність» у контексті даного опису (наприклад, у поняттях типу «послідовність імуноглобуліну», «послідовність антитіла» «послідовність (одиничного) варіабельного домену,« послідовність VHH »або« послідовність білка»), як це зазвичай прийнято, відноситься як до відповідних амінокислотних послідовностей, так і до послідовностей нуклеїнових кислот або нуклеотидних послідовностей, які їх кодують, якщо з контексту не слідує більш обмежена інтерпретація. Поняття «домен (ділянка)» (поліпептиду або білка) у контексті даного опису відноситься до складчастої білкової структурі, яка має здатність зберігати свою третинну структуру, незалежно від решти частини білка. Як правило, домени відповідальні за окремі функціональні властивості білків і у багатьох випадках їх можна додавати, видаляти або переносити у інші білки без втрати 4 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функції решти білка і / або домену. Поняття «імуноглобуліновий домен» у контексті даного опису належить до глобулярної ділянки ланцюга антитіла (такий, наприклад, як ланцюг канонічного що складається з 4 ланцюгів антитіла або що складається з важких ланцюгів антитіла) або до поліпептиду, який складається практично з зазначеної глобулярної ділянки. Імуноглобулінові домени відрізняються тим, що вони зберігають притаманну імуноглобуліну складчасту структуру молекул антитіла, яка являє собою 2-шаровий «сендвіч», що складається приблизно з 7 антипаралельних бета-ланцюгів, упакованих у дві бета-складки, необов'язково стабілізованих за допомогою консервативного дисульфідного містка. Імуноглобуліновий домен містить варіабельний (і) домен (и), тобто один або кілька імуноглобулінових варіабельних доменів. Поняття «імуноглобуліновий варіабельний домен (ділянка)» у контексті даного опису належить до імуноглобулінового домену, що складається практично з чотирьох «каркасних ділянок», як вони визначені у даній галузі, і позначені нижче як «каркасна ділянка 1» або «FR1»; «каркасна ділянка 2» або «FR2»; «каркасна ділянка 3» або «FR3» і «каркасна ділянка 4» або «FR4» відповідно; зазначені каркасні ділянки перемежовуються трьома «гіперваріабельними ділянками (ділянками, визначальними комплементарність») або «CDR», як вони визначені у даній галузі, і позначені нижче як «гіперваріабельна ділянка 1» або «CDR1»; «гіперваріабельна ділянка 2» або «CDR2» і «гіперваріабельна ділянка 3» або «CDR3» відповідно. Таким чином, загальну структуру або послідовність варіабельного домену імуноглобуліну можна позначати як: FR1 - CDR1 - FR2 CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Саме варіабельний (і) домен (и) імуноглобуліну надає (ють) специфічність антитілу відносно антигену, оскільки він (вони) несе (уть) антигензв'язуючий центр. У контексті даного винаходу кращими є імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени типу VHH і доменних антитіл. Поняття «імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен» у контексті даного опису належить до імуноглобулінового варіабельності домену, який має здатність специфічно зв'язуватися з епітопом антигену без спаровування з додатковим імуноглобулінові варіабільним доменом. Одним із прикладів імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів відповідно до даного винаходу є «доменні антитіла», такі як поодинокі імуноглобулінові варіабельні домени VH і VL (VH-домени і VL-домени). Іншим прикладом імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів є «VHH-домени» (або просто «VHH») з представників верблюдових, як зазначено нижче у цьому описі. У світлі вищевказаних визначень антигензв'язуючий домен канонічного складається їх 4 ланцюгів антитіла (такого як молекула IgG, IgM, IgA, IgD або IgE; відома у даній галузі) або Fabфрагмента, F (ab ') 2-фрагмента, Fv-фрагмента, такого як зв'язаний дисульфідним містком Fv або scFv-фрагмент, або димерного антитіла (діабоді) (які всі відомі у даній галузі), виведений із зазначеного канонічного що складається з 4 ланцюгів антитіла, не слід розглядати як імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, оскільки у цих випадках зв'язування з відповідним епітопом антигену у нормі не може здійснюватися за допомогою одного (одиничного) імуноглобулінового домену, а повинно відбуватися за допомогою спарювання (асоціації) імуноглобулінових доменів, таких як варіабельні галузі легкого і важкого ланцюгів, тобто за допомогою пари VH-VL імуноглобулінових доменів, які спільно зв'язуються з епітопом відповідного антигену. ««VHH-домени », які позначають також як VHH, VHH-домени, фрагменти VHH-антитіла і VHH-антитіла, вперше були описані як антигензв'язуючі імуноглобулінові (варіабельні) домени« перебувають (тільки) з важких ланцюгів антитіл »(тобто« антитіл, у яких відсутні легкі ланцюги»), Hamers-Casterman C., Atarhouch T, Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. в: «Naturally occurring antibodies devoid of light chains»; Nature 363, 1993, сс. 446-448). Поняття «VHH-домен» було вибрано для того, що можна було відрізняти ці варіабельні домени від варіабельних ділянок важких ланцюгів, які присутні у канонічних що складаються з 4 ланцюгів антитіла (вони позначені далі як «VH-домени (ділянки)» або «VHдомени (ділянки) ») та від варіабельних ділянок легких ланцюгів, які присутні у канонічних що складаються з 4 ланцюгів антитіла (вони позначені далі як« VL-домени (ділянки) »або« VLдомени (ділянки)»). VHH-домени можуть специфічно зв'язуватися з епітопом без додаткового антигензв'язуючого домену (на відміну від VH-або VL-доменів у канонічному що складається з 4 ланцюгів антитілі, у якому для розпізнавання епітопу потрібна присутність VL-домена у поєднанні з VH-доменом). VHH-домени являють собою невеликі, сильні й ефективні розпізнавальні антиген структури (одиниці), утворені одиничним імуноглобуліновим доменом. У контексті даного винаходу поняття VHH-домен, VHH, VHH-домен, фрагмент VHH-антитіла, VHH-антитіло, а також «Nanobody ®» і «домен Nanobody ®» («Nanobody» є товарним знаком компанії Ablynx NV; Гент, Бельгія ) застосовують взаємозамінно, і вони відносяться до 5 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів (які мають наступну будову: FR1-CDR1FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, і які специфічно зв'язуються з епітопом, не вимагаючи присутності другого імуноглобулінового варіабельного домена), і вони відрізняються від VH-доменів наявністю так званих «відмінних залишків, залишків-маркерів», як вони визначені, наприклад, у WO 2009/109635, фіг. 1. Амінокислотні залишки імуноглобулінового одиничного варіабельного домену, наприклад, VHH, нумерують відповідно до загальної номенклатури Кебота для V H-доменів («Sequence of proteins of immunological interest», вид-во US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, публікація № 91), у тому вигляді, у якому її застосовують для VHH-доменів верблюдових, наприклад, як продемонстровано на фіг. 2 у Riechmann і Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 1999, сс. 25-38. Відповідно до цієї нумерації: FR1 містить амінокислотні залишки, присутні у положеннях 1-30, CDR1 містить амінокислотні залишки, присутні у положеннях 31-35, FR2 містить амінокислотні залишки, присутні у положеннях 36-49, CDR2 містить амінокислотні залишки, присутні у положеннях 50-65, FR3 містить амінокислотні залишки, присутні у положеннях 66-94, CDR3 містить амінокислотні залишки, присутні у положеннях 95-102 і FR4 містить амінокислотні залишки, присутні у положеннях 103-113. Однак слід зазначити, що, як добре відомо у даній галузі, для V H-доменів і для VHH-доменів, загальна кількість амінокислотних залишків у кожному CDR може варіюватися і може не відповідати загальній кількості амінокислотних залишків, зазначених у номенклатурі Кебота (тобто одне або кілька положень згідно з номенклатурою Кебота може бути незайнятим у фактичній послідовності, або фактична послідовність може містити більшу кількість амінокислотних залишків, ніж кількість залишків, яке повинно бути присутнім згідно з номенклатурою Кебота). Це означає, що, у цілому, нумерація за Кеботом може як відповідати, так і не відповідати фактичній нумерації амінокислотних залишків у фактичній послідовності. У даній галузі відомі альтернативні методи нумерації амінокислотних залишків V H-доменів, зазначені методи також можна застосовувати аналогічним чином до VHH-доменам. Однак, у даному описі, формулі винаходу і на кресленнях нумерація відповідає номенклатурі Кебота, і її застосовують до описаних вище VHH-доменів, якщо спеціально не вказано інше. Загальна кількість амінокислотних залишків у VHH-домені, як правило, становить від 110 до 120, частіше від 112 до 115. Однак слід зазначити, що для цілей цього винаходу можна застосовувати також як більш короткі, так і більш довгі послідовності. Імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени (наприклад, VHH і «доменні» антитіла), мають ряд унікальних структурних характеристик і функціональних властивостей, які роблять їх найбільш кращими для застосування у терапії у якості функціональних антигензв'язуючих молекул. Зокрема (але, не обмежуючись тільки цим), VHH-домени (які «створені» природою таким чином, що вони можуть функціонально зв'язуватися з антигеном без спаровування з варіабельною ділянкою легкого ланцюга) можуть функціонувати як поодинокі відносно дрібні функціональні антигензв'язуючі структурні одиниці. Завдяки своїм унікальним властивостям імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, як вони визначені у даному описі, типу VHH або VH (або VL), або індивідуально, або у якості частини більш великого поліпептиду, наприклад біпаратопної молекули, мають ряд важливих переваг: - тільки один домен необхідний для зв'язування антигену з високою афінністю і високою селективністю, тому відсутній як необхідність у наявності двох окремих доменів, так і необхідність у вимозі, щоб ці два домену перебували у правильній просторовій конформації і конфігурації (тобто необхідність у застосуванні спеціально створених лінкерів, як у випадку scFv); - імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени можна експресувати з однієї молекули нуклеїнової кислоти і при цьому відсутня необхідність у якій-небудь пост-трансляційній модифікації (типу глікозилювання); - імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени легко можна конструювати у багатовалентних і мультіспецифічних форматах (що докладно обговорено нижче у даному описі); - імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени мають високу специфічність і афінність до мішені, низьку притаманну їм токсичність і їх можна вводити шляхами, відмінними від інфузії або ін'єкції; - імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени мають високу стійкість до нагрівання, рН, протеаз та інших денатуруючих агентів або умовам і тому їх можна отримувати, зберігати або 6 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 транспортувати без застосування охолоджуючого устаткування; - імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени можна легко і відносно дешево отримувати як у лабораторному, так і у промисловому масштабі. Наприклад, імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени можна отримувати з використанням ферментації мікроорганізмів (що більш детально описано нижче) і для цієї мети не потрібно застосування експресійних систем ссавців, що має місце у випадку канонічних антитіл; - імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени є відносно невеликими (приблизно 15 кДа або у 10 разів менше, ніж канонічний IgG) у порівнянні з канонічними що складаються з 4 ланцюгів антитілами і їх антигензв'язуючими фрагментами, і тому для них характерна висока (більш висока) здатність проникати у тканини (включаючи (але, не обмежуючись лише ними) щільні пухлини та інші щільні тканини) і їх можна вводити у більш високих дозах, ніж дози канонічних що складаються з 4 ланцюгів антитіл і їх антигензв'язуючих фрагментів; - VHH мають специфічну так звану «здатність зв'язуватися з сайтом, розташованому у ущелині (борозенці)» (у тому числі завдяки їх подовженій CDR3-петлі, на відміну від VH-доменів що складаються з 4 ланцюгів антитіл), і тому для них є доступними також мішені і епітопи, які не доступні для канонічних що складаються з 4 ланцюгів антитіл і їх антигензв'язуючих фрагментів; - VHH мають важливу перевагу, що полягає у тому, що вони мають високу розчинність і дуже високу стабільність і не мають тенденцію до агрегації (що має місце у випадку отриманих з антитіл мишей антигензв'язуючих доменів, описаних у Ward та ін., Nature 341, 1989, сс. 544546). Імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, пропоновані у винаході, не обмежені будьяким конкретним біологічним джерелом, з якого їх одержують, або конкретним методом отримання. Наприклад, процес отримання VHH може включати наступні стадії: (1) виділення VHH-домена з зустрічається у природних умовах містить (тільки) важкі ланцюги антитіла; або скринінг бібліотеки містять (тільки) важкі ланцюги антитіл або VHH, і виділення з них VHH; (2) експресія молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує VHH-домен, що має послідовність, яка зустрічається у природних умовах; (3) «гуманізація »VHH, необов'язково після дозрівання афінності, за допомогою такої, що має послідовності, що зустрічається у природних умовах, або експресія нуклеїнової кислоти, яка кодує гуманізований VHH; (4) «Камелізація» (відповідно до описаного нижче методу) імуноглобулінового одиничного варіабельного домену важкого ланцюга зустрічається у природних умовах антитіла, отриманого з різних видів тварин, зокрема видів ссавців, таких як людина, або експресія молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує вказаний камелізований домен; (5) «камелізація »VH або експресія молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує камелізований VH; (6) застосування методик для одержання синтетичних або напівсинтетичних білків, поліпептидів та інших амінокислотних послідовностей; (7) отримання молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує VHH-домен, за допомогою методів синтезу нуклеїнових кислот з подальшою експресією отриманої таким чином нуклеїнової кислоти; (8) наражання що містять важкі ланцюги антитіл або VHH процесу дозрівання афінності, мутагенезу (наприклад, неспецифічному мутагенезу або сайтнаправленному мутагенезу) та / або будь-який (им) інший (їм) обробці (ам) для підвищення афінності та / або специфічності VHH; та / або (9) поєднання або вибір деяких з вищевикладених стадій. Прийнятні методи і процеси здійснення зазначених вище стадій відомі у даній галузі і повинні бути очевидні фахівцеві у даній галузі. Наприклад, методи отримання VHH-доменів, які зв'язуються зі специфічним антигеном або епітопом, описані у WO 2006/040153 і WO 2006/122786. Згідно конкретних варіантів здійснення винаходу імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, пропоновані у винаході, або присутні у поліпептидах, запропонованих у винаході, являють собою VHH-домени, амінокислотна послідовність яких практично відповідає