Спосіб ідентифікації соняшнику, стійкого до несправжньої борошнистої роси

Реферат: Спосіб ідентифікації соняшнику, стійкого до несправжньої борошнистої роси, включає оцінку стійкості соняшнику до збудника несправжньої борошнистої роси. Він здійснюється за допомогою електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації ДНК за локусом 28 S-PHK геному Plasmopara helianthi та ідентифікації аналізованого зразка соняшнику як стійкого до несправжньої борошнистої роси при відсутності в спектрі ампліфікації ДНК фрагмента розміром 308 пар нуклеотидів. UA 105618 U (54) СПОСІБ ІДЕНТИФІКАЦІЇ СОНЯШНИКУ, СТІЙКОГО ДО НЕСПРАВЖНЬОЇ БОРОШНИСТОЇ РОСИ UA 105618 U UA 105618 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до використання ДНК-маркерів в селекції соняшника. Одним з найбільш загрозливих захворювань соняшника є несправжня борошниста роса (НБР). Збудник НБР соняшника - Plasmopara helianthi Novot. - облігатний патоген грибної природи з класу Oomycetes. Ураження рослин відбувається через кореневу систему зооспорами, які утворюються при проростанні ооспор. Міцелій грибу розвивається в рослині дифузно і спричиняє пригнічення росту рослини соняшника. Появу захворювання можливо спостерігати на стадії 3-4 пари справжніх листків. Зазвичай такі рослини швидко гинуть. Деколи зустрічаються більш пізні форми захворювання, за яких уражуються кошики і насіння. Значне збільшення площ під соняшником, передчасне його повернення на попередні місця вирощування спричиняє накопичення інфекції в ґрунті. Ооспори несправжньої борошнистої роси зберігаються в насінні уражених рослин, в ґрунті, в уражених сходах падалиці. Шкодочинність цього захворювання обумовлює обов'язкове тестування стійкості селекційного матеріалу. Відомі способи польової та лабораторної оцінки стійкості соняшника до НБР. Дані польових випробувань не завжди достовірні у зв'язку з тим, що польова стійкість залежить від агроекологічних умов вирощування, в засушливі роки за певних умов мінерального живлення у сприйнятливих форм соняшника збудник НБР може розвиватися в рослині у прихованій формі, без зовнішніх ознак захворювання. Основним способом оцінки стійкості соняшника до НБР є метод лабораторної імунологічної діагностики [1]. За даним способом насіння соняшника пророщують в термостаті протягом 2-3 діб, після чого проростки 5-9 см витримують в суспензії зооспор несправжньої борошнистої роси за температури 13-15 °C, потім проростки в рулонах фільтрувального паперу витримують в кліматичних камерах для подальшого пророщування за температури 20-25 °C та вологості повітря 90-95 %. Через 6-7 діб проросткам створюють умови вологої камери на 12-15 годин, після чого по появі на проростках спороношення визначають стійкі та уражені несправжньою борошнистою росою зразки. До недоліків даного способу треба віднести наступні: 1) досить тривалий термін проведення оцінки та її велика вартість за рахунок використання кліматичних камер в зимовий період, 2) неможливість встановити рівень стійкості на різних стадіях онтогенезу рослини. Для детекції патогенів в тканинах і насінні рослин запропонована низка молекулярногенетичних тестів, які базуються на використанні полімеразної ланцюгової реакції [2, 3]. З метою усунення недоліків способу, що вибрано як прототип, пропонується спосіб ідентифікації стійких до несправжньої борошнистої роси зразків соняшника шляхом детекції збудника захворювання Plasmopara helianthi за використання ампліфікації специфічної для даного патогенного виду ділянки його геному. За допомогою використання ДНК-маркера показана можливість детекції збудника НБР в тканинах уражених рослин соняшнику на різних стадіях розвитку, а також ідентифікації стійких до НБР зразків, в яких розвиток патогену є неможливим [4]. В основу корисної моделі поставлено задачу детекції збудника несправжньої борошнистої роси в тканинах рослин соняшнику шляхом аналізу спектрів ДНК, ампліфікованої за допомогою полімеразної ланцюгової реакції за локусом 28 S-PHK геному Plasmopara helianthi, що дозволить ідентифікацію стійких до НБР зразків. Поставлена задача вирішується за допомогою електрофорезу в 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації ДНК геному Plasmopara helianthi за локусом 28 S-PHK та ідентифікації аналізованого зразка соняшника як стійкого до несправжньої борошнистої роси за відсутності в спектрі алеля розміром 308 пар нуклеотидів. Відмінними від прототипу ознаками в корисній моделі, що заявляється, є: - можливість проводити оцінку стійкості генотипу на будь-якій стадії онтогенезу рослини, - показник, що дозволяє детектувати стійкі генотипи, - висока точність, надійність та об'єктивність ідентифікації стійких генотипів. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак та досягнутим результатом (підвищення точності, надійності та об'єктивності оцінки стійкості) можна пояснити так. ПЛР-аналіз локусу 28 S-PHK геному Plasmopara helianthi дозволяє виявляти специфічний саме для цього патогенного виду грибів фрагмент ампліфікації ДНК розміром 3081 пар нукдеотидів, який є маркером генетичного матеріалу патогену. В стійких до НБР рослинах соняшнику розвиток Plasmopara helianthi є неможливим. При відсутності в спектрі ампліфікації ДНК, яка виділена з тканин зразку соняшника, фрагмента 308 пар нуклеотидів (тобто маркера генетичного матеріалу збудника НБР Plasmopara helianthi) аналізований генотип соняшника можливо ідентифікувати як стійкий до несправжньої борошнистої роси. Спосіб здійснюється таким чином. 1 UA 105618 U 5 10 15 Виділення ДНК. Сегменти тканин соняшника гомогенізувати в 1.5 мл-пробірках в лізуючому буфері (20.0 мМ Nа3ЕДТА, 0.1 М тріс-НСІ рН 8.5 при 25 °C, 1.4 М NaCl, 2.0 % СТАВ) до повної мацерації тканин. Лізат інкубувати 45 хв при 60 °C. Додати рівний об'єм суміші хлороформізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Центрифугувати 5 хв при 14000 об/хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чисті пробірки та додати рівний об'єм ізопропілового спирту, перемішати, осадити ДНК центрифугуванням при 10000 об/хв протягом 4 хв на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осад промити двічі 0.5 мл 70 % етанола, центрифугувати при 10000 об/хв протягом 4 хв на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осад ДНК підсушити при кімнатній температурі 15 хв та розчинити в 0.3 мл ТЕ-буферу (10.0 мМ тріс НСl, 1.0 мМ ЕДТА). Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводити на приладі "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). Вміст реакційної суміші для проведення ПЛР об'ємом 20 мкл: 50 мМ КСl, 20 мМ тріс-НСІ (рН 8,4 при 25 °C), 0,01 % Tween-20, 2 мМ MgCh, 0,2 мкМ кожного праймеру, 200 мкМ кожного dNTP. 10 нг геномної ДНК, 1 одиниця активності ДНК-полімерази Taq. Ампліфікація (35 циклів): денатурація при 94 °C на першому циклі 2 хв, далі - 40 с; відпал при 60 °C 30 с; синтез при 72 °C 2 хв; остання елонгація 5 хв. В таблиці наведено інформацію про послідовності праймерів для ампліфікації ДНК за локусом 28 S-РНК геному Plasmopara helianthi. Таблиця Праймери для аналізу алельного складу за локусом 28 S-PHK геному Plasmopara helianthi Послідовність прямого (П) та зворотнього (3) праймерів (5'-3') П З 20 25 30 35 40 45 50 Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Оцінювати продукти ампліфікації (10 мкл-аліквоту ПЛР-суміші) у 10 % денатуруючому поліакриламідному гелі. Склад гелю: 10 % акриламід, 7 М мочевина, 1 х ТВЕ-буфер (50 мМ тріс-Н3ВО3, 2 мМ ЕДТА, рН 8.0). Умови електрофорезу: напруга 500 V протягом 120 хв. при 65 °C. Для приготування одного гелю необхідно змішати 12.5 мл 8 М сечовини, 12.5 мл розчину 30 % поліакриламіду з 8 М сечовини, 2.5 мл 10 х ТВЕ-буферу, 25 мкл ТМЕД, 50 мкл 10 % ПСА. Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1 мкл денатуруючого буфера для нанесення (98 % формамід, 10 мМ ЕДТА рН 8.0, 0.2 % (w/v) бромфеноловий синій, 0.2 % (w/v) ксиленціанол) та денатурувати протягом 1.5 хв при 95 °C, після чого швидко охолодити на льодяній бані та за допомогою шприца нанести в лунку гелю. Одна доріжка гелю повинна містити зразок ДНК з відомою молекулярною масою. Як стандарт молекулярної маси використовувати ДНК pUC 19, рестриктовану Mspl. Візуалізація продуктів ампліфікації. Поліакриламідний гель фарбувати відповідно до методики: гель покласти на 5 хв у 10 % етанол, перенести у 1 % НlМО3 на 3 хв. Гель промити кілька разів дистильованою водою. Витримати 20 хв у 0.012 М AgNO3 у темряві, промити кілька разів дистильованою водою. Інкубувати гель у відновлюючому розчині (0.28 М Nа2СО3 (безводний), 0.019 % формалін), змінюючи розчин у кожному разі його потемніння, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Промити кілька разів бідистильованою водою. Гелі зберігати між двома листами прозорої поліетиленової плівки. Документування отриманих електрофореграм. Документувати отримані електрофореграми за допомогою цифрового фотоапарату. Розмір фрагмента ампліфікації встановлювати за допомогою комп'ютерної програми "Gelanalyzer" згідно стандарта молекулярної маси. Оцінка стійкості генотипу соняшника до несправжньої борошнистої роси. За результатами ПЛР-аналізу локуса 28 S-PHK геному Plasmopara helianthi встановити наявність чи відсутність фрагмента розміром 308 пар нуклеотидів в спектрі ампліфікації ДНК аналізованого зразка соняшника. Наявність фрагмента розміром 308 пар нуклеотидів (тобто маркера генетичного матеріалу збудника НБР Plasmopara helianthi) буде свідчити про те, що даний генотип соняшника можливо ідентифікувати як нестійкий до несправжньої борошнистої роси. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Оцінка стійкості інбредної лінії соняшника Одеська 108А до несправжньої борошнистої роси. Для дослідження брали насіння інбредної лінії Одеська 108А, виділяли ДНК, проводили електрофорез у 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за локусом 28 S-PHK 2 UA 105618 U 5 10 15 20 25 геному Plasmopara helianthi. В ДНК-спектрі виявлено фрагмент ампліфікації розміром 308 пар нуклеотидів, тобто маркер генетичного матеріалу збудника НБР Plasmopara helianthi. Висновок: в насінні інбредної лінії соняшника Одеська 108А присутній генетичний матеріал патогенного грибу Plasmopara helianthi, тобто дана інбредна лінія є нестійкою до несправжньої борошнистої роси. Приклад 2. Оцінка стійкості інбредної лінії соняшника Одеська 1029В до несправжньої борошнистої роси. Для дослідження брали насіння інбредної лінії Одеська 1029В, виділяли ДНК, проводили електрофорез у 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за локусом 28 S-PHK геному Plasmopara helianthi. В ДНК-спектрі не виявлено фрагмент ампліфікації розміром 308 пар нуклеотидів (маркер генетичного матеріалу збудника НБР Plasmopara helianthi). Висновок: в насінні інбредної лінії соняшника Одеська 1029В відсутній генетичний матеріал патогенного грибу Plasmopara helianthi, тобто дана інбредна лінія є стійкою до несправжньої борошнистої роси. Джерела інформації: 1. Долгова Е.М. Экспресс-метод оценки подсолнечника на устойчивость к ложной мучнистой росе/ Е.М. Долгова, З.К. Аладьина, В.Н. Михайлова// Селекция и семеноводство. - 1990. - Вып. 68. - С. 50-55. 2. Berg Т. PCR-based detection of Xanthomonas campestris pathovars in Brassica seed/ T. Berg, L. Tesoriero, D.L. Hailstones// Plant pathology. - 2005. - 54. - P. 416-427. 3. Development of a PCR test to detect the downy mildew causal agent Plasmopara halstedii in sunflower seeds/ R. loos, L. Laugustin, S. Rose [et al.]// Plant Pathology. - 2007. - 56. - P. 209-218. 4. Солоденко А.Е. Детекция возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника с помощью ДНК-маркера// Вісник Запорізького національного університету (Біологічні науки). 2013. - № 3. - С. 5-10. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб ідентифікації соняшнику, стійкого до несправжньої борошнистої роси, що включає оцінку стійкості соняшнику до збудника несправжньої борошнистої роси, який відрізняється тим, що він здійснюється за допомогою електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації ДНК за локусом 28 S-PHK геному Plasmopara helianthi та ідентифікації аналізованого зразка соняшнику як стійкого до несправжньої борошнистої роси при відсутності в спектрі ампліфікації ДНК фрагмента розміром 308 пар нуклеотидів. 35 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3