Спосіб моделювання структурних змін нейронів центральної нервової системи при демієлінізуючих захворюваннях

Реферат: Спосіб моделювання структурних змін нейронів центральної нервової системи при демієлінізуючих захворюваннях включає введення тваринам моделюючого засобу, здатного впливати на зміни нейронів. При цьому мишам вводять нейротоксин купризон з їжею з розрахунку 0,2 % від добового корму, щоденно, протягом трьох тижнів, з наступною морфологічною оцінкою структурних змін нейронів. UA 94458 U (54) СПОСІБ МОДЕЛЮВАННЯ СТРУКТУРНИХ ЗМІН НЕЙРОНІВ ЦЕНТРАЛЬНОЇ НЕРВОВОЇ СИСТЕМИ ПРИ ДЕМІЄЛІНІЗУЮЧИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ UA 94458 U UA 94458 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної медицини і може застосовуватись для моделювання структурних змін нейронів (реактивних, деструктивних) центральної нервової системи (ЦНС) у мишей для вивчення патогенезу демієлінізуючих захворювань, зокрема розсіяного склерозу. Розсіяний склероз - одне із найпоширеніших демієлінізуючих захворювань ЦНС, яке вражає в основному людей працездатного віку і призводить до їх інвалідизації. В останній час спостерігається тенденція до зростання захворювання розсіяним склерозом у тому числі в Україні. Це зумовлює актуальність пошуку адекватних експериментальних моделей та підходів для вивчення патогенезу цього захворювання, зокрема морфофункціональних змін нейронів ЦНС. Все більше дослідників відносять розсіяний склероз не тільки до демієлінізуючого, але й нейродегенеративного захворювання. Ушкодження нейронів може сприяти порушенню структури та функціонування аксонів нейронів і формуванню характерних для розсіяного склерозу таких неврологічних симптомів, як зміни пам'яті, емоцій, інтелекту, вегетативні розлади тощо. Вважають, що демієлінізація є вторинним проявом патологічної зміни нейронів ЦНС. Найчастішими моделями демієлінізації є: експериментальний аутоімунний/алергічний енцефаломієліт; вірус-індуковані моделі; токсин-індуковані моделі [Давыдова Г.С. Острый энцефаломиелит в эксперименте и клинике. / Г.С. Давыдова. - Минск: Наука и техника, 1969. С.32-37; Гусев Е.И. Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания / Е.И. Гусев, И.А. Завалишин, А.Н. Бойко. - М.: Миклош, 2004. - С. 60-74; Цимбалюк В.І. Особливості моделювання та перебігу експериментального алергічного енцефаломієліту / В.І. Цимбалюк, Ю.А. Касяненко // Український нейрохірургічний журнал. - 2005. - №1. - С. 45-51]. Проте ці моделі не в повній мірі виявляють структурні зміни нейронів в ЦНС. Найближчим аналогом способу, що заявляється, є спосіб моделювання структурних змін нейронів головного і спинного мозку щурів при експериментальному алергічному енцефаломієліті - одна із моделей розсіяного склерозу - шляхом введення енцефалітогенної суміші (гомогенат спинного мозку разом з ад'ювантом Фрейнда) у подушечку задніх лап тварин з морфологічною оцінкою стану нейронів ЦНС через 21 і 39 діб після індукції захворювання [Патент №45240 А, Україна, МПК A61N 5/06, Опубл. 2002.- № 3]. Недоліками цього способу є: - отримання структурних змін нейронів головного і спинного мозку потребує тривалого спостереження за експериментальними тваринами (до 39 діб); при цьому у тварин не завжди досягається нейродегенерація в повній мірі та в основному переважають реактивні (помірні) зміни нейронів; - ефективне моделювання структурних змін нервової системи відбувається переважно на щурах, тоді як моделювання на інбредних лініях мишей, які є адекватними тваринами для вивчення імунних механізмів розсіяного склерозу, потребує використання дорогих реактивів. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу моделювання структурних змін нейронів центральної нервової системи при демієлінізуючих захворюваннях шляхом введення мишам нейротоксину - купризону, що дозволить інформативно, без надмірних економічних затрат, доступно відтворити модель для дослідження патогенезу розсіяного склерозу, зокрема структурних змін нейронів ЦНС. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає введення тваринам моделюючого засобу, здатного впливати на зміни нейронів, згідно з корисною моделлю, мишам вводять нейротоксин купризон з їжею з розрахунку 0,2 % від добового корму, щоденно, протягом трьох тижнів з наступною морфологічною оцінкою структурних змін нейронів ЦНС. Купризон [біс(циклогексанон)-оксалдигідразону] - це мідний хелатор, який у мишей при моделюванні розсіяного склерозу виявляє вибіркову токсичну дію на зрілі олігодендроцити, які продукують мієлін, що призводить до вираженої демієлінізації ЦНС. При цьому пригнічення активності цитохромоксидази, моноамінооксидази у мітохондріях олігодендроцитів супроводжується їх апоптозом [Acs P. Pathogenesis of multiple sclerosis: what can we learn from the cuprizone model / P. Acs, B. Kalman // Methods Моl Biol. - 2012. - Vol. 900. - P. 403-431] Дане рішення стало можливим завдяки дослідженню авторами впливу цього засобу при короткостроковому спостереженні (3 тижні), коли у тварин тільки починають формуватись перші прояви демієлінізації. Отримані результати дозволяють виявити структурні зміни нейронів ЦНС, що важливо для вивчення патогенезу розсіяного склерозу. Спосіб здійснюється наступним чином. Інбредним мишам лінії 129/Sv (віком 4-4,5 міс. з масою тіла 20,0±3,0 г) вводять нейротоксин купризон з їжею з розрахунку 0,2 % від добового корму, щоденно, протягом трьох тижнів. 