амінокислотній послідовності такого, що зустрічається у природних умовах VHH-домена, але є гуманізованою або має «оптимізовану послідовність »(необов'язково у результаті дозрівання афінності), тобто має (ють) місце заміна (и) одного або декількох амінокислотних залишків у амінокислотній послідовності зазначеного такого, що зустрічається у природних умовах VHH на один або кілька амінокислотних залишків, які перебувають у відповідному (їх) положенні (ях) у варіабельній галузі важкого ланцюга канонічного що складається з 4 ланцюгів людського 7 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла. Для цієї мети можна застосовувати методи, відомі у даній галузі, що є загальноприйнятими для фахівця у даній галузі. Гуманізований VHH-домен може містити одну або кілька послідовностей повністю людських каркасних ділянок і у ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу може містити послідовності людських каркасних ділянок, виведені з послідовностей людської зародкової лінії Vh3, таких як DP-29, DP-47, DP 51, або їх частини, або мати високий рівень гомології з ними, необов'язково у поєднанні з JH-послідовностями, такими як JH5. Так, протокол гуманізації може передбачати заміну будь-якого із залишків VHH на відповідні залишки каркасної ділянки 1, 2 і 3 (FRl, FR2 і FR3) генів VH зародкової лінії, таких як DP 47, DP 29 і DP 51, або індивідуально, або у комбінації . Прийнятні каркасні ділянки (FR) імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, запропонованих у винаході, можна вибирати з ділянок, описаних, наприклад, у WO 2006/004678, і зокрема, вони включають так звані класи «KERE» і «GLEW». Найбільш бажаними є імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, які мають амінокислотну послідовність GLEW приблизно у положеннях 44-47, і їх відповідні гуманізовані копії. Гуманізований VHH-домен може містити одну або кілька послідовностей повністю людської каркасної ділянки. Наприклад, застосовувана з метою гуманізації заміна VHH, що належать до 103 P, R, Sгрупи та / або GLEW-групі (що описано нижче), являє собою заміну 108Q на 108L. Методи гуманізації імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів відомі у даній галузі. Зв'язуючі імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени з поліпшеними з позицій терапевтичного застосування властивостями, наприклад, мають підвищену афінність або знижену імуногенність, можна отримувати з індивідуальних зв'язуючих молекул за допомогою методик, відомих у даній галузі, таких як дозрівання афінності (наприклад, використовуючи у якості вихідних синтетичні, довільні або що зустрічаються у природних умовах послідовності імуноглобулінів), CDR-трансплантація, гуманізація, об'єднання фрагментів, отриманих з різних послідовностей імуноглобулінів, ПЛР-збірка з використанням праймерів що перекриваються та аналогічні методики, призначені для конструювання послідовностей імуноглобулінів, які добре відомі фахівцеві у даній галузі; або будь-якій прийнятній комбінації будь-яких вищевикладених методів, що також позначають поняттям «оптимізація послідовності», вживаним у даному описі. Як посилання можна вказати, наприклад, стандартні посібники, а також можна використовувати приведений нижче опис і відомості, представлені у прикладах. При необхідності зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході, яка має підвищену афінність, одержують з іншої зв'язуючої молекули шляхом дозрівання афінності, остання являє собою «батьківську» зв'язуючу молекулу щодо молекули з дозрілою афінністю. Раніше були описані методи отримання VHH, які зв'язуються зі специфічним антигеном або епітопом, див., наприклад, WO 2006/040153 і WO 2006/122786. Як докладно описано у зазначених документах, VHH-домени, виведені з представників верблюдових, можна «гуманізувати» (у контексті даного опису цей процес позначений також як «оптимізація послідовності», при цьому «оптимізація послідовності» крім гуманізації може включати додаткову модифікацію послідовності за допомогою однієї або декількох мутацій, які дозволяють отримувати VHH з поліпшеними властивостями, таких як видалення потенційних сайтів пост-трансляційних модифікацій) шляхом заміни одного або декількох амінокислотних залишків у амінокислотній послідовності вихідної послідовності VHH на один або кілька амінокислотних залишків, які перебувають у відповідному (їх) положенні (ях) у VH-галузі канонічного що складається з 4 ланцюгів людського антитіла. Гуманізований VHH-домен може містити одну або кілька послідовностей повністю людської каркасної ділянки і у більш конкретному варіанті здійснення винаходу може містити послідовності людських каркасних ділянок, виведені з DP-29, DP-47, DP-51, або їх частини, необов'язково у поєднанні з JHпослідовностями, такими як JH5. «Доменні антитіла », які також позначають як« Dab »або« dAb »(поняття« доменні »антитіла» і «dAb» є товарним знаком групи компаній GlaxoSmithKline), описані, наприклад, у Ward ES та ін. в: «Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli», Nature 341, 1989, сс. 544-546; у Holt L.J. та ін. в: «Domain antibodies: proteins for therapy», TRENDS in Biotechnology 21(11), 2003, сс. 484-490 і у WO 2003/002609. Доменні антитіла у основному відповідають VH-або VL-доменів антитіл з представників ссавців, що не відносяться до верблюдових, зокрема людських що складаються з 4 ланцюгів антитіл. Для додання здатності зв'язуватися з епітопом у вигляді одиничного антигензв'язуючого домену, тобто без спаровування з VL-або VH-доменом відповідно, потрібно здійснювати специфічну селекцію щодо зазначених антигензв'язуючих властивостей, наприклад, з використанням бібліотек людських послідовностей одиничних VH-або VL-доменів. 8 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Доменні антитіла подібно VHH мають молекулярну масу, що становить від приблизно 13 до приблизно 16 кДа, якщо їх виводять з повністю людських послідовностей, і вони не потребують гуманізації, наприклад, для терапевтичного застосування на людях. Також як і у випадку VHHдоменів, їх можна з успіхом експресувати також у прокаріотичних системах експресії, що призводить до істотного зниження загальної вартості виробництва. Крім того, що також має бути очевидно фахівцеві у даній галузі, можна «трансплантувати» один або кілька зазначених вище CDR у інші «каркаси», включаючи (але, не обмежуючись лише ними) людські каркаси або неімуноглобулінові каркаси. Прийнятні каркаси і методики такої трансплантації CDR відомі у даній галузі. Поняття «епітоп» і «антигенна детермінанта», які можна застосовувати взаємозамінно, належать до ділянки макромолекули, такої як поліпептид, який розпізнається антигензв'язуючими молекулами, такими як канонічні антитіла або поліпептиди, пропоновані у винаході, і більш конкретно антигензв'язуючими центрами зазначених молекул. Епітопи являють собою мінімальний сайт зв'язування для імуноглобуліну і тому являють собою специфічну мішень для імуноглобуліну. Вважають, що поліпептид (такий як імуноглобулін, антитіло, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований у винаході, або у цілому зв'язуюча молекула або її фрагмент), який може «зв'язуватися з» або «специфічно зв'язуватися з», який має «афінність до» і / або «специфічність до» певного епітопу, антигену або білку (або щонайменше одній його ділянці, фрагменту або епітопу), «діє проти» чи є «спрямованим проти» зазначеного епітопу, антигену або білка, або є «зв'язуючою» молекулою стосовно вказаного епітопу, антигену або білка. У цьому контексті VEGF-зв'язуючий компонент можна позначати також як «VEGF нейтралізуючий» компонент. Як правило, поняття «специфічність» відноситься до ряду антигенів або епітопів різних типів, з якими конкретна антигензв'язуюча молекула або молекула антигензв'язуючого білка (така як імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований у винаході) може зв'язуватися. Специфічність антигензв'язуючої молекули можна визначати на основі її афінності та / або авідності. Афінність, що характеризується константною рівновагою реакції дисоціації комплексу антиген: антигензв'язуючий білок (KD), є мірою сили зв'язування між епітопом і антигензв'язуючих центром антигензв'язуючого білка: чим менше величина KD, тим вище сила зв'язування між епітопом і антигензв'язуючою молекулою (в альтернативному варіанті афінність можна виражати у вигляді константи афінності (KA), яка являє собою 1/KD). Як має бути очевидно фахівцеві у даній галузі (наприклад, після ознайомлення з представленим нижче додатковим описом), афінність можна визначати добре відомим методом у залежності від специфічності антигену який представляє інтерес. Авідність являє собою міру сили зв'язування між антигензв'язуючою молекулою (такий як імуноглобулін, антитіло, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен або поліпептид, що містить) та відповідного антигену. Авідність пов'язана як з афінністю між епітопом і його антигензв'язуючим центром антигензв'язуючої молекули, так і з кількістю відповідних сайтів зв'язування, які присутні у антигензв'язуючій молекулі. Частина антигензв'язуючої молекули, яка розпізнає епітоп, називається паратопом. Якщо не вказано інше, то поняття «VEGF-зв'язуюча молекула» або «Ang2-зв'язуюча молекула» включає антитіла до VEGF або до Ang2, фрагменти антитіла до VEGF або антитіла до Ang2, «молекули, що нагадують антитіло до VEGF» або «молекули, що нагадують антитіло до Ang2 », як вони визначені у даному описі, і кон'югати, що включають будь-яку з них. Антитіла являють собою (але, не обмежуючись лише ними) моноклональні і химерні моноклональні антитіла. Поняття «антитіло» відноситься до повних імуноглобулінів, наприклад, моноклональних антитіл, які отримують шляхом рекомбінантної експресії у клітинах-хазяїнах, а також до фрагментів антитіл або «молекул, що нагадує антитіла», включаючи одноланцюгові антитіла і лінійні антитіла, так звані «SMIP» («Small Modular Immunopharmaceuticals», малі модульні імунофармацевтичні засоби), наприклад, описані у WO 02/056910. Схожі на антитіла молекули включають імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, представлені у даному описі. Іншими прикладами схожих на антитіла молекул є антитіла з суперсімейства імуноглобулінів (IgSF) або молекули з трансплантованими CDR. Поняття «Ang2-зв'язуюча молекула» або «VEGF-зв'язуюча молекула» відповідно відноситься як до одновалентних мішень зв'язуючих молекул (тобто до молекул, які зв'язуються з одним епітопом відповідної мішені), так і до двох-або багатовалентних зв'язуючих молекул (тобто зв'язуючих молекул, які зв'язуються з більш ніж одним епітопом, наприклад, «біпаратопним» молекул, як вони описані нижче). Ang2-(або VEGF)-зв'язуючі молекули, які містять більше одного зв'язується з Ang2 (або VEGF) імуноглобулінового одиничного 9 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельного домену, також позначають як «форматовані» зв'язуючі молекули, вони можуть містити у мішень зв'язуючому компоненті крім імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів також лінкери та / або фрагменти з ефекторними функціями, наприклад, фрагменти, що подовжують час напівжиття, типу альбумінсвязивающіх імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, і / або партеру по злиттю типу сироваткового альбуміну і / або приєднаного полімеру типу ПЕГ. Поняття «біпаратопна Ang2-(або VEGF)-зв'язуюча молекула» або «біпаратопний імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен» у контексті даного опису означає зв'язуючу молекулу, яка містить перший імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен і другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, як вони визначені у даному описі, при цьому дві молекули зв'язуються з двома неперекривними епітопами відповідного антигену. Біпаратопні зв'язуючі молекули складаються з імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, які мають різні специфічності щодо епітопу. Паратопом називають частину антигензв'язуючої молекули (такої як антитіло або імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований у винаході), яка розпізнає епітоп. Форматована зв'язуюча молекула може, хоча це є менш привабливим, містити також два ідентичних імуноглобулінових одиничних варіабельних домену або містити два різних імуноглобулінових одиничних варіабельних домену, які розпізнають один і той же або що перекриваються епітопи або відповідний антиген. У цьому випадку відносно VEGF два імуноглобулінових одиничних варіабельних домену можуть зв'язуватися з одним і тим же або епітопом що перекривається у кожному з двох мономерів, які утворюють димер VEGF. Як правило, зв'язування зв'язуючих молекул, запропонованих у винаході, характеризується значенням константи дисоціації (KD), що становить від 10E-5 до 10E-14 молей / л (M) або менше, і краще від 10E-7 до 10E-14 молей / л (M) або менше, більш краще від 10E-8 до 10E-14 молей / л і ще більш краще від 10E-11 до 10E-13, за даними, отриманими, наприклад, за допомогою Biacore-або Kinexa-аналізу), та / або значенням константни асоціації (KA), що -1 -1 становить щонайменше 10E8 M , більш краще щонайменше 10E9 M , наприклад, щонайменше -1 10E11 M . Як правило, вважається, що будь-яке значення величини KD, яке перевищує 10E-4 молей / л, свідчить про неспецифічне зв'язування. Краще зв'язування поліпептиду, пропонованого у винаході, з необхідним антигеном, тобто VEGF або Ang2 відповідно, має характеризуватися значенням KD, які становлять менше 500нм, краще менше 200Нм, більш краще менше 10 нм, наприклад, менш 500пМ. Специфічне зв'язування антигензв'язуючого білка з антигеном або епітопом можна визначати за допомогою будь-якого прийнятного добре відомого методу, такого, наприклад, як аналізи, представлені у даному описі, аналіз Скетчарда та / або аналізи зв'язування у умовах конкуренції (аналізи конкурентного зв'язування), такі як радіоімуноаналізи (РІА), ферментні імуноаналізи (ФІА) і «сендвіч»-аналізи у умовах конкуренції і їх різні варіанти, добре відомі у даній галузі. Амінокислотні залишки позначають відповідно до стандартного трибуквеного або однобуквеного коду амінокислот, що добре відомо і є загальновизнаним у даній галузі. При порівнянні двох амінокислотних послідовностей поняття «відмінність у амінокислотах» відноситься до інсерцій, делецій або замін зазначеної кількості амінокислотних залишків у певному положенні референс-послідовності у порівнянні з другою послідовністю. У разі замін (и) зазначені (а) заміни (а) краще повинні (а) являти собою консервативні (у) амінокислотні (ну) заміни (у), це означає, що амінокислотний залишок замінюють на інший амінокислотний залишок схожої хімічної будови, який має незначний вплив або практично не робить впливу на функцію, активність та інугі біологічні властивості поліпептиду. Зазначені консервативні амінокислотні заміни добре відомі у даній галузі, наприклад, вони описані у WO 98/49185, при цьому консервативні амінокислотні заміни краще являють собою заміни, при яких одну з амінокислот з наступних груп (I) - (V) замінюють на інший амінокислотний