Фармацевтична композиція, що впливає на функцію систем vegf/рецептор vegf і ангіопоетин/рецептор тіе (іі), та її застосування

1. Фарм ацевтична ком позиція, яка містить як сполуку I один або декілька агентів, що інгібую ть біологічну функцію однієї або декількох систем фактор росту ендотелію судин VE GF/рецептор VE GF, і яка м істить як сполуку II один або декілька агентів, що інгібую ть біологічну функцію однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie, де сполука I являє собою бісукцинат (4-хлорфеніл)[4(4-піридилм етил)фталазин-1-іл]ам онію, сполуку s Tie2, моноклональне антитіло МАт 4301-42-35, кон‘югат s cFv-tTF і/або кон‘югат L19 s cFv-tTF, а сполука II являє собою бісукцинат (4хлор феніл)[4-(4-піридилм етил)фталазин-1іл]ам онію, сполуку s Tie2, м оноклональне антитіло МАт 4301-42-35, кон‘югат s cFv-tTF і/або кон‘югат L19 s cFv-tTF за ум ови, що сполука I не є ідентичною до сполуки II. 2. Фарм ацевтична ком позиція за п. 1, яка м істить як сполуку I бісукцинат (4- хлорфеніл)[4-(4піридилм етил)фталазин-1-іл]ам онію, а як сполуку II м істить сполук у s Tie2, м оноклональне антитіло C2 2 UA 1 3 79733 VEGF і родину тирозинкіназних рецепторів (Tie), що містять подібні до імуноглобуліну домени, які мають гомологію до епідермального фактора росту . Представники двох родин тирозинкіназних рецепторів експресуються, в основному, в ендотеліальних клітинах. Родина рецепторів VEGF включає Flt1 (VEGF-R1), Flk1/KDR (VEGF-R2) і Flt4 (VEGF-R4). Ці рецептори розпізнаються представниками факторів росту, що пов'язані з VEGF, при цьому лігандами для Flt1 є VEGF та плацентарний ростовий фактор (PIGF), у той час як Flk1/KDR зв'язується з VEGF, VEGF-C і VEGF-D, а лігандами для Flt4 є VEGF-C і VEGF-D [Nicosia, Am. J. Pathol. 153,11-16, 1998]. Представниками другої родини тирозинкіназних рецепторів, що володіють специфічністю по відношенню до ендотеліальних клітин, є Тіe1 і Тіе2 (також відомий під назвою Теk). У той час як Тіe1 є орфановим рецептором, було виявлено три глікопротеїнові ліганди Тіе2, що секретуються , а саме Ang1, Ang2 і Ang3/Ang4 [Davis та ін., Cell 87, 1167-1169, 1996; Maisonpierre та ін., Science 277, 55-60, 1997; Valenzuella та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1904-1909; патенти US 5521073, 5650490, 5814464]. Важлива роль, яку відіграють VEGF та його рецептори в процесі розвитку судинної системи, була продемонстрована в дослідах по спрямованій інактивації генів. Навіть гетерозиготне порушення гена VEGF викликає дефіцит васкуляризації, що має фатальне значення [Carmeliet та ін., Nature 380, 435-439, 1996; Ferrara та ін., Nature 380, 439-442, 1996]. Миші, що мають гомозиготні порушення в гені Flt1 або гені Flk1/KDR, гинуть в результаті виникнення гострих ушкоджень судин. Проте існують відмінності у фенотипах, що полягають у тому, що у мишей з «виключеним» геном Flk1/KDR відсутні як ендотеліальні клітини, так і гемопоетична система, що розвивається [Shalaby та ін., Nature 376, 62-66, 1995], у той час як миші з дефектним геном Flt1 мають здорові гематопоетичні клітини-попередники та ендотеліальні клітини, що не здатні утворювати функціональні судини [Fong та ін., 376, 66-70, 1995]. Той факт, що порушення гена Flt4 приводить до того, що його експресія, яка в ембріоні відбувається у всьому організмі, а в організмі дорослої особини здійснюється тільки в лімфатичних судинах, свідчить про важливу роль Flt4 у процесі повторного моделювання і перетворення первинної судинної мережі в більш великі кровоносні судини на ранній стадії розвитку серцево-судинної системи [Dumont та ін., Science 282, 946-949, 1998]. Аналогічно тому, як це відбувається при експресії Flt4 у лімфатичних судинах дорослих особин, понадекспресія VEGF-C у шкірі трансгенних мишей приводить до ендотеліальної проліферації та збільшення судин лімфатичної системи, але не кровоносної системи [Jeltsch та ін., Science 276, 1423-1425, 1997]. Крім того, є дані про те, що VEGF-C індукує неоваскуляризацію, що встановлено у дослідах по моделюванню ангіогенезу в рогівці миші та хоріоалантоїсній оболонці ембріонів курчати [Сао та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14389-14394, 1998]. Було встановлено також, що другий клас тирозинкіназних рецепторів, специфічних по відношен 4 ню до ендотеліальних клітин, відіграє вирішальну роль в утворенні та підтримці цілісності судинної мережі. Миші, що мають дефектний ген Тіe1, гинуть від набряку і кровотечі, обумовлених слабкою структурною цілісністю ендотеліальних клітин мікросудинної мережі [Sato та ін., Nature 376, 70-74, 1995; Rodewald і Sato, Oncogene 12, 397-404, 1996]. Фенотип, обумовлений «вимиканням» гена Тіе2, характеризується недорозвиненими судинами, в яких відсутня розгалужувальна мережа та відсутні периендотеліальні підтримувальні клітини [Sato та ін., Nature 376, 70-74, 1995; Dumont та ін., Genes Dev. 8, 1897-1909, 1994]. Спрямована інактивація ліганду Ang1 рецептора Тіе2, а також понадекспресія інгібувалього ліганду Ang2, приводять до появи фенотипу, близького до фенотипу, обумовленого «вимиканням» Тіе2 [Maisonpierre та ін., Science 282, 55-60, 1997; Suri та ін., Cell 87, 1171-1180]. На противагу цьому при трансгенній понад експресії Ang1 була виявлена підвищена васкуляризація [Suri та ін., Science 282, 468-471, 1998; Thurstonen та ін., Science 286, 2511-2514, 1999]. Результати досліджень впливу експресії ангіогенного фактора росту на розвиток жовтого тіла [Maisonpierre та ін., Science 277, 55-60, 1997; Goede та ін., Lab. In vest. 78, 1385-1394, 1998], досліджень розвитку кровоносних судин у сітківці [Alon та ін., Nature Med. 1, 1024-1028, 1995; Benjamin та ін., Development 125, 1591-1598,1998] і експериментів по спрямованому переносу гена і трансгенних експериментів з використанням Тіе2, Ang1 і Ang2 дозволили виявити фундаментальну роль системи ангіопоетин/рецептор Tie у забезпеченні взаємодій між ендотеліальними клітинами і навколишніми перицитами або клітинами гладких м'язів. Передбачається, що Ang1, який експресується периендотеліальними клітинами і, очевидно, конститутивно експресується в організмі дорослої особини, стабілізує вже існуючі розвинуті судини. Ang2, що представляє собою антагоніст Ang1 та зустрічається в природних умовах, та який також експресується ендотеліальними клітинами в місцях розгалуження судин, очевидно, опосередковує припинення контактів ендотеліальних і периендотеліальних клітин, що у поєднанні з ініціаторами ангіогенезу, такими як VEGF, приводить до ремоделювання судин та їх розгалуження, а при відсутності VEGF приводить до регресії судин [Hanahan, Science 277, 48-50, 1997]. При патологічних станах, пов'язаних з аберантною неоваскуляризацією, були виявлені підвищені рівні експресії ангіогенних факторів росту та їх рецепторів. У більшості твердих п ухлин спостерігаються високі рівні експресії VEGF, і рецептори VEGF присутні, в