Спосіб моделювання регенерації ушкоджених нейронів головного мозку при нейродегенеративних захворюваннях

Реферат: Спосіб моделювання регенерації ушкоджених нейронів головного мозку при нейродегенеративних захворюваннях включає введення цитокінового препарату тваринам з експериментальною моделлю структурних змін головного мозку. Використовують купризонову модель нейродегенеративних захворювань і після появи ознак порушень рухової активності мишей у поведінковому тесті "відкрите поле" (7 день прийому купризону), як цитокіновий препарат, внутрішньоочеревинно вводять рекомбінантний LIF людини у дозі 50 мкг/кг, 14 щоденних ін'єкцій, з наступною морфологічною оцінкою структури нейронів головного мозку і при її позитивних змінах свідчать про її відновлення. UA 104976 U (54) СПОСІБ МОДЕЛЮВАННЯ РЕГЕНЕРАЦІЇ УШКОДЖЕНИХ НЕЙРОНІВ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ UA 104976 U UA 104976 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної медицини, зокрема регенеративної терапії, і може застосовуватись для вивчення механізмів відновлення порушеної структури нейронів на моделі нейродегенеративних захворювань головного мозку з метою пошуку нейропротекторних засобів. Одним із найпоширеніших демієлінізуючих і нейродегенеративних захворювань нервової системи є розсіяний склероз, який уражає переважно осіб молодого віку і є основною причиною їх інвалідності в світі [Розсіяний склероз: глобальні перспективи / Т.С. Міщенко, О.Д. Шульга, Н.В. Бобрик, Л.А. Шульга // Укр. мед. часопис - 2014. - Т. 101, № 3. - С. 84-87]. В останній час спостерігається тенденція до зростання частоти цього захворювання, у тому числі в Україні, і посідає 2-ге місце з інвалідизації серед хвороб нервової системи. Це зумовлює актуальність дослідження патогенезу розсіяного склерозу та пошуку нових підходів для його терапії. Перспективною є клітинна терапія розсіяного склерозу, зокрема застосування підходів, що спрямовані на активацію власних нейральних стовбурових клітин (НСК)/прогеніторів у основних нейрогенних зонах головного мозку, їх диференціювання в нейрональному та гліальному напрямках [Lindvall О. Stem cells in human neurodegenerative disorders-time for clinical translation? / O.Lindvall, Z.Kokaia // JCI. - 2010. - Vol. 120, № 1. - P. 29-40]. На думку авторів регенераторний потенціал НСК може змінитись за умов дії факторів мікрооточення цих клітин, а саме цитокінів. Відомий спосіб лікування нейродегенеративних захворювань людини, зокрема хвороби Альцгеймера, шляхом введення інтерлейкінів із групи цитокінів [Патент №2519651 С2 RU, МПК(2006.01) А61К 38/20, А61Р 25/28, Лечение болезни Альцгеймера цитокинами, опубл.20.06.2014]. Однак, аналіз ефективності цього способу терапії згаданими цитокінами не дозволяє оцінити відновлення структури ушкоджених нейронів, ураховує лише зміни поліморфізму генів нейтрофілів хворих. Відомий спосіб відновлення структурних змін головного мозку при нейродегенеративних захворюваннях у мишей (модель ішемії головного мозку) шляхом введення гемопоетичних цитокінів [Administration of hematopoietic cytokines in the subacute phase after cerebral infarction is effective for functional recovery facilitating proliferation of intrinsic neural stem/progenitor cells and transition of bone marrow-derived neuronal cells / H.Kawada [et al.] // Circulation. -2006. - Vol. 111. P. 701-710]. Проте, цей спосіб ґрунтується на морфологічній оцінці у піддослідних тварин змін розміру ділянки ушкодження, без аналізу структурних змін нейронів та морфометрії гістологічних препаратів. Найближчим аналогом способу, що заявляється, є спосіб сповільнення розвитку деструктивних змін нервових волокон у щурів з експериментальним алергічним енцефаломієліті, який є моделлю розсіяного склерозу людини, шляхом використання цитокінового препарату "Ребіф" (інтерферон -1) [Патент № 3911U UA, МПК G09B23/28, Спосіб ремієлінізації нервових волокон при експериментальному алергічному енцефаломієліті, опубл. 