залишок, що входить у цю ж групу: (I) невеликі аліфатичні неполярні або такі, які мають невисоку полярність залишки: Ala , Ser, Thr, Pro і Gly; (II) полярні негативно заряджені залишки і їх (незаряджені) аміди: Asp, Asn, Glu і Gln; (III) полярні позитивно заряджені залишки: His, Arg і Lys; (IV) великі аліфатичні неполярні залишки: Met, Leu, Ile, Val і Cys; та (V) ароматичні залишки: Phe, Tyr і Trp. Найкращими є наступні амінокислотні заміни: Ala на Gly або на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln або на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala або на Pro; His на Asn або на Gln; Ile на Leu або на Val; Leu на Ile або на Val; Lys на Arg, на Gln або на Glu; Met на Leu, на Tyr або на Ile; Phe на Met, на Leu або на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp або на Phe; Val на Ile або на Leu. Молекула поліпептиду або нуклеїнової кислоти розглядається як «практичні виділена» (знаходиться у «практично виділеній» формі), наприклад, з її нативного біологічного джерела і / 10 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або реакційного середовища або середовища для культивування, з якого її отримують, коли вона відокремлена щонайменше від одного компонента, з яким вона зазвичай асоційована у зазначеному джерелі або вказаному середовищі, такому як інший білок / поліпептид, інша нуклеїнова кислота, інший біологічний компонент або макромолекула або щонайменше один забруднювач, домішок або мінорний компонент. Зокрема, молекула поліпептиду або нуклеїнової кислоти розглядається як «практично виділена», коли ступінь її чистоти підвищена щонайменше у 2 рази, зокрема щонайменше у 10 разів, більш краще щонайменше у 100 разів і аж до 1000 разів або більше. Молекула поліпептиду або нуклеїнової кислоти, яка знаходиться у «практично виділеній формі», краще є практично гомогенною, що визначають за допомогою прийнятного методу, такого як прийнятний хроматографічний аналіз, електрофорез у поліакриламідному гелі. «Ідентичність послідовностей »послідовностей двох VEGF -зв'язуючих молекул або послідовностей двох Ang2-зв'язуючих молекул означає відсоток амінокислот, ідентичних для послідовностей. Його можна розраховувати або визначати згідно з методом, викладеному у розділі f) на с. 49 та с. 50 WO 2008/020079. «Подібність послідовностей» означає відсоток амінокислот, які або ідентичні, або представляють собою консервативні амінокислотні заміни. У даній галузі відомі альтернативні методи нумерації амінокислотних залишків VH-доменів, зазначені методи аналогічним чином можна застосовувати для нумерації VHH-доменів. Однак у даному описі, формулі винаходу і на кресленнях, якщо не вказано інше, використовують номенклатуру Кебота для нумерації VHH-доменів, яка описана вище. VEGF- зв'язуюча молекула або Ang2-зв'язуюча молекула «із дозрілою афінністю», зокрема, VHH або доменне антитіло, несе одну або кілька змін у одному або декількох CDR, що призводить до підвищеної афінності до VEGF або Ang2 порівняно з відповідною батьківської VEGF -зв'язуючою молекулою або Ang2-зв'язуючою молекулою. VEGF -зв'язуючі молекули або Ang2-зв'язуючі молекули з дозрілою афінністю можна отримувати методами, описаними у даній галузі, наприклад, описаними у Marks та ін., Biotechnology 10, 1992, сс. 779-783 або у Barbas та ін., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91, 1994, сс. 3809-3813.; Shier та ін., Gene 169, 1995, сс. 147-155; Yelton та ін., Immunol. 155, 1995, сс. 1994-2004; Jackson та ін., J. Immunol. 154(7), 1995, сс. 33103319 і у Hawkins та ін., J. MoI. Biol. 226(3), 1992, сс. 889-896; у K.S. Johnson і R.E. Hawkins в: «Affinity maturation of antibodies using phage display», вид-во Oxford University Press, 1996. У контексті даного винаходу «амінокислотні послідовності SEQ ID NO: x» включають, якщо не вказано інше, амінокислотну послідовність, яка на 100% ідентична послідовності, представленій у відповідній SEQ ID NO: x; а) амінокислотні послідовності, які щонайменше на 80% ідентичні послідовності, представленій у відповідній SEQ ID NO: x; б) амінокислотні послідовності, які мають 3, 2 або 1 відмінність у амінокислотах щодо послідовності, представленій у відповідній SEQ ID NO: x. Поняття «рак» і «злоякісний» відноситься або описує фізіологічний стан у ссавців, що, як правило, характеризується нерегульованим зростанням / проліферацією клітин. Прикладами раку, який можна лікувати за допомогою біспеціфічної зв'язуючої молекули, запропонованої у винаході, є (але, не обмежуючись лише ними) карцинома, лімфома, бластома, саркома і лейкоз. Більш конкретними прикладами зазначених видів раку, які запропоновано лікувати за допомогою антагоністів VEGF згідно US 2008/0014196, є плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарціономи легені, плоскоклітинна карцинома легені, рак очеревини, печінковоклітинний рак, рак шлунково-кишкової системи, рак підшлункової залози, гліобластома, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатома, рак молочної залози, рак ободової кишки, колоректальний рак, саркома ендометрію або матки, карцинома слинних залоз, рак нирки, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитовидної залози, карцинома печінки, рак шлунка, меланома і різні види раку голови і шиї . Порушення регуляції ангіогенезу може призводити до багатьох порушень, які можна лікувати за допомогою композицій і способів, запропонованих у винаході. Ці порушення включають як ненеопластичні, так і неопластичні стани. Неопластичні захворювання включають (але, не обмежуючись лише ними) описані вище захворювання. Ненеопластичні порушення включають (але, не обмежуючись лише ними) порушення, які у US 2008/0014196 запропоновано лікувати за допомогою антагоністів VEGF, а саме, небажану або аберантну гіпертрофію, артрит, ревматоїдний артрит (RA), псоріаз, псоріатичні бляшки, саркоїдоз, атеросклероз , атеросклеротичні бляшки, діабетичні та інугі проліферативні ретинопатії, включаючи ретинопатію недоношених, ретролетальну фіброплазію, неоваскулярну глаукому, вікову дегенерацію жовтої плями, діабетичний макулярний набряк, неоваскуляризації рогівки, неоваскуляризацію трансплантата рогівки, відторгнення трансплантата рогівки, 11 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ретинальну / хоріоідальну неоваскуляризацію\, неоваскуляризацію кута ока (почервоніння), очне пов'язане з неоваскуляризацією захворювання, васкулярний рестеноз, артеріовенозні вади розвитку (AVM), менінгіому, гемангіому, ангіофібром, гіперлазіі щитовидної залози (включаючи хвороба Грейвса), трансплантацію рогівки та інугої тканини, хронічне запалення, запалення легенів, гостре легеневе пошкодження/РДСД (респіраторний дистрес -синдром дорослих) , сепсис, первинну легеневу гіпертензію, злоякісні пульмональні випоти , набряк головного мозку (наприклад, асоційований з гострим «ударом» / закритим ушкодженням голови / травмою ), синовиальне запалення , формування паннуса при RA , осифікуючий міозит , гипертрофичне утворення кісткової тканини , остеоартрит ( OA ) , рефрактерний асцит , полікістозне захворювання яєчника , ендометріоз , хвороби, пов'язані з накопиченням рідини у "третьому" просторі організму (панкреатит , компартмент -синдром , опіки , хвороба кишечника), фіброїди матки, передчасні пологи, хронічне запалення, таке як IBD (хвороба Крона і неспецифічний виразковий коліт), відторгнення ниркового алотрансплантату, запальне захворювання кишечника, нефротичний синдром, небажаний або аберантний зріст тканинної маси (неракові походження), суглоби при гемофілічних артропатіях, гіпертрофічні рубці , припинення росту волосся, синдром Ослера-Вебера, гнійну грануломатозну ретролетальну фіброплазію, склеродерму, трахому, васкулярні адгезії, синовііт, дерматит, прееклампсію, асцит, перикардіальний випіт (наприклад, асоційований з перикардитом) і плевральний випіт. Докладний опис винаходу Першим об'єктом даного винаходу є біспеціфічна зв'язуюча молекула, яка містить щонайменше один Ang2- зв'язуючий компонент і щонайменше один VEGF- зв'язуючий компонент. У кращих варіантах здійснення даного винаходу біспеціфічна зв'язуюча молекула містить щонайменше один VEGF-зв'язуючий компонент і щонайменше один Ang2-зв'язуючий компонент, який додатково містить щонайменше ще один зв'язуючий компонент, краще компонент, що зв'язує сироватковий альбумін (молекула, зв'язуюча сироватковий альбумін). У кращому варіанті здійснення винаходу компонент, що зв'язує сироватковий альбумін, зв'язуючої молекули, пропонованої у даному винаході, являє собою виділений імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен або поліпептид, що містить один або кілька зазначених імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, де вказаний імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен складається з чотирьох каркасних ділянок та трьох гіперваріабельних ділянок CDR1, CDR2 і CDR3 відповідно і де вказаний CDR3 має амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 257, 260, 263, 266, 269, 272 або 275. Більш краще вказаний (і) один або кілька імуноглобуліновий (их) одиничний (их) варіабельний (их) домен (ів) компонента, що зв'язує сироватковий альбумін, містить (ять) а. CDR3, що має амінокислотну послідовність, вибрану з першої групи амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 257, 260, 263, 266, 269, 272 або 275; б. CDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з другої групи амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 255, 258, 261, 264, 267, 270 або 273; в. CDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з другої групи амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 256, 259, 262, 265, 268, 271 або 274. У більш кращому варіанті здійснення винаходу вказаний (і) один або кілька імуноглобуліновий (их) одиничний (их) варіабельний (их) домен (ів) компонента, що зв'язує сироватковий альбумін, являють собою VHH, які краще мають амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO : 98 або 254. Згідно кращого варіанту здійснення винаходу вказаний Ang2-зв'язуючий компонент і зазначений VEGF зв'язуючий компонент містять щонайменше один Ang2-зв'язуючий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен і щонайменше один VEGF-зв'язуючий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен відповідно. У кращему об'єкті винаходу вказаний Ang2-зв'язуючий компонент і зазначений VEGF зв'язуючий компонент містять щонайменше один Ang2-зв'язуючий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен і щонайменше один VEGF-зв'язуючий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен відповідно, при цьому, кожен з імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів містить чотири каркасних ділянки та три гіперваріабельних ділянки CDR1, CDR2 і CDR3 відповідно. Так, анти-Ang2 та / або анти-VEGF-компонент, що входить у біспеціфічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході, може включати два (чи більше) анти-Ang2 (або анти-VEGF відповідно) імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, де мішенню імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів є різні епітопи у Ang2 (або VEGF). Таким чином, два імуноглобулінових 12 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одиничних варіабельних домена у біспеціфічній зв'язуючій молекулі повинні мати різну антигенну специфічність і отже різні CDR-послідовності. Зазначені двовалентні зв'язуючі молекули називають також «біпаратопними конструкціями однодоменних антитіл (якщо імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени складаються або практично складаються з однодоменних антитіл) або« біпаратопними VHH-конструкціями »(якщо імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени складаються або практично складаються з VHH) відповідно, оскільки два імуноглобулінових одиничних варіабельних домена повинні включати два різних паратопа. У біспеціфічній зв'язуючій молекулі, запропонованій у винаході, одна чи обидві зв'язуючі молекули може (уть) бути двовалентним (і); наприклад, VEGF- зв'язуючий компонент може бути біпаратопним і Ang2- зв'язуючий компонент може являти собою один імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, або VEGF- зв'язуючий компонент може являти собою один імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен і Ang2-зв'язуючий компонент може бути біпаратопним. У біспеціфічних зв'язуючих молекулах, запропонованих у винаході, краще VEGF-зв'язуючий компонент містить двовалентний VEGF-зв'язуючий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, наприклад, біпаратопний VHH. Зазначений VEGF-зв'язуючий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен може містити два або більшу кількість VEGF-зв'язуючих VHH, які являють собою: а) ідентичні VHH, які мають здатність блокувати взаємодію людського рекомбінантного VEGF з людським рекомбінантним VEGFR-2 з рівнем інгібування ≥ 60%, або б) різні VHH, які зв'язуються з неперекривними епітопами VEGF, де щонайменше один VHH має здатність блокувати взаємодію людського рекомбінантного VEGF з людським рекомбінантним VEGFR-2 з рівнем інгібування ≥ 60%, і де щонайменше один VHH може блокувати вказане взаємодія з рівнем інгібування ≤ 60%. VEGF-зв'язуючий компонент містить щонайменше варіабельний домен з чотирма каркасними ділянками і трьома гіперваріабельними ділянками CDR1, CDR2 і CDR3 відповідно, де вказаний CDR3 має амінокислотну послідовність Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr, представлену у SEQ ID NO: 1, у якій Xaa у положенні 5 означає Gly або Ala; Xaa у положенні 7 означає Ser або Gly; Xaa у положенні 12 означає Gly, Ala або Pro; Xaa у положенні 13 означає Asp або Gly; Xaa у положенні 16 означає Asp або Glu; і при цьому, зазначений VEGF-зв'язуюча молекула має здатність блокувати взаємодію людського рекомбінантного VEGF165 з людським рекомбінантним VEGFR-2 з рівнем інгібування ≥60%. Згідно кращого варіанту здійснення винаходу Xaa у положенні 5 позначає Gly, Xaa у положенні 7 позначає Ser, Xaa у положенні 12 позначає Ala і Xaa у положенні 13 позначає Asp. Зокрема, зазначений CDR3 має послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 2 SRAYGSSRLRLGDTYDY, SEQ ID NO: 3 SRAYGSSRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 4 SRAYGSSRLRLADTYEY; SEQ ID NO: 5SRAYGSGRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 6SRAYASSRLRLADTYDY; SEQ ID NO: 7SRAYGSSRLRLPDTYDY; SEQ ID NO: 8SRAYGSSRLRLPGTYDY. Згідно конкретних варіантів здійснення винаходу VEGF-зв'язуюча молекула містить один або кілька імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, кожен з яких містить a) CDR3, амінокислотна послідовність якого вибрана з першої групи послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 2-8; б) CDR1 і CDR2, амінокислотні послідовності яких входять, як показано у таблиці 3, у число послідовностей, вибраних з другої групи амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 9-46, при зазначена друга послідовність містить відповідний CDR3, вибраний з зазначених у підпункті a). Згідно кращого варіанту здійснення винаходу імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени являють собою VHH. Згідно конкретних варіантів здійснення винаходу VHH мають амінокислотні послідовності, вибрані з послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 9-46. Відповідно до іншого конкретного варіанту здійснення винаходу VHH мають амінокислотні 13 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, вибрані з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 і SEQ ID NO: 25. Винахід належить і до VEGF-зв'язуючого компоненту, отриманому у результаті дозрівання афінності та / або оптимізації послідовності вищевказаного VHH, наприклад, до VHH, отриманому у результаті оптимізації послідовності VHH, амінокислотна послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 18. Прикладами є VHH, які мають амінокислотні послідовності, вибрані з послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 47–57. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу VEGF-зв'язуючий компонент, пропонований у винаході, можна форматувати згідно з методом, вказаною у цьому описі, наприклад, він може бути біпартопним або може містити два ідентичних імуноглобулінових одиничних варіабельних домена. Зазначені VEGF-зв'язуючі компоненти можуть містити два або більшу кількість VHH, які являють собою: а) ідентичні VHH, які мають здатність блокувати взаємодію людського рекомбінантного VEGF з людським рекомбінантним VEGFR-2 з рівнем інгібування ≥ 60%, або б) різні VHH, які зв'язуються з неперекривними епітопами VEGF, де щонайменше один VHH має здатність блокувати взаємодію людського рекомбінантного VEGF з людським рекомбінантним VEGFR-2 з рівнем інгібування ≥ 60%, і де зв'язування щонайменше одного VHH може блокувати вказану взаємодію з рівнем інгібування ≤ 60%. Відсоток блокування зазначеної взаємодії з рівнем інгібування ≥ 60% або ≤ 60% відповідно відноситься до рівня інгібування, визначеним за допомогою гомогенного аналізу посиленою за рахунок ефекту близькості люминисценции (AlphaScreen ), конкурентного ELISA, аналізу на основі резонансу плазмона (SPR) (Biacore), які застосовували у прикладах. Нижче у даному описі активність VHH згідно з підпунктом a), також позначають як «яка блокує рецептор» активність, а активність VHH згідно з підпунктом б) також позначають як «неблокуюча рецептор» активність. Краще для блокуючих рецептор VHH характерний рівень інгібування ≥ 80%, більш краще ≥ 90%; найкращі VHH є повними блокаторами рецептора, тобто для них характерний рівень інгібування, що дорівнює 100%. VEGF-зв'язуючий компонент може містити два або більшу кількість ідентичних VHH, зазначених у підпункті a), вибраних з VHH, амінокислотні послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 9-46, або VHH, отриманих у результаті дозрівання афінності та / або оптимізації послідовностей зазначених VHH. VHH можна вибирати з VHH, амінокислотні послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 47–57. Згідно кращого варіанту здійснення винаходу форматований VEGF-зв'язуючий компонент містить два VHH, кожен з яких має амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 57. У форматованих VEGF-зв'язуючих компонентах, які містять два різних VHH, а) вказаний (і) один або кілька VHH, для яких характерний рівень інгібування ≥ 60%, вибирають з: I. VHH, які мають амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 9-46, або II. VHH, які отримані у результаті дозрівання афінності та / або оптимізації послідовності зазначених VHH, і де б) вказаний (і) один або кілька VHH, для яких характерний рівень інгібування ≤ 60%, вибирають з I. SEQ ID NO: 58–124 або II. VHH, які отримані у результаті дозрівання афінності та / або оптимізації послідовностей зазначених VHH. Згідно кращого варіанту здійснення винаходу два VHH, які входять до поліпептиду, амінокислотні послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 128-168, розділені лінкерними послідовностями, зазначеними у таблиці 15. У кращему VEGF-зв'язуючому компоненті VHH, зазначений у підпункті a) I., має амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 18, і VHH, зазначений у підпункті б) I., має амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 64. В інших кращих VEGF-зв'язуючих компонентах VHH, зазначені у підпункті a) II., Вибирають з VHH, які мають амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 47-57, і VHH, зазначені у підпункті б) II., Вибирають з VHH , які мають амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 125–127. Найбільш кращим є біпаратопний VEGF-зв'язуючий компонент, який містить два VHH, один з яких має амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 57, і один з яких має амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 127. Ang2-зв'язуючий компонент містить щонайменше варіабельний домен з чотирма каркасними 14 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ділянками і трьома гіперваріабельними ділянками CDR1, CDR2 і CDR3 відповідно, і де вказаний CDR3 має амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотних послідовностей, які представлені у SEQ ID NO: 226, 229, 232, 235 , 238, 241, 244, 247, 250 або 253. Згідно другого об'єкту винаходу вказаний Ang2-зв'язуючий компонент являє собою виділений імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен або поліпептид, що містить один або кілька імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, де вказаний імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен містить чотири каркасних ділянки та три гіперваріабельних ділянки CDR1, CDR2 і CDR3 відповідно, і де CDR3 має амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотних послідовностей, які представлені у SEQ ID NO: 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250 або 253. Згідно наступного об'єкта винаходу вказаний імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен Ang2-зв'язуючого компонента містить а) CDR3, що має амінокислотну послідовність, вибрану з першої групи амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250 або 253 (див. також таблицю 49); б) CDR1, що має амінокислотні послідовності, які входять, як показано у таблиці 36-A, 38-A, 41-A або 45-A, у якості часткової послідовності у послідовність, вибрану з другої групи амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 224, 227 , 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248 або 251 (див. також таблицю 49); в) CDR2, що має амінокислотні послідовності, які входять, як показано у таблиці 36-A, 38-A, 41-A або 45-A у якості часткової послідовності у послідовність, вибрану з другої групи амінокислотних послідовностей, які представлені у SEQ ID NO: 225, 228 , 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249 або 252 (див. також таблицю 49). Краще імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен Ang2-зв'язуючого компонента являє собою VHH, краще має амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотних послідовностей, які представлені у SEQ ID NO: 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 або 223. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен Ang2-зв'язуючого компонента отримували шляхом дозрівання афінності або гуманізації імуноглобулінового одиничного варіабельного домена згідно з методом, представленому у даному описі. Аналогічно цьому, даний винахід належить і до VHH, отриманому шляхом дозрівання афінності або гуманізації VHH Ang2-зв'язуючого компонента згідно з методом, який представлений у даному описі. Даний винахід належить і до Ang2-зв'язуючого VHH, амінокислотна послідовність якого вибрана з амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 або 223. Прийнятними для здійснення процедури дозрівання афінності батьківськими Ang2зв'язуючими молекулами є, наприклад, описані вище VHH, амінокислотні послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 214, 215, 216, 217, 218 або 219. Таким чином, винахід стосується також Ang2-зв'язуючих молекул, одержаних шляхом дозрівання афінності та / або оптимізації послідовності вищевказаного VHH, наприклад, до VHH, який був отриманий шляхом оптимізації послідовності VHH, що має амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 217, 218 , 219, 220, 221, 222 або 223. Амінокислотні послідовності, які представляли собою «джерело», що застосовується для створення останніх VHH, представлені у SEQ ID NO: 214, 215 або 261. Крім того, ці амінокислотні послідовності придатні у якості Ang2-зв'язуючих компонентів, які можна застосовувати у зв'язуючих молекулах, пропонованих у даному винаході. Як зазначено у даному описі, зв'язуюча молекула, пропонована у даному винаході, краще містить щонайменше один компонент, що зв'язує сироватковий альбумін. Так, зокрема, кращі зв'язуючі молекули мають щонайменше один VEGF-зв'язуючий компонент, щонайменше один Ang2-зв'язуючий компонент і щонайменше один компонент, що зв'язує сироватковий альбумін. Порядок зазначених трьох зв'язуючих компонентів може являти собою будь-який можливий порядок, наприклад, порядок, представлений у таблиці 36-Б, 38-Б, 40, 41-Б, 42, 43, 45-Б, 46-A або 47-A або на фіг. 20, 23, 27 або 30, наприклад, VEGF -, Ang2-або зв'язуючий сироватковий альбумін компонент може знаходитися на N-кінці або на C-кінці. Зокрема, «1D01» (SEQ ID NО: 214), «11B07», «00027» (SEQ ID NО: 216), «00908», «7G08» (SEQ ID NО: 215), «00919», «00921 »(SEQ ID NО: 220),« 00928 »(SEQ ID NО: 221),« 00932 »,« 00933 »,« 00934 »,« 00935 »,« 00936 »,« 00937 »,« 00938 »(SEQ ID NО: 222) або «00956» (SEQ ID NО: 223) у таблицях і у описі до креслень позначають Ang2-зв'язуючі компоненти, а «00038» позначає VEGF-зв'язуючий 15 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 компонент і «ALB11» позначає компонент, зв'язуючий сироватковий альбумін. Жоден і них не обмежений конкретною послідовністю, а позначає Ang2-, VEGF - і зв'язуючий сироватковий альбумін компонент у цілому, при застосуванні у контексті можливих конструкцій зв'язуючих молекул, пропонованих у даному винаході. Однак краще, щоб компонент, зв'язуючий сироватковий альбумін, знаходився між VEGF - і Ang2-зв'язуючим компонентом (або навпаки), при цьому найбільш краще, щоб щонайменше один VEGF-зв'язуючий компонент знаходився на N-кінці, за ним слідував щонайменше один компонент, зв'язуючий сироватковий альбумін, а потім щонайменше один Ang2-зв'язуючий компонент, розташований на C-кінці. Встановлено, що такий порядок є найкращим.Таким чином, кращим об'єктом даного винаходу є зв'язуючі молекули, які містять щонайменше один VEGF-зв'язуючий компонент, щонайменше один Ang2-зв'язуючий компонент і щонайменше один компонент, зв'язуючий сироватковий альбумін, які мають амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотних послідовностей, представлених у SEQ ID NO: 180-213, Поняття «щонайменше один» зв'язуючий (VEGF, Ang2 або сироватковий альбумін) компонент при застосуванні у контексті даного опису вказує на те, що зв'язуюча молекула, пропонована у даному винаході, може містити один, два, три, чотири або п'ять зв'язуючих VEGF, Ang2 та / або сироватковий альбумін компонентів (тобто субстанцій / одиниць), які краще представляють собою імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, вказаний у даному описі. VEGF- та / або Ang2-зв'язуючі компоненти з поліпшеними з позицій терапевтичного застосування властивостями, наприклад, які мають підвищену афінність або знижену імуногенність, можна отримувати з індивідуальних VEGF-або Ang2-зв'язуючих компонентів за допомогою методик, відомих у даній галузі, таких як дозрівання афінності (наприклад , використовуючи у якості вихідних синтетичні, довільні або що зустрічаються у природних умовах послідовності імуноглобулінів), CDR-трансплантація, гуманізація, об'єднання фрагментів, отриманих з різних послідовностей імуноглобулінів, ПЛР-збірка з використанням що перекриваються праймерів та аналогічні методики, призначені для конструювання послідовностей імуноглобулінів, які добре відомі фахівцю у даній галузі; або будь-якій прийнятній комбінації будь-яких вищевикладених методів, позначених також як «оптимізація послідовностей». У якості посилання можна вказати, наприклад, стандартні посібники, а також можна використовувати приведений нижче опис і відомості, представлені у прикладах. При необхідності VEGF-або Ang2-зв'язуючий компонент, пропонований у винаході, з підвищеною афінністю одержують шляхом дозрівання іншого VEGF-або Ang2-зв'язуючого компонента, останній являє собою «батьківський» VEGF-або Ang2-зв'язуючий компонент щодо молекули з дозрілою афінністю. В анти-VEGF або анти-Ang2 VHH, запропонованих у винаході, що починаються з EVQ, Nкінцевий залишок E можна заміняти на D (що часто призводить до оптимізації послідовності) або він може бути відсутнім (для експресії VHH у E.coli). Для форматованих VEGF-зв'язуючих молекул, це застосовують, як правило, тільки для VHH, розташованих на N-кінці. Краща (але, не обмежуючись тільки нею) застосовувана з метою гуманізації заміна у VHHдоменах, що належать до 103 P, R, S-групи та / або GLEW-групі (що описано нижче), являє собою заміну 108Q на 108L. Методи гуманізації імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів відомі у даній галузі. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою доменне антитіло, представлене у даному описі. Згідно ще одному варіанту здійснення винаходу репрезентативні представники класу VEGFта / або Ang2-зв'язуючих імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, запропонованих у винаході, мають амінокислотні послідовності, які відповідають амінокислотній послідовності такого, що зустрічається у природних умовах VH-домена, який був «камелізований», тобто змінений шляхом заміни одного або декількох амінокислотних залишків у амінокислотній послідовності, що зустрічається у природних умовах варіабельної галузі важкого ланцюга канонічного що складається з 4 ланцюгів антитіла на один або кілька амінокислотних залишків, які перебувають у відповідному (их) положенні (ях) у VHH-домені що складається з важкого ланцюга антитіла. Це можна здійснювати добре відомим методом, який очевидний фахівцеві у даній галузі, і додаткову інформацію про який можна взяти з WO 1994/04678. Зазначена «камелізація» може охоплювати головним чином амінокислотні положення, які знаходяться у області контакту VH-VL, і так звані залишки-маркери верблюдових (див., наприклад, також WO 1994/04678). Детальний опис зазначених методів «гуманізації» і «камелізаціі» і кращі послідовності каркасних ділянок, які придатні для здійснення цих методів, можна додатково взяти з відомостей, представлених на с. 46 та с. 98 WO 2006/040153 і с. 107 WO 2006/122786. 