основному, в ендотеліальних клітинах судин, що оточують злоякісні тканини або проникають в них [Plate та ін., Cancer Res. 53, 5822-5827, 1993]. Вплив на систему VEGF/рецептор VEGF за допомогою антитіл, що нейтралізують VEGF [Kim та ін., Nature 362, 841844, 1993], здійснювана за допомогою ретровірусів експресія домінантних негативних варіантів рецептора VEGF [Millauer та ін., Nature 367, 576-579, 1994], рекомбінантних варіантів рецептора, що нейтралізують VEGF [Goldman та ін., Proc. Natl. 5 79733 Acad. Sci. USA 95, 8795-8800, 1998], або невеликих молекул - інгібіторів тирозинкіназного рецептора VEGF [Fong та ін., Cancer Res. 59, 99-106, 1999; Wedge та ін., Cancer Res. 60, 970-975, 2000; Wood та ін., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000] або спрямований перенос цитотоксичних агентів за допомогою системи VEGF/рецептор VEGF [Arora та ін., Cancer Res. 59, 183-188, 1999; ЕР 0696456А2] приводять до зменшення росту пухлини і васкуляризації пухлини. Проте, хоча шляхом впливу на систему VEGF/рецептор VEGF можна інгібувати багато типів пухлин, деякі типи пухлин не піддаються такому впливові [Millauer та ін., Cancer Res. 56, 1615-1620, 1996]. Людські пухлини, а також застосовувані в експериментах ксенотрансплантати пухлин містять велику кількість недорозвинених кровоносних судин, що ще не зв'язані з периендотеліальними клітинами. Частка недорозвинених судин складає до 40% в злоякісній пухлині простати, що характеризується повільним ростом, і 90% в гліобластомі, що характеризується швидким ростом. У дослідах з використанням моделі ксенотрансплантата гліобластоми лінії С6 при усуненні VEGF за допомогою знижувальної регуляції трансгенної експресії VEGF спостерігалася вибіркова облітерація недорозвинених судин пухлини. Цей результат узгоджується з функцією VEGF як фактора виживання ендотеліальних клітин. Аналогічно до цього «вимикання» експресії VEGF в результаті терапії, заснованої на виключенні андрогену, приводить до вибіркового апоптозу ендотеліальних клітин у судинах, в яких відсутнє оточення, що складається з периендотеліальних клітин. На відміну від цього, в тій частині судин, на яку не впливало усунення VEGF, було виявлене оточення, що складається з периендотеліальних клітин [Benjamin та ін., J. Clin. In vest. 103, 159-165, 1999]. Виявлення підвищеного рівня експресії рецепторів Tie в ендотелії метастатичних меланом [Kаіраіnеn та ін., Cancer Res. 54, 6571-6577, 1994], у карциномах молочної залози [Salven та ін., Br. J. Cancer 74, 69-72, 1996] і в ксенотрансплантатах пухлин, що ростуть в присутності домінантнонегативних рецепторів VEGF [Millauer та ін., Cancer Res. 56, 1615-1620, 1996], а також підвищених рівнів експресії рецепторів Flt4 в ендотелії лімфатичних судин, що оточують лімфоми і карциноми молочної залози [Jussila та ін., Cancer Res. 58, 1599-1604, 1998], і VEGF-C у зразках різних пухлин людини [Salven та ін., Am. J. Pathol. 153, 103-108, 1998] дозволяє припустити, що ці фактори росту і рецептори, що володіють специфічністю по відношенню до ендотелію, можуть забезпечувати альтернативні шляхи неоваскуляризації пухлини. Високі рівні підвищувальної регуляції експресії Ang2 вже на ранніх стадіях розвитку пухлин розглядалися як механізм захисту хазяїна від початкового об'єднання вже існуючих судин при розвитку пухлини. При відсутності VEGF відбувається регресія об'єднаних судин, що приводить до некрозу в центральній частині пухлини. На відміну від цього, обумовлена гіпоксією підвищувальна регуляція експресії VEGF у поєднанні з підвищеною експресією Ang2 зберігає і підтримує васкуляризацію пухлини та ріст пухлини по краях пухлини 6 [Holash та ін., Science 284, 1994-1998, 1999; Holash та ін., Oncogene 18, 5356-5362, 1999]. Було встановлено, що вплив на функцію рецептора Тіе2 за допомогою нейтралізуючих ангіопоетин варіантів Тіе2, які містять позаклітинний лігандзв'язувальний домен, приводить до інгібування росту та васкуляризації пухлин, створених експериментальним шляхом [Lin та ін., J. Clin. Invest. 193, 159-165, 1999; Lin та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8829-8834, 1998; Siemeister та ін., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999]. Порівняння із впливами на опосередковані специфічним для ендотелію тирозинкіназним рецептором шляхи метаболізму, які справляє паракринна експресія відповідних доменів позаклітинного рецептора в такому ж клітинному оточенні, свідчить про те, що при блокаді системи рецептора VEGF і Тіе2, відповідно, відбувається інгібування росту пухлини [Siemeister та ін., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999]. Відомо, що інгібування системи VEGF/рецептор VEGF, здійснюване за допомогою різних методів, приводить лише до уповільнення росту більшості створюваних експериментальним шляхом пухлин [Millauer та ін., Nature 367, 576-579, 1994; Kim та ін., Nature 362, 841-844, 1993; Millauer та ін., Cancer Res. 56, 1615-1620,1996; Goldman та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8795-8800, 1998; Fong та ін., Cancer Res. 59, 99-106, 1999; Wedge та ін., Cancer Res. 60, 970-975, 2000; Wood та ін., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000; Siemeister та ін., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999]. Терапевтична ефективність навіть при збільшенні терапевтичних доз досягає визначеного постійного рівня (виходить на плато) [Kim та ін., Nature 362, 841-844, 1993; Wood та ін., Cancer Res. 60, 2178-2189,2000]. Аналогічні результати були отримані при дослідженні впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 [Lin та ін., J. Clin. Invest. 103, 159-165, 1999; Lin та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8829-8834, 1998; Siemeister та ін., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999]. Таким чином, існує необхідність у розробці способів підвищення терапевтичної ефективності антиангіогенних сполук. При розробці способів підвищення терапевтичної ефективності антиангіогенних сполук несподівано було встановлено, що використання комбінації сполуки, що приводить до інгібування систем VEGF/рецептор VEGF, і сполуки, що впливає на біологічну функцію систем ангіопоетин/рецептор Tie, виявляє виражену протипухлинну дію. Причина вираженої протипухлинної дії, що стостерігається, може полягати в тому, що вплив на біологічну функцію систем ангіопоетин/рецептор Tie дестабілізує взаємодію ендотеліальних клітин і периендотеліальних клітин в існуючих зрілих судинах пухлини і, таким чином, приводить до сенсибілізації ендотелію до сполук, які володіють активністю по відношенню до систем VEGF/рецептор VEGF. На основі цього несподіваного відкриття в даному винаході запропонована комбінація сполук, що впливають на функції систем VEGF/рецептор VEGF і систем ангіопоетин/рецептор Tie, яка при 7 79733 значена для інгібування васкуляризації та росту пухлини. Фармацевтична композиція