15.12.2004, бюл. № 12]. Недоліками цього способу є: недостатня інформативність, оскільки даний спосіб ґрунтується на оцінці у піддослідних тварин прискорення ремієлінізацї аксонів нейронів шляхом використання цитокіну без дослідження змін структури тіл нейронів; спостереження за експериментальними тваринами для досягнення ефекту сповільнення цитокіном розвитку структурних змін нервових волокон є довготривалим (4 тижні); виконання досліджень відбувається переважно на щурах, що не дозволяє в повній мірі вивчати імунні механізми розсіяного склерозу, як це можливо на інбредних лініях мишей. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб моделювання регенерації ушкоджених нейронів головного мозку при нейродегенеративних захворюваннях шляхом введення інбредним мишам із купризоновою моделлю нейродегенерації цитокіну рекомбінантного LIF (лейкемія інгібіторного фактора) людини, що дозволить інформативно, з меншими затратами, доступно оцінити зміни структури нейронів головного мозку з метою подальшого обґрунтування підходів до терапії цього захворювання та тестування медикаментозних препаратів. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає введення цитокінового препарату тваринам з експериментальною моделлю структурних змін головного мозку, згідно з даною корисною моделлю, використовують купризонову модель нейродегенеративних захворювань і після появи ознак порушень рухової активності мишей у поведінковому тесті "відкрите поле" (7 день прийому купризону), як цитокіновий препарат, внутрішньоочеревинно вводять рекомбінантний LIF людини у дозі 50 мкг/кг, 14 щоденних ін'єкцій, з наступною морфологічною оцінкою структури нейронів головного мозку і при її позитивних змінах свідчать про її відновлення. 1 UA 104976 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дане рішення стало можливим завдяки дослідженню авторами нейропротекторного впливу цитокінів на адаптованій для таких досліджень експериментальній купризоновій моделі нейродегенерації [Патент № 9445 8U UA, МПК G09B23/28. Спосіб моделювання структурних змін нейронів центральної нервової системи при демієлінізуючих захворюваннях / Лабунець І.Ф. та співавт., опубл. 10.11.2014, Бюл. № 21]. Доведено, що LIF є ростовим фактором у культурі НСК і сприяє їх диференціації у нейрональному напрямку, стимулює проліферацію попередників олігодендроцитів, пригнічує апоптоз олігодендроцитів, підвищує регенераторний потенціал моторних нейронів. Отримані результати дозволяють досягти регенерації ушкоджених нейронів головного мозку під впливом рекомбінантного LIF людини, що важливо не тільки для вивчення патогенезу розсіяного склерозу, але й розробки нових підходів до терапії цього захворювання. Спосіб здійснюється наступним чином. Інбредним мишам лінії 129/Sv (віком 4-4,5 міс. з масою тіла 20,0±3,0 г), які знаходились у стандартних умовах віварію при світловому режимі 12:12, моделюють нейродегенеративне ушкодження головного мозку. Для цього з їжею вводять нейротоксин купризон, із розрахунку 0,2 % від добового корму, щоденно, впродовж трьох тижнів. Після появи ознак порушень поведінкових реакцій у тесті "відкрите поле" (вірогідне зменшення рухової активності), 7-а доба прийому купризону, мишам щоденно, внутрішньоочеревинно вводять рекомбінантний LIF людини. Відомо, що рекомбінантний LIF людини виявляє свою біологічну активність як відносно клітин людини, так і відносно клітин мишей і після введення мишам взаємодіє із рецепторами до цього цитокіну на клітинах нервової системи. Разова доза цитокіну 50 мкг/кг підібрана експериментально, курсом 14 ін'єкцій, щоденно. Наприкінці експерименту в усіх тварин виділяють головний мозок для подальших морфологічних досліджень з метою виявлення зміни форми тіла та ядра нейронів, особливостей розміщення хроматофільної субстанції. Проводять морфометричний