1 UA 94458 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Тварини знаходились у стандартних умовах віварію при світловому режимі 12:12. Наприкінці експерименту в усіх тварин виділяли головний та спинний мозок для подальших морфологічних досліджень для виявлення зміни форми тіла та ядра нейронів, особливостей розміщення хроматофільної субстанції. Проводили морфометричний аналіз, у відсотках, незмінених нейронів і нейронів із реактивними (помірними) і деструктивними (виразними) структурними змінами. У проведених нами морфометричних дослідженнях встановлено, що у мишей, які отримували купризон (n=8), спостерігаються структурні зміни нейронів сірої речовини головного і спинного мозку. Якщо у контрольних мишей (n=8) нейрони сірої речовини головного мозку, у деяких випадках, мають збільшені розміри ядер, що вказує на фізіологічну активність цих клітин (фіг. 1 А), то у піддослідних мишей, які отримували купризон, практично всі нейрони в полі зору мають виразні зміни апоптотичного характеру (інтенсивно забарвлене ядро, ядерце не визначається, розміри перикаріону і ядра значно зменшені) (фіг. 1 Б). Фіг. 1 - Сіра речовина кори головного мозку мишей лінії 129/Sv: А - контрольна група; Б - після вживання купризону. Мікрофотографія. Забарвлення толуїдиновим блакитним. Ок. 10, об. 40. У контрольних мишей нейрони сірої речовини поперекового відділу спинного мозку можуть мати зміни реактивного характеру, що зумовлено фізіологічною активністю даних клітин (фіг. 2А). Напроти, у піддослідних мишей цієї лінії після введення купризону нейрони мають структурні зміни, в основному, деструктивного характеру: апоптично змінені - характерне інтенсивно забарвлене ядро, ядерце не визначається, розміри перикаріону та ядра значно зменшені; частина нейронів є інтенсивно гіперхромними, що вказує на початок апоптичного процесу в цих клітинах (фіг. 2Б). Фіг. 2 - Сіра речовина поперекового відділу спинного мозку мишей лінії 129/Sv: А - контрольна група; Б - після вживання купризону. Мікрофотографія. Забарвлення толуїдиновим блакитним. Ок. 10, об. 40. При морфометричному аналізі встановлено, що структурні зміни нейронів сірої речовини головного і спинного мозку мишей, які отримували купризон, мають різний характер - від реактивних (помірних) до виразних (деструктивних). Помірні зміни нейронів є реактивними і, скоріше за все, свідчать про активацію синтетичних процесів у відповідь на ушкодження. Значні ушкодження нейронів, які характеризуються як апоптичні, спостерігали в головному і спинному мозку переважної більшості тварин, що свідчить про більш глибокі їх патологічні зміни (табл. 1). Для доказовості ефективності порівнювали спосіб, що заявляється, з найближчим аналогом. Для цього дані, отримані нами на мишах, яким вводили нейротоксин купризон, співставляли з даними найближчого аналога, тобто дорослими щурами із експериментальним алергічним енцефаломієлітом на 21-шу добу. Купризон виявився більш ефективним у моделюванні виразних (деструктивних) змін нейронів спинного мозку порівняно із тваринами із експериментальним алергічним енцефаломієлітом (табл. 2). Перевагою купризонової моделі нейродегенерації порівняно із моделлю експериментального алергічного енцефаломієліту є доступність, можливість досягнення ефекту вираженої деструкції нейронів вже через 3 тижні прийому препарату. Таким чином, купризонова модель демієлінізації є адекватною експериментальною моделлю нейродегенерації, а тому може застосовуватись при вивченні патогенезу розсіяного склерозу, а також може бути корисною при обґрунтуванні підходів до терапії цього захворювання з використанням факторів, які впливають як на демієлінізацію, так і прояви нейродегенерації. 45 Таблиця 1 Відсоткові співвідношення тіл нейронів сірої речовини головного та спинного мозку в експериментальних групах мишей Експериментальні групи Незмінені нейрони, % З помірними змінами, % З виразними змінами, % Кора головного мозку контроль 88 12 0 купризон 2 35 63 Поперековий відділ спинного мозку контроль 93 7 0 купризон 0 6 94 2 UA 94458 U Таблиця 2 Відсоткові співвідношення тіл нейронів сірої речовини поперекового відділу спинного мозку у мишей, які отримували купризон, і щурів із експериментальним алергічним енцефаломієлітом (ЕАЕ) в динаміці експерименту Експериментальні групи і З помірними змінами, Незмінені нейрони, % строк дослідження % Основна група (миші) контроль 93 7 через 21 добу з 0 6 купризоном Група порівняння (щури) контроль 95,6 4,4 через 21 добу з ЕАЕ 9,5 80,9 через 39 діб з ЕАЕ 16,6 82,3 З виразними змінами, % 0 94 0 9,6 1,1 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб моделювання структурних змін нейронів центральної нервової системи при демієлінізуючих захворюваннях, що включає введення тваринам моделюючого засобу, здатного впливати на зміни нейронів, який відрізняється тим, що мишам вводять нейротоксин купризон з їжею з розрахунку 0,2 % від добового корму, щоденно, протягом трьох тижнів, з наступною морфологічною оцінкою структурних змін нейронів. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3