складається з двох компонентів: сполука І інгібує біологічну активність однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF або складається з цитотоксичних агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій в результаті розпізнавання систем VEGF/рецептор VEGF. Сполука II впливає на біологічну функцію однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie або складається з цитотоксичних агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій в результаті розпізнавання систем ангіопоетин/рецептор Tie. В альтернативному варіанті сполука І інгібує біологічну активність однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF або систем ангіопоетин/рецептор Tie, а сполука II складається з цитотоксичних агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій в результаті розпізнавання однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF або систем ангіопоетин/рецептор Tie. Спрямований перенос або модуляцію біологічних активностей систем VEGF/рецептор VEGF і систем ангіопоетин/рецептор Tie можна здійснювати за допомогою (а) сполук, що інгібують активність тирозинкіназного рецептора, (б) сполук, що інгібують зв'язування ліганду з рецепторами, (в) сполук, що інгібують активацію внутрішньоклітинних шля хів передачі сигналу рецепторів, (г) сполук, що інгібують або активують експресію ліганду або рецептора системи рецепторів VEGF або Tie, (д) систем введення, таких як антитіла, ліганди, олігонуклеотиди або олігопептиди, що володіють високою афінністю до зв'язування, або ліпосоми, які здійснюють спрямований перенос цитотоксичних агентів або агентів, що індукують коагуляцію, в ендотелій в результаті розпізнавання систем VEGF/рецептор VEGF або систем ангіопоетин/рецептор Tie, (е) систем введення, таких як антитіла, ліганди, олігонуклеотиди або олігопептиди, що володіють високою афінністю до зв'язування, або ліпосоми, які спрямовано переносяться в ендотелій та індукують некроз або апоптоз. Сполука, що входить до складу композицій за даним винаходом, може представляти собою низькомолекулярну субстанцію, таку як олігонуклеотид, олігопептид, рекомбінантний протеїн, антитіло або кон'югати, що його містять, або злиті з ним протеїни. Прикладом інгібітора може служити низькомолекулярна субстанція, що інактивує тирозинкіназний рецептор шляхом зв'язування з каталітичним сайтом та його окупації, в результаті чого знижується біологічна активність рецептора. У даній області відомий цілий ряд інгібіторів кінази [фірма Sugen: SU5416, SU6668; Fung та ін., Cancer Res. 59, 99-106 (1999); Vajkoczy та ін., Proc. Am. Associ. Cancer Res. San Francisco, реферат №3612 8 (2000); фірма Zeneca: ZD4190, ZD6474; Wedge та ін., Cancer Res. 60, 970-975 (2000); фірма ParkeDavis PD0173073, PD0173074; Johnson та ін., Proc. Am. Associ. Cancer Res. San Francisco, реферат №3614 (2000); Dimitroff та ін., Invest. New Drugs 17, 121-135 (1999)]. Прикладом антагоніста є рекомбінантний протеїн або антитіло, що зв'язується з лігандом, в результаті чого запобігають активації рецептора лігандом. Іншим прикладом антагоніста є антитіло, що зв'язується з рецептором, в результаті чого запобігають активації рецептора. Прикладом модулятора експресії є антисмислова РНК або рибозим, що контролюють експресію ліганду або рецептора. Прикладом цитотоксичного агента, що спрямовано переноситься, є злитий протеїн, який містить ліганд та бактеріальний або рослинний токсин, такий як ендотоксин А Pseudomonas, дифтерійний токсин або рицин А. Прикладом агента, що спрямовано переноситься, та який індукує коагуляцію, є кон'югат одноланцюгового антитіла і тканинного фактора. Лігандзв'язувальні інгібітори, такі як нейтралізуючі антитіла, є відомими в даній галузі, вони описані в документах фірми Genentech (наприклад, рекомбінантне людське моноклональне антитіло до VEGF (rhuMAb VEGF)) і у [Presta та ін., Cancer Res. 57, 4593-4599 (1997)]. Домени лігандзв'язувального рецептора [описані у Kendall і Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705-10709 (1993); Goldman та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 8795-8800 (1998) і в Lin та ін., J. Clin. Invest. 100, 2072-2078 (1997)]. Інші домінантно-негативні рецептори [описані в Millauer та ін., Nature 367, 567-579 (1994)]. Антитіла, що блокують рецептор, [описані в документах фірми Imclone (ср1С11, патент US 5874542)]. Крім того, відомі антагоністичні мутанти лігандів [Siemeister та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4625-4629 (1998)]. Олігонуклеотиди, що володіють високою афінністю до зв'язування з лігандом або рецептором, [описані в документах фірми NeXstar (NX-244) і в Drolet та ін., Nat. Biotech. 14, 1021-1025 (1996)]. Крім того, описані невеликі молекули і пептиди. Описано регулятори експресії, що представляють собою антисмислові олігонуклеотиди та рибозими [RPI, Angiozyme™, див. RPI Homepage]. З літературних джерел відомі приклади систем введення/спрямованого переносу, що представляють собою злиті протеїни або кон'югати ліганд/антитіло-токсин [Аrоrа та ін., Cancer Res. 59, 183-188 (1999); Olson та ін., Int. J. Cancer 73, 865870 (1997)], або ті, що представляють собою ліпосоми, які здійснюють спрямований перенос в ендотеліальні клітини [Spragg та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8795-8800 (1997)], а також здійснюють спрямований перенос в ендотеліальні клітини та індукують коагуляцію [Ran та ін., Cancer Res. 58, 4646-4653 (1998)]. Невеликі молекули, що інгібують активність тирозинкіназного рецептора, представляють собою, наприклад, молекули загальної формули І 9 79733 I r позначає число від 0 до 2, n позначає число від 0 до 2; R3 і R4 а) кожний незалежно один від одного позначає (нижч.)алкіл, б) разом утворюють місток загальної часткової формули II 10 двійні зв'язки; або N-оксид зазначеної сполуки, де один або кілька атомів азоту несуть атом кисню, або його сіль. Кращою сіллю є сіль органічної кислоти, насамперед, сукцинат. Ці сполуки можна переважно застосовувати як сполуку І або II у фармацевтичній композиції за винаходом. Сполуки, які зупиняють фосфорилювання тирозину або персистентний ангіогенез, що відповідно приводить до припинення росту пухлини і поширення пухлини, представляють собою, наприклад, похідні антранілової кислоти загальної формули IV IV II де зв'язок здійснюється через два кінцевих атоми вуглецю і m позначає число від 0 до 4; або в) разом утворюють місток часткової формули III III де один або два кільцевих членів Т1, Т2 , Т3 , Т 4 позначають азот, а кожний з інших позначає СН, і зв'язок здійснюється через атоми Т1 і Т4; G позначає С1-С6алкіл, С2-С6алкілен або С2С6алкенілен; або С2-С6алкілен або С3-С6алкенілен, заміщені ацилокси- або гідроксигрупою; -СН2-О-, CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-O-CH2,-, -CH2-S-CH2-, -CH2NH-CH2-, окса- (-О-), тіа- (-S) або іміногрупу (-NH-), А, В, D, Ε і Τ кожний незалежно один від одного позначає N або СН, за умови, що не більш трьох із зазначених замісників означають Ν, Q позначає нижчий алкіл, нижчий алкокси або галоген, R1 і R2 кожний незалежно один від одного позначає Η або нижчий алкіл, X позначає іміно-, окса- або тіагрупу; Υ позначає водень, незаміщений або заміщений арил, гетеро арил або незаміщений або заміщений циклоалкіл; і Ζ позначає аміногрупу, моно- або дизаміщену аміногрупу, галоген, алкіл, заміщений алкіл, гідроксигрупу, етерифіковану з утворенням простого або складного ефіру гідроксигрупу, нітро-, ціано-, карбоксигрупу, е терифіковану з утворенням складного ефіру карбоксигрупу, алканоїл, карбамоїл, N-моно- або Ν,Ν-дизаміщений карбамоїл, амідино, гуанідино-, меркапто-, сульфо-, фенілтіо-, феніл(нижч.)