Спосіб діагностики ранніх уражень нирок при стрептозотоциніндукованому цукровому діабеті у щурів

Реферат: Спосіб діагностики ранніх уражень нирок при стрептозотоциніндукованому цукровому діабеті у щурів шляхом проведення ранньої діагностики порушень функцій нирок при цукровому діабеті на основі змін в сечі до появи протеїнурії. Одноразово внутрішньоочеревинно вводять стрептозотоцин у дозі 70 мг/кг дослідним самцям щурів віком два місяці та фарбують гістологічні зрізи бромфеноловим синім за методом Mikel Calvo у сильно кислому середовищі. Внаслідок цього по-різному забарвлюються білки із різним співвідношенням аміно- та карбоксильних груп. Оцінюють забарвлення за допомогою мікроспектрофотометрії на основі коефіцієнта R/B. При зростанні коефіцієнта R/B в порівнянні з показниками інтактних тварин діагностують ранні ураження нирок при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті у щурів. UA 102401 U (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ РАННІХ УРАЖЕНЬ НИРОК ПРИ СТРЕПТОЗОТОЦИНІНДУКОВАНОМУ ЦУКРОВОМУ ДІАБЕТІ У ЩУРІВ UA 102401 U UA 102401 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до морфології, і може бути використана при дослідженнях експериментальних моделей цукрового діабету у дослідних тварин. Цукровий діабет (ЦД) належить до числа найбільш розповсюджених захворювань, які характеризуються розвитком гострих та хронічних ускладнень, що призводять до ранньої втрати працездатності, інвалідизації та смертності. У розвинутих країнах поширеність ЦД сягає 5-7 % від загальної популяції. З віком частота ЦД зростає, і серед осіб у віці 65 років зустрічається у понад 15 %. Водночас відомо, що реальна захворюваність на цю недугу є суттєво вищою, ніж стверджує офіційна статистика. Ускладнення ЦД, включаючи серцево-судинні захворювання, а також нефропатію, яка є одним з найважчих ускладнень у пізніх термінах хвороби, призводять до зростання захворюваності та смертності населення. Діабетична нефропатія зустрічається приблизно у 30 % хворих на цукровий діабет і призводить до ниркової недостатності. Першою ознакою нефропатії вважають появу мікроальбумінурії (наявність альбуміну в сечі), проте ця ознака поширюється не на всіх пацієнтів з нирковою недостатністю. При дослідженні сечі на вміст альбуміну слід виключати інфекції сечостатевої системи. Достовірність результатів також знижується при гіпертермії та фізичних навантаженнях, при наявності серцевої недостатності, вираженої гіперглікемії, вагітності, гематурії тощо. Незважаючи на велику кількість публікацій щодо патогенезу ЦД як у клініці, так і при експериментальному моделюванні у тварин, залишаються ще недостатньо зрозумілими патогенетичні механізми його розвитку, зокрема і ті, що лежать в основі диференційної сприйнятливості до розвитку діабетичної нефропатії. Найближчим аналогом корисної моделі є спосіб ранньої діагностики фіброзу нирок у хворих на діабетичну нефропатію (Пат. № 12644, МПК G01N33/573. Процес ранньої діагностики фіброзу нирок у хворих на діабетичну нефропатію / Топчій І.І., Гальчінська В.Ю., Кондаков I.К., Семенових П.С., Денисенко В.П.; Заявник Інститут терапії АМН України, заяв. № U200508267 від 22.08.2005, опубл. 15.02.2006, бюл. № 2), в якому визначають та оцінюють рівень міграції ізольованих моноцитів та концентрацію урокінази. При зниженні вказаних показників діагностують розвиток фіброзу нирок. Недоліком найближчого аналога-способу є те, що здебільшого він розрахований лише на дослідження в умовах клініки та у пацієнтів. Окрім того спосіб є доволі складним у використанні, потребує спеціальних вмінь та навичок та є складним у відтворенні експериментальних моделей цукрового діабету у дослідних тварин. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб діагностики ранніх уражень нирок при стрептозотоциніндукованому цукровому діабеті у щурів шляхом використання стрептозотоцину та фарбування гістологічних зрізів бромфеноловим синім за методом Mikel Calvo у сильно кислому середовищі, внаслідок чого по-різному фарбуються білки із різним співвідношенням аміно- та карбоксильних груп та оцінки забарвлення за допомогою мікроспектрофотометрії на основі коефіцієнта R/B. Спільними ознаками найближчого аналога та корисної моделі є те, що у обох випадках мова йде про ранню діагностику порушень функцій нирок при цукровому діабеті, а також те, що беруться до уваги зміни в сечі до появи протеїнурії. Відмінними ознаками найближчого аналога та корисної моделі є те, що: - як біологічний матеріал досліджують гістологічні зрізи тканин нирок тварин з цукровим діабетом; - як діагностичних критеріїв визначають співвідношення аміно- та карбоксильних груп білків; - оцінку діагностичних критеріїв проводять за допомогою мікроспектрофотометрії на основі коефіцієнта R/B. Визначення термінів, які використовуються при описі корисної моделі: цукровий діабет, діабетична нефропатія, гістохімічний метод. Теоретичні передумови здійснення способу, що заявляється. Особливостями стрептозотоцинової моделі ЦД на ранніх етапах розвитку є те, що в нирках не розвиваються видимі морфологічні зміни. Разом з цим має місце ураження аміногруп білків, але цей процес у різних структурах показує різні темпи розвитку. Зокрема, найбільш ранні зміни (вже на 11-у добу експерименту) відмічаються в мезангіоцитах та мезангіальному матриксі ниркових клубочків з наступним прогресуванням змін. На 21-шу добу такі зміни з'являються в ендотеліоцитах та субендотеліальних базальних мембранах кровоносних судин ниркових клубочків, інтерстиції кіркової, мозкової речовини та сосочка нирки, а також у базальній мембрані капсули Боумена. Ці зміни показують прогресію і на 31-шу добу. Найбільш пізно в процес залучаються епітеліоцити - подоцити ниркових клубочків та епітеліоцити звивистих 1 UA 102401 U 5 10 15 20 25 канальців нирки. Сполучно-тканинні волокна кіркової речовини, мозкової речовини та сосочку нирки не проявляють патології включно по 31-шу добу експерименту. Враховуючи динаміку ураження аміногруп білків, можна припустити, що механізм їх пошкодження носить подвійний характер: 1) неферментативне глікозилювання білків, 2) окисна модифікація білків. Корисна модель здійснюється наступним чином. Цукровий діабет моделюють шляхом одноразового внутрішньо-очеревинного введення стрептозотоцину (Sigma, США) у дозі 70 мг/кг дослідним самцям щурів віком два місяці. Морфологічне дослідження проводять вже на 11-ту добу після введення стрептозотоцину за допомогою гістохімічного методу. Гістологічні зрізи фарбують бромфеноловим синім за методом Mikel Calvo у сильно кислому середовищі, внаслідок чого по-різному забарвлюються білки із різним співвідношенням аміно- та карбоксильних груп: якщо в білку переважають аміногрупи - забарвлення характеризується переважанням синього кольору, а якщо карбоксильні - червоного. Забарвлення оцінюють кількісно на цифрових мікрофотографіях за допомогою комп'ютерної мікроспектрофотометрії при застосуванні системи RGB кількісної оцінки кольору на основі коефіцієнта R7B. При зростанні коефіцієнта R/B в порівнянні з показниками інтактних тварин діагностують ранні ураження нирок при стрептозотоциніндукованому цукровому діабеті у щурів. Приклади використання корисної моделі. Запропонований спосіб було перевірено на 50 дослідних самцях щурів віком два місяці, які були розділені на дві групи: 1 група - 25 інтактних щурів; 2 група - 25 щурів, до яких застосували запропонований спосіб. Оцінку коефіцієнта R/B проводили для ендотеліоцитів та субендотеліальних базальних мембран кровоносних судин ниркових клубочків, результати чого представлені в таблиці 1; та для мезангіального матриксу і мезангіоцитів, результати чого представлені в таблиці 2. Таблиця 1 Коефіцієнт R/B для ендотеліоцитів та субендотеліальних базальних мембран кровоносних судин ниркових клубочків при експериментальному цукровому діабеті в різні терміни експерименту (X±SX) Назва групи Інтактні 1. Дослідна група (11 доба після уведення стрептозотоцину) 2. Дослідна група (21 доба після уведення стрептозотоцину) 3. Дослідна група (31 доба після уведення стрептозотоцину) Коефіцієнт R/B, (X±SX) Вірогідність розбіжності (Р) з інтактними тваринами та в динаміці 1,09±0,014 1,10±0,018 1,38±0,012 1,44±0,017 Рі>0,05 Рі