16 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 VEGF-зв'язуючі компоненти, пропоновані у винаході, наприклад, імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, які мають специфічність відносно VEGF, оскільки вони містять один або кілька імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, специфічно зв'язуються з одним або декількома епітопами молекули VEGF. Вищесказане відноситься і до Ang2-зв'язуючих компонентів, пропонованих у винаході. Специфічне зв'язування VEGF-зв'язуючого компонента з антигеном VEGF можна визначати за допомогою будь-якого прийнятного добре відомого методу, включаючи, наприклад, представлені у даному описі методи, такі як аналіз Скетчарда та / або аналізи зв'язування у умовах конкуренції, такі як радіоімуноаналізи (РІА), ферментні імуноаналізи (ФІА та ELISA) та конкурентні «сендвіч»-аналізи і їх різні варіанти, добре відомі у даній галузі. Це ж відноситься до визначення зв'язування Ang2-зв'язуючого компонента з його антигеном. Відносно антигену VEGF VEGF-зв'язуючий компонент, пропонований у винаході, наприклад, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, не обмежений походженням з якого-небудь конкретного виду. Так, імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, пропоновані у винаході, краще зв'язуються з людським VEGF, якщо вони призначені для лікування людини. Однак імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, які зв'язуються з VEGF з інших видів ссавців, також підпадають під обсяг винаходу. Імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований у винаході, який зв'язується з VEGF з одного з видів, може володіти перехресної реактивність із VEGF, який має послідовність, відмінну від людської, з одного або декількох інших видів. Наприклад, імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, пропоновані у винаході, які зв'язуються з людським VEGF, можуть мати перехресної реактивність із VEGF з одного або декількох інших видів приматів і / або VEGF з одного або декількох видів тварин, яких використовують у якості тварин, на яких моделюють захворювання, наприклад, мавп, мишей, щурів, кроликів, свиней, собак, і, зокрема з тварин, на яких моделюють захворювання і порушення, асоційовані з опосередковуваними VEGF діями на ангіогенез (наприклад, у якості видів і тварин моделей, згаданих у цьому описі). Імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, пропоновані у винаході, які мають зазначену перехресну реактивність, є важливими для дослідницьких цілей та / або для розробки лікарських засобів, оскільки дозволяють тестувати імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, пропоновані у винаході, на визнаних моделях захворювань, створених на таких тваринах як мавпи, зокрема мавпи ціномолгус або макак резус, або миші і щури. У світлі перехресної реактивності з однією або декількома молекулами VEGF з видів, відмінних від людини, яка (і) призначена (ни) для застосування на тваринної моделі при розробці терапевтичного антагоніста VEGF, є кращим, коли VEGF-зв'язуючий компонент розпізнає епітоп у тій області який представляє інтерес VEGF, яка має високий ступінь ідентичності з людським VEGF. Імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований у винаході, розпізнає епітоп, який повністю або частково локалізовано у галузі VEGF, яка придатна для зв'язування з його рецептором, зокрема з VEGFR-2, який, як встановлено, є рецептором, активація якого обумовлює неоваскуляризацію пухлин. Згідно кращих об'єктів винаходу імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, пропоновані у винаході, блокують активацію VEGF-рецептора, зокрема активацію VEGFR-2, щонайменше частково, краще у значній мірі і найкраще повністю. Як зазначено вище, здатність VEGF-зв'язуючого компонента блокувати взаємодію між VEGF і його рецепторами, зокрема, VEGFR-2, можна визначати за допомогою гомогенного аналізу посиленою за рахунок ефекту близькості люминисценции (AlphaScreen ), конкурентного ELISA або аналізу на основі резонансу плазмона (SPR) (Biacore), які описані у прикладах. Краще зв'язування імуноглобулінового одиничного варіабельного домена, пропонованого у винаході, із VEGF характеризується величиною афінності, що становить менше 500нм, краще менше 200Нм, більш краще менше 10 нм, наприклад, менш 500пМ (що визначають за допомогою аналізу на основі резонансу поверхневого плазмона описаного у прикладі 5.7) . Вищесказане відноситься і до зв'язування імуноглобулінового одиничного варіабельного домена, пропонованого у винаході, із ангіопоетіну. Краще для імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, запропонованих у винаході, характерні величини IC50, виміряні за допомогою конкурентного ELISA, який описаний у -6 -10 -8 -10 прикладі 5.1, що становлять від 10 до 10 молей / л або менше, більш краще від 10 до 10 -9 -10 молей / л або менше і ще більш краще від 10 до 10 молей/л або менше. Згідно кращого варіанту здійснення винаходу який не обмежуває обсяг винаходу зв'язування з VEGF VEGF-зв'язуючих імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, запропонованих -5 у винаході, характеризується величиною константи дисоціації (KD), що становить від 10 до 10 12 -7 -12 -8 молей/л (M) або менше і краще від 10 до 10 молей/л (M) або менш і більш краще від 10 17 UA 114707 C2 -12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до 10 молей/л (M), та / або величиною константи асоціації (KA), що становить щонайменше 7 -1 8 -1 9 -1 10 M , краще щонайменше 10 M , більш краще щонайменше 10 M , наприклад, щонайменше 12 -1 10 M ; і зокрема, величиною KD, що становить менш 500Нм, краще менше 200Нм, більш краще менше 10 нм, наприклад, менш 500пМ. Таким чином, можна визначати величини KD і KA імуноглобулінового одиничного варіабельного домена, пропонованого у винаході, що характеризують зв'язування з VEGF. Зазначене відноситься і до зв'язуючого Ang2 імуноглобулінового одиничного варіабельності домену, пропонованого у винаході. Біпаратопні VEGF-зв'язуючі компоненти, які містять два чи більше імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, практично складаються з або містять (I) перший імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, специфічно зв'язується з першим епітопом VEGF, і (II) другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, специфічно зв'язується з другим епітопом VEGF, де перший епітоп VEGF і другий епітоп VEGF не є ідентичними епітопами. Іншими словами, вказаний поліпептид, пропонований у винаході, містить або практично складається з двох або більшої кількості імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, мішенню яких є по меншій два неперекривних епітопу, присутніх у VEGF, при цьому зазначені імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени пов'язані один з одним таким чином , щоб вони могли одночасно зв'язуватися з VEGF. У цьому плані поліпептид, пропонований у винаході, можна розглядати як «двовалентну» або «багатовалентну» іммуноглобуліновие конструкцію і перш за все як «багатовалентну конструкцію імуноглобулінового одиничного варіабельного домена», якщо поліпептид містить щонайменше два сайти зв'язування з VEGF. (Зазначені конструкції також позначають як «форматовані» VEGF-зв'язуючі молекули, наприклад, «форматовані» VHH). З відповідними змінами вказане належить і до біпаратопних Ang2-зв'язуючих компонентів. Зазначений VEGF-або Ang2-зв'язуючий компонент, пропонований у винаході, включає (щонайменше) два анти-VEGF або анти-Ang2 імуноглобулінових одиничних варіабельних домена, при цьому мішенню (зазначених) двох імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів краще є неперекривні епітопи молекули VEGF або молекули ангіопоетіну відповідно. Таким чином, ці два імуноглобулінових одиничних варіабельних домена повинні володіти специфічністю відносно різних антигенів і тому містити різні CDR-послідовності. З цієї причини зазначені поліпептиди, пропоновані у винаході, у контексті даного опису можна позначати також як «біпаратопні поліпептиди» або «біпаратопні конструкції доменних антитіл» (якщо імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени складаються або практично складаються з доменних антитіл), або «біпаратопні VHH-конструкції» (якщо імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени складаються або практично складаються з VHH) відповідно, оскільки два імуноглобулінових одиничних варіабельних домена повинні включати два різних паратопа. Якщо поліпептид, пропонований у винаході, являє собою біпаратопну молекулу, зазначену у цьому описі, то щонайменше один з компонентів імуноглобулінового одиничного варіабельного домена зв'язується з епітопом таким чином, що взаємодія між рекомбінантним людським VEGF і рекомбінантним людським VEGFR-2 блокується, що характеризується рівнем інгібування ≥80%. Як продемонстровано у експериментах, описаних у винаході, певні форматовані молекули містять два VHH, які обидва блокують рецептор VEGFR2, що характеризується рівнем інгібування ≥ 80%. Певні VHH, пропоновані у винаході, блокують VEGFR-2 з рівнем інгібування 100%, тобто вони є повними блокаторами. В обох випадках додаткові послідовності і фрагменти можуть бути присутніми у VEGFзв'язуючих молекулах, запропонованих у винаході, наприклад, на N-кінці, C-кінці або вони можуть бути локалізовані між двома імуноглобуліновими одиничними варіабельними доменами, наприклад, лінкерні послідовності і послідовності, що забезпечують ефекторні функції, які більш детально описані нижче. Відповідно до іншого, хоча і менш кращого варіанту здійснення винаходу, VEGF-зв'язуючий компонент, пропонований у винаході, може включати більше двох анти-VEGF імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, тобто три, чотири або навіть ще більша кількість анти-VEGF VHH. У цьому випадку щонайменше два з анти-VEGF імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів спрямовані проти неперекривних епітопів всередині молекули VEGF, а будь-який додатковий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен може зв'язуватися з будь-яким з двох неперекривних епітопів та / або додатковим епітопом, який присутній у молекулі VEGF. Згідно винаходу два чи більше імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів можуть незалежно один від одного являти собою VHH або доменні антитіла та / або будь-який інший вид імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, таких як VL-домени, зазначені у цьому описі, за умови, що ці імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени повинні зв'язуватися з 18 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигеном, тобто VEGF або ангіопоетіном відповідно. Детальний опис зв'язуючих компонентів представлено у основному для VEGF-зв'язуючого компонента. Однак всі особливості і характеристики, представлені у даному описі для VEGFзв'язуючого компонента, відносяться також (після внесення відповідних змін) і до Ang2зв'язуючого компоненту. Згідно кращого варіанту здійснення винаходу зв'язуючі молекули, присутні у біспеціфічних зв'язуючих молекулах (Ang2-зв'язуючі молекули у Ang2-зв'язуючому компоненті або VEGFзв'язуючі молекули у VEGF-зв'язуючому компоненті або два суміжних Ang2-і VEGF-зв'язуючих компонента), можна з'єднувати один з одним безпосередньо (тобто без застосування лінкера) або через лінкер. Лінкер краще являє собою пептидний лінкер і його вибирають так, щоб він давав зв'язуватися двом різним зв'язуючим молекулам з кожним з неперекривних епітопів на мішенях, які присутні або у одній і тій же молекулі-мішені, або у двох різних молекулах. У разі біпаратопних зв'язуючих молекул вибір лінкерів для Ang2-або VEGF-зв'язуючого компонента залежить серед іншого від епітопів і, зокрема, відстані між епітопами на мішені, з якими зв'язуються імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, і очевидний для фахівця у даній галузі на основі даного опису , необов'язково після проведення обмеженої кількості деяких рутинних експериментів. Дві зв'язуючі молекули (два VHH або доменних антитіла або VHH і доменне антитіло) або два зв'язуючих компонента можна з'єднувати один з одним через додатковий VHH або доменне антитіло відповідно (в таких зв'язуючих молекулах два чи більше імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів можна з'єднувати безпосередньо з додатковим імуноглобуліновим одиничним варіабільним доменом або за допомогою прийнятних лінкерів). Зазначені додаткові VHH або доменні антитіла можуть, наприклад, являти собою VHH або доменне антитіло, які забезпечують збільшений час напівжиття. Наприклад, останній VHH або останнє доменне антитіло може являти собою конструкцію, яка має здатність зв'язуватися з (людським) сироватковим білком, таким як (людський) сироватковий альбумін або (людський) трансферин. Альтернативно цьому, два чи більше імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, які зв'язуються з відповідною мішенню, можна з'єднувати у серії (або безпосередньо, або за допомогою прийнятного лінкера) і додатковий VHH або додаткове доменне антитіло (які можуть забезпечувати збільшений час напівжиття) можна з'єднувати безпосередньо або за допомогою лінкера з однією з цих двох або більшої кількості вищевказаних імуноглобулінових послідовностей. Прийнятні лінкери представлені у даному описі у поєднанні зі специфічними поліпептидами, пропонованими у винаході, і вони можуть, наприклад, містити (але, не обмежуючись тільки нею) амінокислотну послідовність, при цьому амінокислотна послідовність краще складається з 9 або більшої кількості амінокислот, більш краще по щонайменше з 17 амінокислот, наприклад, приблизно з 20-40 амінокислот. Однак, хоча верхня межа не має вирішального значення, але її вибирають, виходячи з міркувань придатності, наприклад, для біофармацевтичного виробництва таких поліпептидів. Лінкерна послідовність може являти собою послідовність, що зустрічається у природних умовах або послідовність, що не зустрічається у природних умовах. Для застосування у терапевтичних цілях лінкер краще є неімуногенним для індивідуума, якому вводять біспеціфічну зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході. Однією з придатних груп лінкерних послідовностей є лінкери, виведені з шарнірної галузі важкого ланцюга антитіл, описані вWO 1996/34103 і WO 1994/04678. Іншими прикладами є поліаланінові лінкерні послідовності, такі як Ala-Ala-Ala. Іншими кращими прикладами лінкерних послідовностей є Gly / Se-лінкери різної довжини, такі як (glyxsery)z-лінкери, включаючи (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3 і (gly3ser2)3. Деякі приклади лінкерів, які не обмежують обсяг винаходу, представлені у таблиці 15 (SEQ ID NO: 128 - 168), наприклад, лінкери GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (35GS; SEQ ID NO: 169); GGGGSGGGS (9GS; SEQ ID NO: 170); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (40GS; SEQ ID NO: 171). Якщо біспеціфічну зв'язуючу молекулу модифікують за допомогою приєднання полімеру, наприклад, поліетіленглікольного (ПЕГ) (поліетиленгліколь) фрагмента, то лінкерна послідовність краще включає амінокислотний залишок, такої як цистеїн або лізин, що дозволяє здійснювати модифікацію, наприклад, ПЕГілювання у лінкерній галузі. Прикладами лінкерів, придатних для ПЕГілювання, є: GGGGCGGGS (“GS9,C5”, SEQ ID NO: 172), GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS («GS25,C5», SEQ ID NO:173), 19 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG («GS27,C14», SEQ ID NO:174), GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS («GS35,C15», SEQ ID NO:175) і GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS («GS35,C5», SEQ ID NO:176). Крім того, лінкер може являти собою також полі (етиленглікольний) фрагмент, що описано, наприклад, у WO 2004/081026. В іншому варіанті здійснення винаходу імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени з'єднані один з одним через інший фрагмент (необов'язково за допомогою одного або двох лінкерів), такий як інший поліпептид, який у кращому, але не обмежуючому обсяг винаходу варіанті здійснення винаходу, може являти собою додатковий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, описаний вище. Зазначений фрагмент може або бути практично неактивним, або може мати біологічну активність, такою як поліпшення необхідних властивостей поліпептиду, або може надавати поліпептиду одне або кілька додаткових необхідних властивостей. Наприклад, фрагмент може (але, не обмежуючись тільки цим) подовжувати час напівжиття білка або поліпептиду і / або знижувати їх імуногенність або покращувати будь-яку іншу необхідну властивість. Згідно кращого варіанта здійснення винаходу біспеціфічна зв'язуюча молекула, пропонована у винаході, включає, перш за все, якщо вона призначена для застосування або її застосовують у якості терапевтичного агента, фрагмент, який подовжує час напівжиття поліпептиду, пропонованого у винаході, у сироватці або іншій спільній воді організму пацієнта. Поняття «час напівжиття» визначають як час, необхідний для зниження концентрації (модифікованого) поліпептиду на 50% in vivo, наприклад, у результаті розщеплення поліпептиду і / або кліренсу, та / або секвестрування за допомогою природних механізмів. Більш конкретно, зазначений подовжуючий час напівжиття фрагмент можна ковалентно пов'язувати або зливати з імуноглобуліновим одиничним варіабельний доменом, і він може являти собою (але, не обмежуючись лише ними) Fc-ділянку, залишок альбуміну, фрагмент залишку альбуміну, альбумінзвязуючий залишок, такий як імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен антитіла до альбуміну, трансферинзвязуючий залишок, такий як імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен антитіла до трансферину, поліоксіалкіленову молекулу, таку як, молекула поліетиленгліколю, альбумінзвязуючий пептид або похідне гідроксиетилкрохмалю (HES). В іншому варіанті здійснення винаходу біспеціфічна зв'язуюча молекула, пропонована у винаході, містить фрагмент, який зв'язується з антигеном, присутнім у крові, таким як сироватковий альбумін, сироваткові імуноглобуліни, тироксинзв'язуючий білок, фібриноген або трансферин, що подовжує час напівжиття in vivo утвореного поліпептиду, пропонованого у винаході. Згідно конкретного кращого варіанта здійснення винаходу зазначений фрагмент являє собою альбумінзвязуючий імуноглобулін і найбільш краще альбумінзвязуючий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, такий як альбумінзвязуючий VHH-домен. Зазначений альбумінзвязуючий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, якщо він призначений для застосування на людях, краще зв'язується з людським сироватковим альбуміном і краще являє собою гуманізований альбумінзвязуючий VHH-домен. Імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, які зв'язуються з людським сироватковим альбуміном, відомі у даній галузі і описані більш детально, наприклад, у WO 2006/122786. Зокрема, придатний для зв'язування з VHH альбумін являє собою ALB 1 і його гуманізовані копію ALB 8 (WO 2009/095489). Однак можна також з успіхом застосовувати інші альбумінзв'язуючі VHH-домени, згадані у вищевказаній патентній публікації. Найбільш прийнятним альбумінзвязуючим VHH-доменом є ALB8, який складається з або містить амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 98 або 254. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу два імуноглобулінових одиничних варіабельних домена, краще VHH, можна зливати з молекулою сироваткового альбуміну, як це описано, наприклад, у WO 2001/79271 і WO 2003/59934. Наприклад, відповідно до підходу, викладеному у WO 2001/79271, злитий білок можна отримувати за допомогою загальноприйнятої методики рекомбінації: молекулу ДНК, що кодує сироватковий альбумін, або її фрагмент пов'язують з ДНК, що кодує біпеціфічну зв'язуючу молекулу, одержану конструкцію вбудовують у плазміду, яку можна застосовувати для експресії у обраній клітині-хазяїні, наприклад, у клітині дріжджів типу Pichia pastoris, або у бактеріальній клітині, і потім клітинухазяїна трансфектувати злитою нуклеотидною послідовністю і вирощувати у прийнятних умовах. Послідовність людського сироваткового альбуміну (ЧСА), яку можна застосовувати, представлена в SEQ ID NO: 99. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу призводить до подовження часу напівжиття модифікація поліпептиду, пропонованого у винаході (зазначена модифікація знижує також 20 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 імуногенність поліпептиду), полягає у приєднанні придатного фармакологічно прийнятного полімеру, такого як полі (етиленгліколь) (ПЕГ) з прямим або розгалуженим ланцюгом або його похідні (наприклад, метоксіполі (етиленгліколь) або мПЕГ). Як правило, можна використовувати будь-яку прийнятну форму ПЕГілювання, таку як ПЕГілювання, відоме у цій галузі для антитіл і фрагментів антитіл (включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) доменні антитіла і scFvфрагменти); у якості посилання можна вказати, наприклад, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 2002, сс. 531-545; Veronese і Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 2003, сс. 453-456; і Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2, 2003 і WO 2004/060965. Крім того, у продаж надходять різні реагенти для ПЕГілювання поліпептидів, наприклад, від фірм Nektar Therapeutics, США або NOF Corporation, Японія, такі як серії Sunbright ® EA, серії SH, серії MA, серії CA і серії ME, такі як Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA і Sunbright® ME-400MA. Краще застосовують сайтнаправлене ПЕГілювання, зокрема через залишок цистеїну (див., наприклад, Yang та ін., Protein Engineering 16, 2003, сс. 761-770). Наприклад, для цієї мети ПЕГ можна приєднувати до залишку цистеїну, який у природних умовах присутній у поліпептиді, пропонованому у винаході, поліпептид, пропонований у винаході, можна модифікувати так, щоб у нього можна було вводити один або кілька залишків цистеїну для приєднання ПЕГ, або амінокислотну послідовність, яка містить один або кілька залишків цистеїну, призначених для приєднання ПЕГ, можна зливати з N-і / або C кінцем поліпептиду, пропонованого у винаході, для всіх зазначених підходів можна застосовувати методики конструювання білків, добре відомі фахівцю у даній галузі. Краще для поліпептидів, запропонованих у винаході, застосовують ПЕГ з молекулярною масою, що перевищує 5 кДа, наприклад перевищує 10 кДа, але більш низькою ніж 200 кДа, наприклад, більш низькою ніж 100 кДа; наприклад, що становить від 20 до 80 кДа. Відносно ПЕГілювання слід вказати, що, як правило, винахід належить і до будь біспеціфічної зв'язуючої молекули, яка ПЕГільована у одному або декількох амінокислотних положеннях, краще таким чином, що ПЕГілювання (1) або подовжує час напівжиття in vivo; (2) або знижує імуногенність, (3) або забезпечує одне або кілька додаткових цінних властивостей, добре відомих для ПЕГілювання; (4) або не робить істотного впливу на афінність поліпептиду з його мішенню (наприклад, не знижує зазначену афінність більш ніж на 50% і більш краще більш ніж на 10% при визначенні за допомогою прийнятного аналізу, описаного у даній галузі); та / або (5) або не робить впливу на будь-яке інше з необхідних властивостей біспецифічних зв'язуючих молекул, запропонованих у винаході. Прийнятні ПЕГ-групи та методи їх приєднання, або специфічні, або неспецифічні, добре відомі фахівцеві у даній галузі. Крім того, у продаж надходять різні реагенти для ПЕГілювання поліпептидів, наприклад, від фірм Nektar Therapeutics, США або NOF Corporation, Японія, такі як серії Sunbright ® EA, серії SH, серії MA, серії CA і серії ME, такі як Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA і Sunbright® ME-400MA. Відповідно до найкращого варіанта здійснення винаходу ПЕГільований поліпептид, пропонований у винаході, включає один ПЕГ-фрагмент лінійного ПЕГ з молекулярною масою 40 або 60 кДа, при цьому ПЕГ-фрагмент приєднаний до поліпептиду у лінкерній ділянці і, зокрема, до залишку Cys у положенні 5 лінкерного пептиду GS9, представленого у SEQ ID NO: 93, у положенні 14 лінкерного пептиду GS27, представленого у SEQ ID NO: 95, або у положенні 15 лінкерного пептиду GS35, представленого у SEQ ID NO: 96, або у положенні 5 лінкерного пептиду 35GS, представленого у SEQ ID NO: 97. Біспецифічну зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході, можна ПЕГілювати за допомогою одного із зазначених вище реагентів для ПЕГілювання, такого як «Sunbright ® ME-400MA», хімічна формула якого представлена нижче: Біспецифічні зв'язуючі молекули, які містять лінкер та / або забезпечують подовження часу напівжиття функціональні групи, мають послідовності, представлені у SEQ ID NO: 81 і на фіг. 48. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени являють собою доменні антитіла, як вони визначені у контексті даного опису. Імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, які присутні у біспецифічних зв'язуючих молекулах, запропонованих у винаході, можуть мати також послідовності, які відповідають VHдомену, що зустрічається у природних умовах який був «камелізований», тобто змінений шляхом заміни одного або декількох амінокислотних залишків у амінокислотній послідовності, 21 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що зустрічається у природних умовах варіабельної ділянки важкого ланцюга канонічного що складається з 4 ланцюгів антитіла на один або кілька амінокислотних залишків, які перебувають у відповідному (їх) положенні (ях) у VHH-домені що складається з важкого ланцюга антитіла. Це можна здійснювати добре відомим методом, який очевидний фахівцеві у даній галузі, додаткову інформацію про який можна почерпнути з WO 94/04678. Зазначена «камелізація» може охоплювати головним чином амінокислотні положення, які знаходяться у області контакту VHVL, і так звані залишки-маркери верблюдових (див., наприклад, також WO 94/04678). Детальний опис зазначених методів «гуманізації» і «камелізації» і переважні послідовності каркасних ділянок, які придатні для здійснення цих методів, можна додатково почерпнути з відомостей, представлених на с. 46 і с. 98 WO 2006/040153 і с. 107 WO 2006/122786. Зв'язуючі компоненти мають специфічність відносно Ang2 або VEGF відповідно, оскільки у кращому варіанті здійснення винаходу вони містять один або кілька імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, які специфічно зв'язуються з одним або декількома епітопами молекули Ang2 або молекули VEGF відповідно. Специфічне зв'язування зв'язуючої молекули з антигеном Ang2 або VEGF можна визначати за допомогою будь-якого прийнятного добре відомого методу, включаючи, наприклад, представлені у даному описі методи, такі як аналіз Скетчарда та / або аналізи зв'язування у умовах конкуренції, такі як радіоімуноаналізи (РІА), ферментні імуноаналізи (ФІА та ELISA) і «сенвіч»-аналізи у умовах конкуренції, і їх різні варіанти, добре відомі у даній галузі. Відносно антигену Ang2 або VEGF відповідно імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен не обмежений походженням з якого-небудь конкретного виду. Так, імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени краще зв'язуються з людським Ang2 чи людським VEGF відповідно, якщо вони призначені для лікування людини. При цьому імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, які зв'язуються з Ang2 або VEGF відповідно з інших видів ссавців, або поліпептиди, що містять їх, також підпадають під обсяг винаходу. Імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, який зв'язується з Ang2 або VEGF з одного з видів, може давати перехресну реакцію з відповідним антигеном з одного або декількох інших видів. Наприклад, імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, які зв'язуються з людським антигеном, можуть мати перехресну реактивність з відповідним антигеном з одного або декількох інших видів приматів і / або антигеном з одного або декількох видів тварин, яких застосовують як тварин, на яких моделюють захворювання, наприклад , мавп (зокрема ціномолгус або макака резус), мишей, щурів, кроликів, свиней, собак), зокрема з тварин, на яких моделюють захворювання і порушення, які можна модулювати шляхом інгібування Ang2 (наприклад, у якості видів і тварин моделей, згаданих у цьому описі). Імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, пропоновані у винаході, які мають зазначену перехресну реактивність, є важливими для дослідницьких цілей і / або для розробки лікарських засобів, оскільки дозволяють тестувати імуноглобулінові поодинокі варіабельні домени, пропоновані у винаході, на визнаних моделях захворювань, створених на таких тварин як мавпи, зокрема ціномолгус або макак резус, або миші і щури. Крім того, зв'язуючі компоненти молекули не обмежені або не визначені конкретним доменом або антигенною детермінантою антигену, який / яка є їх мішенню. Краще з позицій перехресної реактивності з однією або декількома молекулами антигенів з видів крім людини, яка (і) призначена (и) для застосування на тваринних моделях при розробці терапевтичного антагоніста Ang2/ VEGF, зв'язуючий компонент молекули розпізнає епітоп у області відповідного антигену, яка має високий ступінь ідентичності з людським антигеном. Наприклад, у разі мишачої моделі анти-Ang2 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, включений у біспеціфічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході, розпізнає епітоп, який повністю або частково локалізовано у EGF-2-домені Ang2, для якого характерна висока ідентичність при порівнянні людської та мишачої послідовності. Краще VEGF-зв’язуючий компонент зв’язується з ізоформами VEGF VEGF165 і/або VEGF121. Іншим об'єктом винаходу є молекули нуклеїнових кислот, які кодують біспеціфічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході. Зазначені молекули нуклеїнових кислот у контексті даного опису позначають також як «нуклеїнові кислоти, пропоновані у винаході», і вони можуть мати також форму генетичної конструкції, зазначеної у цьому описі. Нуклеїнова кислота, пропонована у винаході, може являти собою геномну ДНК, кДНК або синтетичну ДНК (таку як ДНК з кодонами, які найбільш часто зустрічаються, яка спеціально адаптована для експресії у вибраній клітині-хазяїні або організмі-хазяїні). Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу нуклеїнова кислота, пропонована у винаході, перебуває у практично виділеній формі, як зазначено вище у даному описі. Нуклеїнова кислота, пропонована у винаході, може мати також форму вектора, може бути 22 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 присутньою у векторі і / або представляти собою частину вектора, такого, наприклад, як плазміда, косміда або YAC. Вектор може представляти собою насамперед експресійний вектор, тобто вектор, який може забезпечувати експресію біспеціфічної молекули in vitro та / або in vivo (тобто у прийнятній / прийнятному клітині-хазяїні, організмі-хазяїні і / або експресійній системі). Зазначений експресійний вектор, як правило, містить щонайменше одну нуклеїнову кислоту, пропоновану у винаході, яка функціонально пов'язана з одним або декількома прийнятними регуляторними елементами, такими як промотор (и), енхансер (и), термінатор (и) і т.п . Зазначені елементи і їх відбір з позицій експресії конкретної послідовності у конкретному хазяїні знаходяться у компетенції фахівця у даній галузі. Конкретні приклади регуляторних елементів та інших елементів, придатних або необхідних для експресії біспецифічних зв'язуючих молекул, запропонованих у винаході, таких як промотори, енхансери, термінатори, фактори інтеграції, маркери для селекції, лідерні послідовності, репортерного гени і т.п., описані, наприклад, на сс.131-133 WO 2006/040153. Нуклеїнові кислоти, пропоновані у винаході, можна створювати або отримувати добре відомим методом (наприклад, шляхом автоматичного синтезу ДНК та / або методом рекомбінантної ДНК) на основі інформації про амінокислотних послідовностях поліпептидів, запропонованих у винаході, яка представлена в даному описі, та / або їх можна виділяти з придатного джерела, яке зустрічається у природних умовах. Наступним об'єктом винаходу є клітини-хазяїни, які експресують або у яких може відбуватися експресія однієї або декількох біспецифічних зв'язуючих молекул, запропонованих у винаході; та / або які містять нуклеїнову кислоту, пропоновану у винаході. у одному з конкретних кращих варіантів здійснення винаходу клітини-хазяїни являють собою бактеріальні клітини; іншими придатними клітинами є клітина дріжджів, клітини грибів або клітини ссавців. Прийнятними бактеріальними клітинами є клітини грамнегативних штамів бактерій, таких як штами Escherichia coli, Proteus і Pseudomonas, і грампозитивних штамів бактерій, таких як штами Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus і Lactococcus. Прийнятними грибними клітинами є клітини видів Trichoderma, Neurospora і Aspergillus. Прийнятними клітинами дріжджів є клітини видів Saccharomyces (наприклад, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (наприклад, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (наприклад, Pichia pastoris і Pichia methanolica) і Hansenula. Прийнятними клітинами ссавців є, наприклад, CHO-клітини, BHK-клітини, HeLa-клітини, COS-клітини і т.п. Однак можна використовувати також клітини амфібій, клітини комах, клітини рослин і будь-які інші клітини, які застосовують у цій галузі для експресії гетерологічних білків. Винахід належить і до способів отримання біспеціфічної зв'язуючої молекули, запропонованої у винаході, як правило, що полягає у тому, що здійснюють стадії, на яких: - культивують клітини-хазяїни, які містять нуклеїнову кислоту, що має здатність кодувати біспеціфічну зв'язуючу молекулу у умовах, які забезпечують експресію біспеціфічної зв'язуючої молекули, запропонованої у винаході; і - вивільняють або виділяють з культури поліпептид, який експресується клітинамихазяїнами; і - необов'язково додатково очищають і / або модифікують, та / або включають у препаративну форму біспеціфічну зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході. Для виробництва у промисловому масштабі кращими організмами-хазяїнами є штами E. coli, Pichia pastoris і S. cerevisiae, які придатні для великомасштабної експресії, виробництва та ферментації, і насамперед для великомасштабної експресії, виробництва та ферментації фармацевтичних продуктів. Вибір конкретної експресійної системи залежить, зокрема, від вимог до певних посттрансляційних модифікацій, більш конкретно до глікозилювання. Для отримання біспеціфічної зв'язуючої молекули, запропонованої у винаході, для якої глікозилювання є бажаним чи необхідним, потрібно застосовувати для експресії клітини-хазяїни ссавців, що мають здатність глікозилювати білок, який експресується. У цьому плані фахівцеві у даній галузі має бути очевидно, що отримана схема глікозилювання (тобто вид, кількість і положення приєднаних залишків) повинна залежати від клітини або клітинної лінії, яка застосовується для експресії. Біспецифічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході, можна отримувати або у клітині, відповідно до описаного вище методу, внутрішньоклітинно (наприклад, у цитозолі, періплазмі або у тільцях включення), а потім виділяти з клітин-хазяїв і необов'язково додатково очищати; або їх можна отримувати позаклітинно (наприклад, у середовищі, у якій культивують клітинихазяїни), а потім виділяти з культурального середовища і необов'язково додатково очищати. Методи і реагенти, які застосовують для отримання поліпептидів за допомогою рекомбінантної ДНК, такі як специфічні прийнятні експресійні вектори, методи трансформації або трансфекції, маркери для селекції, методи індукції експресії білків, умови культивування і 23 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 т.п., відомі у даній галузі. Аналогічно цьому методики виділення і очищення білків, застосовувані у методі виробництва поліпептиду, пропонованого у винаході, добре відомі фахівцю у даній галузі. Наступним об'єктом винаходу є пептид, який має амінокислотну послідовність CDR3, що входить у конструкцію анти-VEGF-VHH, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотних послідовностей, які представлені у SEQ ID NO: 9-57 і чи SEQ ID NO: 58-127 відповідно, і молекула нуклеїнової кислоти, яка його кодує. Ці пептиди відповідають CDR3, виведеним з VHH, запропонованих у винаході. Їх, зокрема, молекули нуклеїнових кислот, які кодують їх, можна застосовувати для трансплантації CDR для того, щоб замінювати CDR3 у ланцюзі імуноглобуліну або для інсерції у неімуноглобуліновий каркас, наприклад, інгібітор протеази, ДНК-зв'язуючий білок, цитохром b562, що складається з пучка спіралей білок, пов'язаний дисульфідним містком пептид, ліпокаїн або антикалін, які надають вказаному каркасу здатність зв'язуватися з мішенню. Метод трансплантації CDR добре відомий у даній галузі і його широко застосовували, наприклад, для гуманізації антитіл (які, як правило, містить CDR з антитіла гризунів, трансплантовані у каркасні ділянки Fv людського антитіла). Для отримання імуноглобулінового або неімуноглобулінового каркаса, що містить CDR3, пропонований у винаході, ДНК, яка кодує зазначену молекулу, можна отримувати за допомогою стандартних методів молекулярної біології, наприклад, за допомогою синтезу генів, «відпалу» олігонуклеотидів або на основі перекриваються ПЛР-фрагментів, які описані, наприклад, у Daugherty та ін., Nucleic Acids Research, т. 19, 9, 1991, сс. 2471-2476. Метод інсерції CDR3 VHH у неімуноглобуліновому каркас описаний у Nicaise та ін., Protein Science, 13, 2004, сс. 18821891. Винахід належить і до продукту або композиції, що містить / містить щонайменше одну біспеціфічну зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході, і необов'язково один або кілька добре відомих додаткових компонентів зазначених композицій, тобто які залежать від передбачуваного застосування композиції. Для фармацевтичного застосування на основі біспеціфічної зв'язуючої молекули, запропонованої у винаході, або поліпептиду, який її містить, можна приготовляти форми у вигляді фармацевтичного препарату або композиції, що містить / містить щонайменше одну біспеціфічну зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході, і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій, розчинник або ексципієнт та / або ад'ювант і необов'язково один або кілька додаткових фармацевтично активних поліпептидів і / або сполук. Прикладами таких препаративних форм є (але, не обмежуючись лише ними) форми, придатні для орального введення, для парентерального введення (наприклад, за допомогою внутрішньовенної, внутрішньом'язової або підшкірної ін'єкції або внутрішньовенної інфузії), для місцевого застосування, для застосування шляхом інгаляції, за допомогою шкірного пластиру, за допомогою імплантату, супозиторія і т.д. Зазначені прийнятні для введення форми, які можуть бути твердими, напівтвердими або рідкими залежно від шляху введення, а також методи і носії для їх застосування у препаратах, повинні бути очевидні фахівцеві у даній галузі і додатково представлені у даному описі. Таким чином, наступним об'єктом винаходу є фармацевтична композиція, яка містить щонайменше одну біспеціфічну зв'язуючу молекулу, зокрема один імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований у винаході, або поліпептид, який його містить, і щонайменше один прийнятний носій, розріджувач або ексципієнт (тобто придатний для фармацевтичного застосування) і необов'язково одну або декілька додаткових активних субстанцій. Біспецифічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході, можна включати у препаративну форму і вводити за допомогою будь-якого придатного добре відомого методу: див посилання, які стосуються передусім імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, наприклад, у WO 2004/041862, WO 2004/041863, WO 2-04/041865, WO 2004/041867 у WO 2008/020079, а також у стандартних довідниках, таких як Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е вид., вид-во Mack Publishing Company, США, 1990, Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21-е вид., видво Lippincott Williams і Wilkins, 2005 або Handbook of Therapeutic Antibodies, під ред. S. Dubel, вид-во Wiley, Weinheim, 2007 (див., наприклад, сс. 252-255). Наприклад, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований у винаході, можна включати у препаративну форму і вводити будь-яким методом, широко застосовуваним для канонічних антитіл і фрагментів антитіл (включаючи ScFv і димерні антитіла) та інших фармацевтично активних білків. Зазначені препаративні форми і методи їх отримання повинні бути очевидні фахівцеві у даній галузі і, наприклад, включають препарати, придатні для 24 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 парентерального введення (наприклад, внутрішньовенного, внутрішньочеревного, підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньопросвітного, внутрішньоартеріального або внутрішньооболонкового введення) або для місцевого (тобто трансдермального або внутрішньодермального) застосування. Препарати для парентерального введення можуть являти собою, наприклад, стерильні розчини, суспензії, дисперсії або емульсії, які можна застосовувати для інфузії або ін'єкції. Прийнятними носіями чи розчинниками для таких препаратів є, наприклад (але не обмежуючись лише ними) стерильна вода і фармацевтично прийнятні водні буфери і розчини, такі як забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Рінгера, розчин декстрози, розчин Хенкса; водні розчини олій; гліцерин; етанол; гліколі, такі як пропіленгліколь, або також мінеральні олії, тваринні олії і рослинні олії, наприклад, арахісова олія, соєва олія, а також їх прийнятні суміші. Як правило, кращими є водні розчини або суспензії. Так, біспеціфічну зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході, можна вводити системно, наприклад, орально, у поєднанні з фармацевтично прийнятним наповнювачем, таким як інертний розріджувач або засвоюваний їстівний носій. Для орального терапевтичного застосування біспеціфічну зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході, можна об'єднувати з одним або декількома ексципієнтами і застосовувати у формі призначених для прийому всередину таблеток, трансбуккальних таблеток, пастилок, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, облаток і т.п. Зазначені композиції і препарати повинні містити Dll4 зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході, у кількості, що становить щонайменше 0,1%. Зазначене процентний вміст у композиціях і препаратах може, природно, варіюватися і може, як правило, становити від приблизно 2 до приблизно 60% у перерахунку на масу зазначену стандартної дози лікарського засобу. Кількість біспеціфічної зв'язуючої молекули, запропонованої у винаході, у призначених для терапевтичного застосування композиціях є таким, щоб отримувати ефективний рівень доз. Таблетки, пігулки, капсули і т.п. можуть містити також пов'язуючі агенти, ексципієнти, розпушувачі, замаслювачі і підсолоджуючі речовини або коригенти, наприклад, згадані на сс. 143-144 WO 2008/020079. Коли стандартна доза лікарського засобу являє собою капсулу, то вона може містити крім продуктів зазначеного вище типу рідкий носій, такий як рослинна олія або поліетиленгліколь. Різні інші матеріали можуть бути присутніми у вигляді покриттів або їх можна застосовувати для іншої модифікації фізичної форми твердої стандартної дози лікарського засобу . Наприклад, на таблетки, пігулки та капсули можна наносити покриття з желатину, воску, шелаку або цукру і т.п. Сироп або еліксир може включати біспеціфічні зв'язуючі молекули , пропоновані у винаході, сахарозу або фруктозу у якості підсолоджуючої речовини, метил- і пропілпарабен у якості консервантів , барвник і коригенти, такий як вишнева або апельсинова віддушка. Звичайно, будь-який продукт, застосовуваний для приготування будьякої стандартної дози лікарського засобу, повинен бути фармацевтично прийнятним і практично нетоксичним у застосовуваних кількостях. Крім того, біспеціфічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході, можна включати у препарати або пристрої з уповільненим вивільненням. Препарати та форми для орального введення можуть мати також ентеросолюбільне покриття, яке дозволяє конструкціям, пропонованим у винаході, зберігатися у середовищі шлунка і проходити у кишечник. Більш конкретно препарати і форми для орального введення можна готувати у вигляді, який дозволяє здійснювати введення у необхідний відділ шлунковокишкового тракту. Крім того, для введення у шлунково-кишковий тракт можна застосовувати супозиторії. Біспецифічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході, можна вводити також внутрівенно або внутрішньочеревно за допомогою інфузії або ін'єкції, що більш докладно описано на сс. 144 і 145 WO 2008/020079. У разі призначених для місцевого застосування біспецифічних зв'язуючих молекул, запропонованим у винаході,їх потрібно наносити на шкіру у вигляді композицій або форм у поєднанні з прийнятним для дерматологічного застосування носієм, який може бути твердим або рідким, що більш докладно описано на с. 145 WO 2008/020079. Як правило, концентрація біспецифічних зв'язуючих молекул, запропонованим у винаході, у рідкій композиції, такій як лосьйон, повинна складати приблизно 0,1 25 мас.%, краще приблизно 0,5 10 мас.%. Концентрація у напівтвердій або твердій композиції, такий як гель або порошок, повинна складати приблизно 0,1-5 мас.%, краще приблизно 0,5-2,5 мас.