алкілтіо-, алкілфенілтіогрупу, фенілсульфініл, феніл(нижч.)алкілсульфініл, алкілфенілсульфініл, фенілсульфоніл, феніл(нижч.)алкансульфоніл або алкілфенілсульфоніл, причому, якщо присутні більше одного радикала Ζ (m³2), то замісники Ζ можуть бути однаковими або різними, і де зв'язки, зазначені стрілками, представляють собою прості або по де А позначає групу =NR2, W позначає атом кисню, атом сірки, два атоми водню або групу =NR8, Ζ позначає групу =NR10 або =N-, -N(R10)(CH2)q -, С1-6алкіл із прямою або розгалуженим ланцюгом або групу або Α, Ζ і R1 разом утворюють гр упу m, n і о позначають числа від 0 до 3, q позначає число від 1 до 6, Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf кожний незалежно один від одного позначає водень, С1-С4 алкіл або групу =NR10 та/або Ra і/або Rb разом з Ra і/або Rd або Rc разом з Rg і/або Rf утворюють зв'язок, або до двох груп з числа Ra - Rf утворюють з R1 або R2 місток, що містить до 3 атомів вуглецю, X позначає групу =NR9 або =N-, Υ позначає групу -(СН2)p, p позначає ціле число від 1 до 4, R1 позначає незаміщений або необов'язково заміщений одним або декількома атомами галогену С1-C6алкіл або С1-C6алкіл або С1-C6алкокси, що необов'язково заміщений одним або декількома атомами галогену, або позначає незаміщений або заміщений арил або гетероарил, 11 79733 R2 позначає водень або С 1-C6алкіл або разом з Ζ або R1 утворює з Ra - Rf місток, що містить до 3 кільцевих атомів, R3 позначає моноциклічний або біциклічний арил або гетероарил, що є незаміщеним або необов'язково заміщеним одним або декількома атомами галогену, С1-C6алкілом, С1-C6алкоксиабо гідроксигрупою, R4, R5, R6 і R7 кожний незалежно один від одного позначає водень, галоген або С1-C6алкокси, С1-C6алкіл або С 1C6карбоксиалкіл, що є незаміщеними або необов'язково заміщеними одним або декількома атомами галогену, або R5 і R6 разом утворюють груп у R8, R9 і R10 кожний незалежно один від одного позначає водень або С 1-C6алкіл, а також їх ізомери та солі. Ці сполуки також можна переважно застосовувати як сполуки І або II у фармацевтичній композиції за винаходом. Як сполуку І або II у фармацевтичній композиції за винаходом більш бажано застосовувати сполуку загальної формули V V де R1 позначає групу де R5 позначає хлор, бром або групу -ОСН3, де R7 позначає -СН3 або хлор, де R8 позначає -СН3, фтор, хлор або -CF3, де R4 позначає фтор, хлор, бром, -CF3, -N=C, CH3-OCF3 або -СН2ОН де R6 позначає -СН3 або хлор R2 позначає піридил або групу і R3 позначає водень або фтор, а також їх ізомери та солі. 12 Ці сполука мають такі ж самі властивості, що і зазначені вище сполуки формули IV, та їх можна застосовувати для лікування захворювань, пов'язаних з ангіогенезом. До складу композицій входять сполуки загальних формул І, IV і V індивідуально або в поєднанні одна з одною. Зазначені вище сполуки, що входять до складу комбінацій за винаходом, також підпадають під об'єм винаходу. Ще одним прикладом інгібіторів зв'язування лігандів є пептиди і послідовності ДНК, що кодують такі пептиди, які застосовують для лікування захворювань, пов'язаних з ангіогенезом. Такі пептиди та послідовності ДНК представлені в SEQ ID NO 1-59 у переліку послідовностей. Було встановлено, що найбільший інтерес представляють послідовності, представлені в SEQ ID NO 34 і SEQ ID NO 34a. Таким чином, об'єктами даного винаходу є фармацевтичні композиції, що а) містять як сполуку І один або декілька агентів, що модулюють біологічну функцію однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF, і містять як сполуку II один або декілька агентів, що модулюють біологічну функцію однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie, б) містять як сполуку І один або декілька агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій за допомогою однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF, і містять як сполуку II один або декілька агентів, що модулюють біологічну функцію однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie, в) містять як сполуку І один або декілька агентів, що модулюють біологічну функцію однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF або однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie, і містять як сполуку II один або декілька агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій, г) містять як сполуку І один або декілька агентів, що модулюють біологічну функцію однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF, і містять як сполуку II один або декілька агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій за допомогою однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie, д) містять як сполуку І один або декілька агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій за допомогою однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF, і містять як сполуку II один або декілька агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій за допомогою однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie, e) містять як сполуку І один або декілька агентів, що модулюють біологічну функцію однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF, і містять як сполуку II один або декілька агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій за допомогою однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF, ж) містять як сполуку І один або декілька агентів, що модулюють біологічну функцію однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie, і містять як сполуку II один або декілька агентів, що спрямовано переносяться в ендотелій за допомо 13 79733 гою однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie, і з) містять один або декілька агентів, що впливають як на функцію однієї або декількох систем VEGF/рецептор VEGF, так і на функцію однієї або декількох систем ангіопоетин/рецептор Tie. При послідовному терапевтичному введенні фармацевтичні композиції за винаходом можна вводити одночасно або окремо. Композиції за винаходом містять як сполуку І або як сполуку II принаймні одну із а) сполук, що інгібують активність тирозинкіназного рецептора, б) сполук, що інгібують зв'язування ліганду з рецепторами, в) сполук, що