аналіз, у відсотках, незмінених нейронів і нейронів із реактивними (помірними) і деструктивними (виразними) структурними змінами. Результати морфологічної оцінки структурних змін нейронів головного мозку порівнюють із тваринами, які отримували лише нейротоксин купризон. У разі виявлення позитивних змін структури нейронів головного мозку свідчать про відновлюючий вплив рекомбінантного LIF людини на деструктивні зміни. Морфологічні дослідження проведені на мишах лінії 129/Sv інтактних (контрольна група) (n=6), тих, що отримували нейротоксин купризон (n=8), a також купризон у поєднанні із рекомбінантним LIF людини (n=8). Результати впливу введення рекомбінантного LIF людини на стан нейронів кори головного мозку мишей на купризоновій моделі нейродегенерації наведені на кресленні (мікрофотографія, забарвлення толуїдиновим блакитним; Ок. 10, об. 40). Як видно із креслення, після прийому нейротоксину купризон (Б) у сірій речовині головного мозку (кора) мишей більшість нейронів у полі зору мають патологічні зміни апоптотичного характеру (інтенсивно забарвлене ядро, ядерце не визначається, розміри перикаріону і ядра значно зменшені) порівняно із інтактними мишами контрольної групи (А). В той же час у мишей, які одночасно із купризоном отримували курс ін'єкцій рекомбінантного LIF людини (В), у корі головного мозку спостерігається просвітлення цитоплазми нейронів, збільшення розмірів ядер та ядерець практично у всіх нейронах, що є характеристикою їх активного стану. Отже, результати морфологічних досліджень свідчать про активний стан нейронів сірої речовини головного мозку, розвиток відновної, компенсаторно-пристосувальної реакції за умов одночасного введення купризону та рекомбінантного LIF людини. При морфометрії гістологічних препаратів кори головного мозку було оцінено співвідношення нейронів із різними структурними змінами. Помірні зміни нейронів є реактивними і можуть свідчити про активацію синтетичних процесів у відповідь на зовнішні впливи; виразні (деструктивні) зміни нейронів характеризуються як апоптотичні і свідчать про більш глибокі патологічні зміни нейронів. Встановлено, що у інтактних тварин частка нейронів незмінених, із помірними змінами, а також виразними змінами відповідає 83 %, 12 % і 5 %. У мишей, які отримували нейротоксин купризон, частка незмінених нейронів зменшується до 15 %, тоді як нейронів із помірними і особливо виразними змінами підвищується відповідно до 32 % і 53 %. Після введення рекомбінантного LIF людини мишам на тлі прийому купризону частка незмінених нейронів підвищується до 48 %, а нейронів із помірними і виразними змінами, навпаки, зменшується, відповідно до 16 % та 36 %. Тобто, встановлено активуючий вплив рекомбінантного LIF людини на синтетичні процеси в нейронах головного мозку мишей, які вживали нейротоксин купризон. 2 UA 104976 U Таким чином, спосіб інформативний, дозволяє досягти регенерації ушкоджених нейронів головного мозку під впливом рекомбінантного LIF людини, що важливо не тільки для вивчення патогенезу розсіяного склерозу, але й розробки нових підходів до терапії цього захворювання. 5 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб моделювання регенерації ушкоджених нейронів головного мозку при нейродегенеративних захворюваннях, який включає введення цитокінового препарату тваринам з експериментальною моделлю структурних змін головного мозку, який відрізняється тим, що використовують купризонову модель нейродегенеративних захворювань і після появи ознак порушень рухової активності мишей у поведінковому тесті "відкрите поле" (7 день прийому купризону), як цитокіновий препарат, внутрішньоочеревинно вводять рекомбінантний LIF людини у дозі 50 мкг/кг, 14 щоденних ін'єкцій, з наступною морфологічною оцінкою структури нейронів головного мозку і при її позитивних змінах свідчать про її відновлення. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3