%. Кількість біспецифічних зв'язуючих молекул, запропонованим у винаході, яка потрібна для лікування, має варіюватися не тільки залежно від конкретної вибраної біспеціфічної зв'язуючої молекули, але також від шляху введення, природи стану, що підлягає лікуванню, і віку та стану пацієнта, і, врешті-решт , вона визначається приписом лікаря або клініциста. Крім того, доза 25 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біспецифічних зв'язуючих молекул, запропонованих у винаході, варіює залежно від клітини-, пухлини-, тканини-, трансплантата-або органа-мішені. Необхідну дозу, як правило, можна застосовувати у вигляді одноразової дози або у вигляді розділених доз, які призначені для введення з відповідними інтервалами, наприклад, у вигляді двох, трьох, чотирьох або більшої кількості субдоз у день. Режим введення самих субдоз можна додатково розділяти, наприклад, на ряд введень, розділених «порожніми» проміжками без обробки; наприклад, на кілька інгаляцій з використанням інсуфлятора, або шляхом внесення декількох крапель у око. Схема введення може включати пролонговану щоденну обробку. Під «пролонгованою» мають на увазі обробку протягом періоду часу, що складає щонайменше два тижні і краще кілька тижнів, місяців або років. Необхідність змін у цій схемі прийому доз може визначати звичайний фахівець у даній галузі за допомогою загальноприйнятих експериментів, зазначених у цьому описі (див., Remington's Pharmaceutical Sciences, під ред. Martin EW, 4-е вид., вид-во Mack Publishing Co., Easton, PA). Дозу може регулювати також кожен лікуючий лікар у разі будьяких ускладнень. Ще одним варіантом здійснення винаходу є застосування біспецифічних зв'язуючих молекул, наприклад, імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів або містять поліпептидів, для наступних терапевтичних цілей: - для попередження, лікування та / або полегшення порушення, захворювання чи стану, насамперед у людини, яке асоційоване з опосередковуваними VEGF та / або пов'язаними з Ang2 впливами на ангіогенез, або яке можна попереджати, лікувати або полегшувати допомогою модуляції шляхи передачі сигналів Notch і / або передачі сигналів Tie2 за допомогою біспеціфічної зв'язуючої молекули, запропонованої у винаході, - у способі лікування пацієнта, який потребує такої терапії, що полягає у тому, що вводять індивідууму, який потребує цього, у фармацевтично активній кількості щонайменше одну біспеціфічну зв'язуючу молекулу, пропоновану у винаході, наприклад імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, або що містить їх фармацевтичну композицію; - для приготування лікарського засобу, призначеного для попередження, лікування або полегшення порушень, захворювань або станів, асоційованих з опосередковуваними VEGF та / або опосередковуваними Ang2 впливами на ангіогенез; - у якості діючої речовини у фармацевтичній композиції або лікарському засобі, застосовуваної / вживаному для зазначених вище цілей. Згідно конкретного об'єкта винаходу порушення, захворювання або стан являє собою рак або злоякісне захворювання, зазначена у цьому описі. Згідно іншому об'єкту винаходу захворювання являє собою очну хворобу, асоційовану з опосередковуваними VEGF та / або опосередковуваними Ang2 впливами на ангіогенез, або яку можна лікувати або полегшувати допомогою модуляції шляху передачі сигналів Notch і / або передачі сигналів Tie2 за допомогою біспеціфічної зв'язуючої молекули. Залежно від що підлягає лікуванню злоякісного захворювання біспеціфічну зв'язуючу молекулу можна застосовувати індивідуально або у поєднанні з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами, зокрема, вибраними з хіміотерапевтичних засобів типу пошкоджуючих ДНК агентів або терапевтично активних сполук, які інгібують ангіогенез, шляхи трансдукції сигналів або точки контролю мітозу у ракових клітинах. Додаткові терапевтичні засоби можна вводити одночасно, необов'язково у вигляді компонента одного і того ж фармацевтичного препарату, або до, або після введення біспеціфічної зв'язуючої молекули. У конкретних варіантах здійснення винаходу додатковий терапевтичний засіб може являти собою (але, не обмежуючись лише ними) один або кілька інгібіторів, вибраних з групи інгібіторів EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK і PI3-кінази, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, PDK1, PTK2, IGF R або IR. Іншими прикладами додаткових терапевтичних агентів є інгібітори CDK, Akt, src / bcr abl, cKit, cMet / HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, антагоністи hedgehog, інгібітори JAK / STAT, Mek, mTor, NFкаппаB, протеосом, Rho, інгібітор шляху передачі сигналів wnt або інгібітор шляху убікітінізації або інший інгібітор шляху передачі сигналів Notch. Прикладами інгібіторів кінази Aurora є (але, не обмежуючись тільки ними) PHA-739358, AZD1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735. Прикладом інгібітора PLK є GSK-461364. Прикладами інгібіторів raf є BAY-73-4506 (який є також інгібітором VEGFR), PLX 4032, RAF 265 (який є також інгібітором VEGFR), сорафеніб (який є також інгібітором VEGFR) і XL 281. Прикладами інгібіторів KSP є іспінесіб, ARRY-520, AZD-4877, CK 1122697, GSK 246053A, 26 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 GSK-923295, MK-0731 і SB-743921. Прикладами інгібіторів src і / або bcr-abl є дасатініб, AZD-0530, босутініб, XL 228 (який є також інгібітором IGF-1R), нілотініб (який є також інгібітором PDGFR і cKit), іматиніб (який є також інгібітором cKit) і NS-187. Прикладом інгібітора PDK1 є BX-517. Прикладом інгібітора Rho є BA-210. Прикладами інгібіторів PI3-кінази є PX-866, BEZ-235 (який є також інгібітором mTor), XL 418 (який є також інгібітором Akt), XL-147 і XL 765 (який є також інгібітором mTor). Прикладами інгібіторів cMet або HGF є XL-184 (який є також інгібітором VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (який є також інгібітором VEGFR), MGCD-265 (який є також інгібітором VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102 і AV-299. Прикладом інгібітора c-Myc є CX-3543. Прикладами інгібіторів Flt3 є AC-220 (який є також інгібітором cKit and PDGFR), KW 2449, лестауртініб (який є також інгібітором VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (який є також інгібітором JAK2), XL-999 (який є також інгібітором cKit, FGFR, PDGFR і VEGFR), сунітініб (який є також інгібітором PDGFR, VEGFR і cKit) і тандутініб (який є також інгібітором PDGFR і cKit). Прикладами інгібіторів HSP90 є танеспіміцін, алвеспіміцін IPI-504 і CNF 2024. Прикладами інгібіторів JAK / STAT є CYT-997 (який взаємодіє також з тубуліном), TG 101 348 (який є також інгібітором Flt3) і XL-019. Прикладами інгібіторів Mek є ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 і XL 518. Прикладами інгібіторів mTor є темсіролімус, AP-23573 (який діє також як інгібітор VEGF), еверолімус (крім того, є інгібітором VEGF), XL-765 (який є також інгібітором PI3-кінази) і BEZ-235 (який є також інгібітором PI3 -кінази). Прикладами інгібіторів Akt є періфосін, GSK-690693, RX-0201 і тріцірібін. Прикладами інгібіторів cKit є AB-1010, OSI-930 (який діє також у якості інгібітора VEGFR), AC-220 (який є також інгібітором Flt3 і PDGFR), тандутініб (який є також інгібітором Flt3 і PDGFR), аксітініб (який є також інгібітором VEGFR і PDGFR), XL-999 (який є також інгібітором Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), сунітініб (який є також інгібітором Flt3, PDGFR, VEGFR) і XL-820 (який діє також як інгібітор VEGFR і PDGFR), іміаініб (який є також інгібітором bcr-abl), нілотініб (який є також інгібітором bcr-abl і PDGFR). Прикладами антагоністів hedgehog є IPI-609 і CUR-61414. Прикладами інгібіторів CDK є селіцікліб, AT-7519, P-276, ZK-CDK (який є також інгібітором VEGFR2 і PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 і AG 024322. Прикладами інгібіторів протеосоми є бортезоміб, карфілзоміб і NPI-0052 (який є також інгібітором NFкаппаB). Прикладом інгібітора NFкаппаB-шляху є NPI-0052. Прикладом інгібітора шляху убікітінізаціі є HBX-41108.У кращих варіантах здійснення винаходу додатковий терапевтичний засіб являє собою антиангіогенний агент. Прикладами антиангіогенних агентів є інгібітори FGFR, PDGFR і VEGFR або відповідні ліганди (наприклад, інгібітори VEGF типу пегаптаніба або антитіло до VEGF бевасізумаб) і талідомід, вказані агенти вибрані з групи, що включає (але, не обмежуючись лише ними) бевасізумаб, мотесаніб, CDP-791, SU 14813, телатініб, KRN-951, ZK-CDK (який є також інгібітором CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiD (імумономодуляторні лікарські засоби), похідне талідоміду CC-4047, леналідомід, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, бріваніб, цедіраніб, XL-999 (який є також інгібітором cKit і Flt3), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (який є також інгібітором Flt3), сунітініб (який є також інгібітором cKit і Flt3), аксітініб (який є також інгібітором cKit), лестауртініб (який є також інгібітором Flt3 і PKC), ваталаніб, тандутініб (який є також інгібітором Flt3 і cKit), пазопаніб, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, сорафеніба тозилат (який є також інгібітором Raf) , RAF-265 (який є також інгібітором Raf), вантетаніб, CP-547632, OSI-930, AEE788 (EGFR і Her2), BAY-57-9352 (який є також інгібітором Raf), BAY-73-4506 (який також є інгібітором Raf), XL 880 (який є також інгібітором cMet), XL 647 (який є також інгібітором EGFR і EphB4), XL 820 (який є також інгібітором cKit) і нілотініб (який є також інгібітором cKit і brc-abl). Додатковий терапевтичний засіб можна вибирати також з інгібіторів EGFR, воно може являти собою низькомолекулярний інгібітор EGFR або антитіло до EGFR. Прикладами антитіл до EGFR є (але, не обмежуючись лише ними) цетуксимаб, панітумумаб, матузумаб; прикладом низькомолекулярного інгібітора EGFR є гефітиніб. Іншим прикладом модулятора EGFR є кон'югат EGF з токсином. З інгібіторів EGFR і Her2, які можна застосовувати у поєднанні з біспеціфічною зв'язуючою молекулою, запропонованою у винаході, слід згадати лапатініб, гефітиніб, ерлотиніб, 27 UA 114707 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цетуксимаб, трастузумаб, німотузумаб, залутумумаб, вандетаніб (який є також інгібітором VEGFR), пертузумаб, XL 647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS690514, JNJ 26483327, AEE-788 (який є також інгібітором VEGFR), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab. Іншими агентами, які доцільно застосовувати для лікування у поєднанні з біспеціфічною зв'язуючою молекулою, запропонованою у винаході, є тосітумумаб і ібрітумомаба тіуксетан (два мічених за допомогою радіоактивних ізотопів антитіла до CD20), алемтузумаб (антитіло до CD52), деносумаб (інгібітор ліганда фактора диференціювання остеокластів ), галіксімаб (антагоніст CD80), офатумумаб (інгібітор CD20), занолімумаб (антагоніст CD4), SGN40 (модулятор ліганда рецептора CD40), ритуксимаб (інгібітор CD20) або мапатумумаб (агоніст рецептора TRAIL-1), REGN421(SAR153192) або OMP-21M18 (інгібітори Dll4). Іншими хіміотерапевтичними лікарськими засобами, які можна застосовувати у поєднанні з біспеціфічними зв'язуючими молекулами, пропонованими у даному винаході, є (але, не обмежуючись лише ними) гормони, аналоги гормонів і антигормональні засоби (наприклад, тамоксифен, тореміфен, ралоксифен, фулвестрант, мегестрола ацетат, флутамид, нілутамід, бікалутамід, ципротерону ацетат, фінастерід, бусереліна ацетат, флудрокортизон, флуоксиместерон, медроксипрогестерон, остреотід, арзоксіфен, пасіреотід, вапреотід), інгібітори ароматази (наприклад, анастрозол, летрозол, ліарозол, ексеместан, атаместан, форместан), агоністи і антагоністи LHRH (наприклад, госерелін ацетат, леупролід, абарелікс, цетрорелікс, деслорелін, гістрелін, трипторелін), антіметаболіти (наприклад, антифолатів типу метотрексату, пеметрекседу , аналоги піримідину типу 5 фторурацилу, капецитабіну, децітабіна, неларабіна і гемцитабіну, аналоги пурину і аденозину, такі як меркаптопурина тіогуанін, кладрибін і пентостатином, цитарабін, флударабин); протипухлинні антибіотики (наприклад, антрацикліни, такі як доксорубіцин, даунорубіцин, епірубіцин та ідарубіцин, мітоміцин-C, блеоміцин, дактіноміцін, плікаміцін, мітоксантрон, піксантрон, стрептозоцином); похідні платини (наприклад, цисплатин, оксаліплатин, карбоплатин, лобаплатін, сатраплатін); алкілюючі засоби (наприклад, естрамустин, меклоретамін, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, дакарбазін, циклофосфамід, іфосфамід, гідроксисечовина, темозоломід, нітрозосечовини, такі як кармустин і ломустін, тіотепа); антімітотічні засоби (наприклад, алкалоїди барвінку типу вінбластину, віндесіна, вінорельбіну, вінфлуніна і вінкристину; і таксани, такі як паклітаксел, доцетаксел та їх препаративні форми, ларотаксел; сімотаксел і епотілони типу іксабепілона, патупілона, ZKEPO); інгібітори топоізомерази (наприклад, епіподофіллотоксіни, такі як етопосид і етопофос, теніпосід, амсакрин, топотекан, іринотекан) і хіміотерапевтичні агенти змішаного типу, такі як аміфостин, анагрелід, інтерферон альфа, прокарбазин, мітотан і порфімер, бексаротен , целекоксиб. Ефективність біспецифічних зв'язуючих молекул, запропонованих у винаході, або які містять їх поліпептидів або які містять їх композицій можна оцінювати за допомогою прийнятного аналізу in vitro, клітинного аналізу, аналізу in vivo та / або на добре відомих тварин моделях, або за допомогою будь-якої їх комбінації залежно від специфічного представляє інтерес захворювання або порушення. Прийнятні аналізи і тварини моделі очевидні фахівцеві у даній галузі, і вони представляють собою аналізи, представлені у даному описі, і вживані нижче у прикладах, наприклад, аналіз проліферації. Дані, отримані у експериментах, проведених при створенні винаходу, підтверджують, що біспеціфічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході, мають властивості, які перевищують властивості зв'язуючих молекул, відомих з існуючого рівня техніки. Однією із зазначених властивостей є повне інгібування взаємодії VEGF165-VEGFR2 і низьке значення IC50, яке можна розраховувати, наприклад, на основі отриманих за допомогою ELISA даних, представлених на фіг. 1 і у таблиці 5, а також значення IC 50 (нM) для VHH за даними AlphaScreen-аналізу, які представлені на фіг. 3, 17, 18 і у таблиці 7; і дані про рівень афінності K D (нM) очищених VHH до рекомбінантного людського VEGF і мишачого VEGF, які представлені у таблиці 9, 10 і на фіг. 5. Крім того, що видно з таблиці 13, зв'язуючі VEGF агенти, пропоновані у винаході, мають високу ефективність, тобто при застосуванні у концентраціях, що знаходяться у субнаномолярному діапазоні, при оцінці проліферації клітин лінії HUVEC. Ці дані свідчать про те, що біспеціфічні зв'язуючі молекули, пропоновані у винаході, є перспективними кандидатами, які можуть мати терапевтичну ефективністю щодо захворювань і порушень, асоційованих з опосередковуваними VEGF-впливами на ангіогенез, таких як рак. Іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб діагностування захворювання, що полягає у тому, що a) приводять у контакт зразок зі зв'язуючою молекулою, запропонованою у винаході, і б) визначають зв'язування зазначеної зв'язуючої молекули з зразком і 28