інгібують активацію внутрішньоклітинних шля хів передачі сигналу рецепторів, г) сполук, що інгібують або активують експресію ліганду або рецептора VEGF- або Tieрецепторної системи, д) систем введення, таких як антитіла, ліганди, олігонуклеотиди або олігопептиди, що володіють високою афінністю до зв'язування, або ліпосоми, які забезпечують спрямований перенос цитотоксичних агентів або агентів, що індукують коагуляцію, в ендотелій за допомогою розпізнавання систем VEGF/рецептор VEGF або ангіопоетин/рецептор Tie, е) систем введення, таких як антитіла, ліганди, олігонуклеотиди або олігопептиди, що володіють високої афінністю до зв'язування, або ліпосоми, які спрямовано переносяться в ендотелій та індукують некроз або апоптоз. Зазначені композиції також підпадають під обсяг даного винаходу. Під обсяг даного винаходу підпадають також фармацевтичні композиції, що містять як сполуку І і/або II принаймні одну субстанцію, яка має послідовність з числа послідовностей, представлених у SEQ ID No 1-59. Найбільш цінними є фармацевтичні композиції, що містять як сполуку І і/або II субстанції, що мають послідовність, представлену в SEQ ID No 34а, і зазначені у формулі винаходу фармацевтичні композиції, що містять як сполуку І і/або II принаймні одну із субстанцій sTie2, МАт 4301-42-35, кон'югат scFv-tTF і/або L19 scFv-tTF. Крім того, кращими об'єктами даного винаходу є фармацевтичні композиції, що містять як сполуку І і/або II принаймні одну низькомолекулярну субстанцію загальної формули І, загальної формули IV та/або загальної формули V. Найкращою сполукою, яку можна застосовувати як сполуку І або II у композиції за винаходом, є бісукцинат (4-хлорфеніл)[4-(4піридилметил)фталазин-1-іл]амонію. Отже об'єктами даного винаходу є також фармацевтичні композиції, що містять як сполуку І бісукцинат (4-хлорфеніл)[4-(4піридилметил)фталазин-1-іл]амонію, sTie2, МАт 4301-42-35, кон'югат scFv-tTF і/або L19 scFv-tTF, а як сполуку II містять бісукцинат (4-хлорфеніл)[4-(4піридилметил)фталазин-1-іл]амонію, sTie2, МАт 4301-42-35, кон'югат scFv-tTF і/або L19 scFv-tTF, за умови, що сполука І не є ідентичною сполуці II, і найкращими є фармацевтичні композиції, що міс 14 тять як сполуку І бісукцинат (4-хлорфеніл)[4-(4піридилметил)фталазин-1-іл]амонію, а як сполуку II містять sTie2, МАт 4301-42-35, кон'югат scFv-tTF і/або L19 scFv-tTF; фармацевтичні композиції, що містять як сполуку І МАт 4301-42-35, а як сполуку II містять sTie2 і/або кон'югат L19 scFv-tTF; фармацевтичні композиції, що містять як сполуку І кон'югат scFv-tTF, а як сполуку II містять sTie2 і/або МАт 4301-42-35; фармацевтичні композиції, що містять як сполуку І кон'югат L19 scFv-tTF, а як сполуку II містять sTie2. Зазначені вище низькомолекулярні сполуки, протеїни і ДНК, що експресують протеїни, можна застосовувати як лікарський засіб індивідуально або у складі композицій для лікування пухлин, різних видів раку, псоріазу, артриту, такого як ревматоїдний артрит, гемангіоми, ангіофіброми, очних хвороб, таких як діабетична ретинопатія, неоваскулярная глаукома, захворювань нирок, таких як гломерулонефрит, діабетична нефропатія, злоякісний нефросклероз, тромбічного мікроангіопатичного синдрому, відторгнень після транспл антації і гломерулопатії, фіброзних захворювань, таких, як цироз печінки, проліферативних захворювань мезангіальних клітин, атеросклерозу та ушкоджень нервових тканин. Застосування комбінації за винаходом при лікуванні ушкоджених нервових тканин дозволяє уникнути швидкого утворення рубців в області ушкодження. Тому не відбувається утворення рубця до сполучення аксонів один з одним. Внаслідок цього відновлення нервових зв'язків відбувається набагато швидше. Крім того, комбінації за винаходом можна застосовувати для пригнічення утворення асцитів у пацієнтів. Можна пригашува ти також утворення опосередкованих VEGF набряків. Для застосування комбінацій за винаходом як лікарського засобу сполуки повинні бути включені до складу фармацевтичної композиції. Зазначена композиція, крім діючої речовини або діючих речовин, містить фармацевтично прийнятні органічні або неорганічні інертні носії, такі як вода, желатин, гуміарабік, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, тальк, рослинні олії, поліалкіленгліколі і т.д. Фармацевтичні композиції можуть знаходитися у твердій формі, такій як таблетки, пігулки, супозиторії, капсули, або можуть знаходитися в рідкій формі, такій як розчини, суспензії або емульсії. При необхідності композиції можуть додатково містити добавки, такі як консерванти, стабілізатор, поверхнево-активні речовини або емульгатори, солі для зміни осмотичного тиску та/або буфери. Такі застосування, а також композиції, що містять діючі речовини, також є об'єктом даного винаходу. Для парентерального введення застосовують, насамперед, розчини або суспензії для ін'єкції, насамперед, водні розчини діючих речовин у полігідроксиетоксильованій касторовій олії. Як носій можна застосовувати такі добавки, як солі жовчної кислоти або фосфоліпіди тваринного або рослинного походження, а також їх суміші, ліпосоми або їх інгредієнти. 15 79733 Для перорального введення застосовують, насамперед, таблетки, пігулки або капсули, що містять тальк та/або вуглеводневі носії або зв'язувальні речовини, такі як лактоза, кукурудзяний або картопляний крохмаль. Для перорального введення композиція може знаходитися також у формі рідини, такої як сік, що необов'язково містить підсолоджувальну речовину. Доза діючої речовини варіюється в залежності від шля ху введення діючої речовини, віку і ваги тіла пацієнта, а також від форми та стадії розвитку хвороби. Добова доза діючої речовини складає 0,51000мг, переважно 50-200мг. Дозу можна вводити у вигляді однократної дози або розділених доз два або більшу кількість разів на день. Зазначені композиції та форми введення також підпадають під обсяг даного винаходу. Комбінований (поєднаний) функціональний вплив на системи VEGF/рецептор VEGF і системи ангіопоетин/рецептор Tie можна здійснювати одночасно або послідовно таким чином, щоб біологічна реакція на вплив на одну систему ліганд/рецептор і біологічна реакція на вплив на другу систему ліганд/рецептор перекривалися за часом. В альтернативному варіанті комбінований функціональний вплив на системи VEGF/рецептор VEGF або системи ангіопоетин/рецептор Tie і спрямований перенос цитотоксичних агентів за допомогою систем VEGF/рецептор VEGF або систем ангіопоетин/рецептор Tie можна здійснювати одночасно або послідовно таким чином, щоб біологічна реакція на вплив на систему ліганд/рецептор і спрямований перенос цитотоксичних агентів перекривалися за часом. Винахід відноситься також до субстанції, що виявляє функціональний вплив як на системи VEGF/рецептор VEGF, так і на системи ангіопоетин/рецептор Tie, або яка спрямовано переноситься за допомогою як систем VEGF/рецептор VEGF, так і систем ангіопоетин/рецептор Tie. Системи VEGF/рецептор VEGF включають ліганди VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF і тирозинкіназні рецептори VEGF-R1 (Fltl), VEGF-R2 (KDR/Flkl), VEGF-R3 (Flt4), а також їх корецептори (наприклад, нейропілін-1). Системи ангіопоетин/рецептор Tie включають Ang1, Ang2, Ang3/Ang4 та подібні до ангіопоетину поліпептиди, що зв'язуються з Тіe1 або Тіе2, а також тирозинкіназні рецептори Тіe1 і Тіе2. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна застосовувати в медичних цілях для лікування захворювань. До таких захворювань відносяться, наприклад, рак, метастази раку, ангіогенез, включаючи ретинопатію і псоріаз. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити перорально, парентерально або з використанням методів генної терапії. Таким чином, даний винахід відноситься також до застосування фармацевтичних композицій для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування пухлин, різних видів раку, псоріазу, артриту, такого як ревматоїдний артрит, гемангіо 16 ми, ангіофіброми, очних хвороб, таких як діабетична ретинопатія, неоваскулярная глаукома, захворювань нирок, таких як гломерулонефрит, діабетична нефропатія, злоякісний нефросклероз, тромбічного мікроангіопатичного синдрому, відторгнень після трансплантації, гломерулопатії, фіброзних захворювань, таких як цироз печінки, проліферативних захворювань мезангіальних клітин, атеросклерозу, ушкоджень нервових тканин, для пригнічення утворення асцитів у пацієнтів та пригнічення утворення набряків, опосередкованих VEGF. Приведені нижче приклади служать для демонстрації здійснення описаного винаходу, але не обмежують обсяг винаходу. Приклад 1 Висока ефективність у відношенні інгібування росту пухлини комбінації інгібування системи VEGF А/рецептор VEGF і функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо була продемонстрована в дослідах при використанні як моделі кренотрансплантата людської меланоми лінії A375v. Клітини людської меланоми лінії Α375ν стабільно трансфікували для здійснення понадекспресії позаклітинного нейтралізуючого ліганд домена людського тирозинкіназного рецептора Тіе2 (sTie2; сполука II) [Siemeister та ін., Cancer Res. 59, 31853191, 1991]. Для контролю клітини лінії A375v стабільно трансфікували «порожнім» експресійним вектором (A375v/pCEP). Безтимусним (nu/nu) мишам лінії Swiss вводили шляхом підшкірної ін'єкції 1´106 пухлинних клітин, трансфікованих A375v/sTie2 або A375v/pCEP відповідно. Тваринам, призначеним для обробки сполукою І, щодня протягом періоду часу до 38 днів вводили перорально дози (50мг/кг) інгібітора тирозинкіназного рецептора VEGF, що представляє собою бісукцинат (4-хлорфеніл)[4-(4-піридилметил)фталазин-1іл]амонію [Wood та ін., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000]. Різні варіанти обробок представлені в Таблиці 1. Ріст пухлини оцінювали шляхом вимірювання за допомогою циркуля найбільшого діаметра і розміру в перпендикулярному до нього напрямку. Таблиця 1 Варіант обробки бісукцинат (4-хлорфеніл)[4- sTie2 (споГрупа обробки (4-піридилметил)фталазин- лука II) 1-іл]амонію(сполука І) Група 1: A375v/pCEP Група 2: A375v/pCEP + Група 3: A375v/sTie2 + Група 4: A375v/sTie2 + + Розмір пухлин, отриманих з контрольних клітин лінії A375v/pCEP, без обробки (група 1) досягав приблизно 250мм 2 (середня площа) через 24 дні (Фіг.1). Обробка тільки інгібітором рецептора 17 79733 VEGF, бісукцинатом (4-хлорфеніл)[4-(4піридилметил)фталазин-1-іл]амонію (сполука І, група обробки 2), або тільки вплив на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 за допомогою експресії sTie2 (сполука II, група обробки 3) сповільнювали ріст пухлин, в результаті чого вони досягали відповідно розміру приблизно 250мм 2 за 31 день. Комбінація впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 за допомогою експресії sTie2 і впливу на систему VEGF/рецептор VEGF за допомогою кіназного інгібітора, бісукцинату (4хлорфеніл)[4-(4-піридилметил)фталазин-1іл]амонію приводила до затримки росту пухлин, в результаті чого вони досягали розміру приблизно 250мм 2 за 38 днів. Цей результат наочно демонструє більш високу ефективність комбінації впливу як на систему VEGF-A/рецептор VEGF, так і на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2, у порівнянні із впливами на кожну із систем окремо. Приклад 2 Комбінація функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 та нейтралізації VEGF-A є більш ефективною у відношенні інгібування росту пухлини, ніж кожного із зазначених впливів окремо. У безтимусних мишей індукували ріст пухлин шляхом введення клітин лінії A375v/sTie2 та лінії A375v/pCEP відповідно до методу, описаного в Прикладі 1. Тваринам, призначеним для обробки сполукою І, двічі на тиждень протягом 4 тижнів вводили внутрішньочеревинно по 200мкг нейтралізуючого VEGF-A моноклонального антитіла (МАт) 4301-42-35 [Schlaeppi та ін., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 125, 336-342, 1999]. Різні варіанти обробок представлені в Таблиці 2. Тварин забивали з етичних міркувань, коли розміри пухлин у групі 1 перевищували приблизно 1000 мм 3. Ріст пухлини оцінювали шляхом вимірювання за допомогою циркуля найбільшого діаметра та розміру в перпендикулярному до нього напрямку. Таблиця 2 Група обробки Група 1: A375v/pCEP Група 2: A375v/pCEP Група 3: A375v/sTie2 Група 4: A375v/sTie2 Варіант обробки МАт 4301-42-35 sTie2 (спо(сполука І) лука II) + + + + Розмір пухлин, отриманих з контрольних клітин лінії A375v/pCEP, без обробки (група 1) досягав приблизно 1000 мм 3 (Фіг.2) через 28 днів. Пухлини, що обробляли нейтралізуючим VEGF-A МАт 4301-42-35 (сполука І, група обробки 2), через 28 днів досягали об'єму приблизно 450 мм 3. Вплив на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 за допомогою експресії sTie2 (сполука II, група обробки 3), приводив до зменшення росту пухлин, що відповідно за 28 днів досягали об'єму приблизно 600мм 3. Комбінація впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 за допомогою експресії sTie2 та нейтралізації VEGF-A за допомогою МАт 4301-4235 (сполука І + сполука II, група обробки 4), приводила до інгібування росту пухлин, в результаті 18 чого за 28 днів вони досягали об'єму приблизно 250мм 3. Ці дані наочно демонструють більш високу ефективність комбінації нейтралізації VEGF-A і функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо. Приклад 3 Комбінація функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 і спрямованого переносу протеїну, що індукує коагуляцію, за допомогою системи VEGF/рецептор VEGF є більш ефективною у відношенні інгібування_росту пухлини в порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо. У безтимусних мишей індукували ріст пухлин із клітин лінії A375v/sTie2 та лінії A375v/pCEP відповідно до методу, описаного в Прикладі 1. Здійснювали експресію в Е. соlі одноланцюгового антитіла (scFv), що специфічно розпізнає комплекс людський VEGF-А/рецептор І VEGF [WO 99/19361], та кон'югацію з рекомбінантним людським вкороченим тканинним фактором (tTF), що індукує коагуляцію, відповідно до методів, описаних у Ran та ін. [Cancer Res. 58, 4646-4653,1998]. Коли пухлини досягали розміру приблизно 200мм 3, тим тваринам, що були призначені для обробки сполукою І, вводили внутрішньовенно у день 0 і у день 4 дози 20мкг кон'югата scFv-tTF. Різні варіанти обробок представлені в Таблиці 3. Тварин забивали з етичних міркувань, коли об'єми пухлин у групі 1 перевищували приблизно 1000мм 3. Ріст пухлини оцінювали шляхом вимірювання за допомогою циркуля найбільшого діаметра та розміру в перпендикулярному до нього напрямку. Таблиця 3 Група обробки Група 1: A375v/pCEP Група 2: A375v/pCEP Група 3: A375v/sTie2 Група 4: A375v/sTie2 Варіант обробки Кон'югат scFv-tTF sTie2 (сполу(сполука І) ка II) + + + + Розмір пухлин, отриманих з контрольних клітин лінії A375v/pCEP, без обробки (група 1) досягав приблизно 1000мм 3 (Фіг.3) через 28 днів. Пухлини, які обробляли tTF, що індукує коагуляцію, спрямований перенос якого в комплекс VEGFA/рецептор ІVEGF здійснювали за допомогою кон'югата scFv-tTF (сполука І, група обробки 2), через 28 днів досягали об'єму приблизно 500мм 3. Вплив на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 за допомогою експресії sTie2 (сполука II, група обробки 3), приводив до зменшення росту пухлин, що відповідно за 28 днів досягали об'єму приблизно 600мм 3. Комбінація впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2, здійснюваного за допомогою експресії sTie2, і спрямованого переносу в комплекс VEGF-А/рецептор IVEGF (сполука І + сполука II, група обробки 4), приводила до інгібування росту п ухлин, в результаті чого за 28 днів вони досягали об'єму приблизно 300мм 3. 19 79733 Ці дані наочно демонструють більш високу ефективність комбінації спрямованого переносу в комплекс VEGF-A/рецептор І VEGF tTF, що індукує коагуляцію, і функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо. Можна чекати, що аналогічні результати будуть отримані при здійсненні спрямованого переносу цитотоксичних агентів у системи VEGF/рецептор VEGF. Приклад 4 Комбінація функціонального впливу на систему VEGF/рецептор VEGF і спрямованого переносу протеїну, що індукує коагуляцію, в систему VEGF/рецептор VEGF є більш е фективною у відношенні інгібування росту пухлини в порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо. У безтимусних мишей індукували ріст пухлин із клітин лінії A375v/pCEP відповідно до методу, описаного в Прикладі 1. Тваринам, призначеним для обробки сполукою І, щодня протягом 28 днів вводили перорально дози по 50мг/кг інгібітора тирозинкіназного рецептора VEGF, що представляє собою бісукцинат (4-хлорфеніл)[4-(4піридилметил)фталазин-1-іл]амонію [Wood та ін., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000]. Сполука II представляла собою одноланцюгове антитіло (scFv), що специфічно розпізнає комплекс людський VEGF-A/рецептор І VEGF [WO 99/19361], яке експресували в Е. соїі та яке кон'югували з рекомбінантним людським вкороченим тканинним фактором (tTF), що індукує коагуляцію, відповідно до методів, [описаних у Ran та ін. (Cancer Res. 58, 4646-4653, 1998)]. Коли пухлини досягали розміру приблизно 200мм 3, тваринам, призначеним для обробки сполукою II, вводили у день 0 і у день 4 внутрішньовенно дози по 20мкг кон'югата scFv-tTF. Різні варіанти обробок представлені в Таблиці 4. Тварин забивали з етичних міркувань, коли об'єми пухлин у групі 1 перевищували приблизно 1000мм 3. Ріст п ухлини оцінювали шляхом вимірювання за допомогою циркуля найбільшого діаметра і розміру в перпендикулярному до нього напрямку. Таблиця 4 Варіант обробки Бісукцинат (4-хлорфеніл)[4- Кон'югат Група обробки (4-піридилметил)фталазин-1- scFv-tTF іл] амонію (сполука І) (сполука II) Група 1: A375v/pCEP Група 2: A375v/pCEP + Група 3: A375v/sTie2 + Група 4: A375v/sTie2 + + Розмір пухлин, отриманих з контрольних клітин лінії A375v/pCEP, без обробки (група 1) досягав приблизно 1000мм 3 (Фіг.4) через 28 днів. Обробка тільки інгібітором рецептора VEGF, що представляє собою бісукцинат (4-хлорфеніл)[4-(4піридилметил)фталазин-1-іл]амонію (сполука І, група обробки 2), приводила до зменшення об'ємів 20 пухлин, в результаті чого вони досягали приблизно 550мм 3. Об'єми пухлин, які обробляли tTF, що індукує коагуляцію, спрямований перенос якого в комплекс VEGF-A/рецептор ІVEGF здійснювали за допомогою кон'югата scFv-tTF (сполука II, гр упа обробки 3), через 28 днів досягали об'єму приблизно 500мм 3. Комбінація інгібування тирозинкіназного рецептора VEGF, здійснюваного за допомогою бісукцината (4-хлорфеніл)[4-(4піридилметил)фталазин-1-іл] амонію, і спрямованого переносу в комплекс VEGF/рецептор VEGF (сполука І + сполука II, гр упа обробки 4), приводила до інгібування росту пухлин, в результаті чого за 28 днів вони досягали об'єму приблизно 400мм 3. Ці дані наочно демонструють більш високу ефективність комбінації спрямованого переносу tTF, що індукує коагуляцію, у комплекс VEGFA/рецептор ІVEGF і функціонального впливу на систему VEGF-A/рецептор ІVEGF у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо. Можна чекати, що аналогічні результати будуть отримані при здійсненні спрямованого переносу цитотоксичних агентів у системи ангіопоетин/рецептор Tie. Приклад 5 Комбінація функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 і специфічного спрямованого переносу в ендотелій протешу, що індукує коагуляцію, є більш ефективною у відношенні інгібування росту пухлини в порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо. У безтимусних мишей індукували ріст пухлин із клітин лінії A375v/sTie2 і A375v/pCEP відповідно до методу, описаного в Прикладі 1. Злитий протеїн (L19 scFv-tTF), що містить одноланцюгове антитіло L19, яке специфічно розпізнає онкогенний ембріональний ED-B-домен фібронектину, та позаклітинний домен тканинного фактора, експресували в Е. соlі відповідно до методу, [описаного у Nilsson та ін., (Nat. Med., здано до друку)]. Крім того, дані, що стосуються L19 scFv-tTF, [представлені в доповіді D. Neri і F. Nilsson (конференція «Advances in the application of monoclonal antibodies in clinical oncology», Самоз, Греція, 31 травня - 2 червня 2000p.)]. Коли пухлини досягали розміру приблизно 200мм 3, то тваринам, призначеним для обробки сполукою І, вводили внутрішньовенно однократну дозу 20мкг L19 scFv-tTF у 200мкл фізіологічного розчину. Різні варіанти обробок представлені в Таблиці 5. Тварин забивали з етичних міркувань, коли об'єми пухлин у гр упі 1 перевищували приблизно 1000мм 3. Ріст пухлини оцінювали шляхом вимірювання за допомогою циркуля найбільшого діаметра і розміру в перпендикулярному до нього напрямку. Таблиця 5 Група обробки Група 1: A375v/pCEP Група 2: A375v/pCEP Група 3: A375v/sTie2 Група 4: A375v/sTie2 Варіант обробки L19 scFv-tTF sTie2 (сполу(сполука І) ка II) + + + + 21 79733 Розмір пухлин, отриманих з контрольних клітин лінії A375v/pCEP, без обробки (група 1) досягав приблизно 1000мм 3 (Фіг.5) через 28 днів. Пухлини, оброблені L19 scFv-tTF, що індукує коагуляцію (сполука І, група обробки 2), через 28 днів досягали об'єму приблизно 450мм 3. Вплив на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 за допомогою експресії sTie2 (сполука II, група обробки 3) приводив до зменшення росту пухлин, в результаті чого вони через 28 днів досягали відповідно об'єму приблизно 600мм 3. Комбінація впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 за допомогою експресії sTie2 і спрямованого переносу L19 scFv-tTF в ендотелій (сполука І + сполука II, група обробки 4) приводила до інгібування росту пухлин, в результаті чого через 28 днів їх об'єм досягав приблизно 250мм 3. Ці дані наочно демонструють більш високу ефективність комбінації спрямованого переносу L19 scFv-tTF в ендотелій і функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо. Приклад 6 Комбінація функціонального впливу на систему VEGF/рецептор VEGF і спрямованого переносу в ендотелій специфічного протеїну, що індукує коагуляцію, є більш ефективною у відношенні інгібування росту пухлини у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо. У безтимусних мишей індукували ріст пухлин із клітин лінії A375v/pCEP відповідно до методу, описаного в прикладі 1. Тваринам, призначеним для обробки сполукою І, щодня протягом 28 днів вводили перорально дози по 50мг/кг інгібітора тирозинкіназного рецептора VEGF, що представляє собою бісукцинат (4-хлорфеніл)[4-(4піридилметил)фталазин-1-іл]амонію [Wood та ін., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000]. Сполука II представляла собою злитий протеїн L19 scFv-tTF, описаний у Прикладі 5. Коли розмір пухлин досягав приблизно 200мм 3, тваринам, призначеним для обробки сполукою II, вводили внутрішньовенно однократну дозу 20мкг L19 scFv-tTF у 200мкл фізіологічного розчину. Різні варіанти обробок представлені в Таблиці 6. Тварин забивали з етичних міркувань, коли об'єми пухлин у гр упі 1 перевищували приблизно 1000мм 3. Ріст пухлини оцінювали шляхом вимірювання за допомогою циркуля найбільшого діаметра та розміру в перпендикулярному до нього напрямку. Таблиця 6 Варіант обробки Бісукцинат (4-хлорфеніл)[4- L19 scFvГрупа обробки (4-піридилметил)фталазин-1-і tTF (сполул] амонію (сполука І) ка II) Група 1: A375v/pCEP Група 2: A375v/pCEP + Група 3: + A375v/sTie2 Група 4: A375v/sTie2 + + 22 Розмір пухлин, отриманих з контрольних клітин лінії A375v/pCEP, без обробки (група 1) досягав приблизно 1000мм 3 (Фіг.6) через 28 днів. Обробка тільки інгібітором тирозинкіназного рецептора VEGF, що представляє собою бісукцинат (4-хлорфеніл)[4-(4-піридилметил)фталазин-1іл]амонію (сполука І, група обробки 2), приводила до інгібування росту пухлин, в результаті чого вони досягали розміру приблизно 550мм 3. Пухлини, оброблені шляхом спрямованого переносу в ендотелій L19 scFv-tTF, що індукує коагуляцію (сполука II, гр упа обробки 3), через 28 днів досягали об'єму приблизно 450мм 3. Комбінація інгібування тирозинкіназного рецептора VEGF бісукцинатом (4хлорфеніл)[4-(4-піридилметил)фталазин-1-іл] амонію і спрямованого переносу в комплекс VEGF/рецептор VEGF (сполука І + сполука II, гр упа обробки 4) приводила до інгібування росту пухлин, в результаті чого через 28 днів їх об'єм досягав приблизно 200 мм 3. Ці дані наочно демонструють більш високу ефективність комбінації спрямованого переносу L19 scFv-tTF в ендотелій та функціонального впливу на систему VEGF/рецептор VEGF у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо. Опис креслень На Фіг.1 представлені дані, що ілюстр ують більш високу ефективність у вілноттгенні інгібування росту пухлини, що досягається при використанні комбінації впливу на систему VEGFА/рецептор VEGF, здійснюваного за допомогою специфічного тирозинкіназного інгібітора, і на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2, здійснюваного за допомогою домена розчинного рецептора (види обробок груп 1-4, представлені в Таблиці 1). Скорочення мають наступні значення: mock, con. група обробки 1 mock+VEGF-A група обробки 2 sTIE-с13 група обробки 3 sTIE-c13+VEGF-A група обробки 4 На Фіг.2 представлені дані, що ілюстр ують більш високу ефективність у відношенні інгібування росту пухлини, що досягається при використанні комбінації нейтралізації VEGF-A та функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2, у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо (види обробок груп 1-4 представлені в Таблиці 2). На Фіг.3 представлені дані, які ілюструють більш високу ефективність у відношенні інгібування росту пухлини, що досягається при використанні комбінації спрямованого переносу tTF, який індукує коагуляцію, у комплекс VEGF/рецептор ІVEGF, здійснюваного за допомогою кон'югата scFv-tTF, і функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2, у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо (види обробок груп 1-4 представлені в Таблиці 3). На Фіг.4 представлені дані, які ілюструють більш високу ефективність у відношенні інгібування росту пухлини, що досягається при використанні комбінації спрямованого переносу tTF, який індукує коагуляцію, у комплекс VEGF/рецептор ІVEGF, здійснюваного за допомогою кон'югата scFv-tTF, і функціонального впливу на систему 23 VEGF/рецептор І VEGF, здійснюваного за допомогою інгібітора тирозинкіназного рецептора VEGF, що представляє собою бісукцинат (4-хлорфеніл)[4(4-піридилметил)фталазин-1-іл]амонію, у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо (види обробок груп 1-4 представлені в Таблиці 4). На Фіг.5 представлені дані, що ілюстр ують більш високу ефективність у відношенні інгібування росту пухлини, що досягається при використанні комбінації спрямованого переносу злитого протешу L19 scFv-tTF, який індукує коагуляцію, в ендотелій і функціонального впливу на систему ангіопоетин/рецептор Тіе2 у порівнянні з кожним із 79733 24 зазначених впливів окремо (види обробок груп 1-4 представлені в Таблиці 5). На Фіг.6 представлені дані, які ілюструють більш високу ефективність у відношенні інгібування росту пухлини, що досягається при використанні комбінації спрямованого переносу злитого протеїну L19 scFv-tTF, який індукує коагуляцію, в ендотелій і функціонального впливу на систему VEGF/рецептор VEGF, здійснюваного за допомогою інгібітора тирозинкіназного рецептора VEGF, що представляє собою бісукцинат (4-хлорфеніл)[4(4-піридилметил)фталазин-1-іл] амонію, у порівнянні з кожним із зазначених впливів окремо (види обробок груп 1-4 представлені в Таблиці 6). 25 79733 26 27 79733 28 29 79733 30 31 79733 32 33 79733 34 35 79733 36 37 79733 38 39 79733 40 41 79733 42 43 79733 44 45 79733 46 47 79733 48 49 79733 50 51 79733 52 53 79733 54 55 79733 56 57 79733 58 59 79733 60