Спосіб моделювання алкогольного стеатогепатозу

Реферат: Спосіб моделювання алкогольного стеатогепатозу в експерименті на лабораторних тваринах шляхом введення водного розчину етанолу. Спочатку водний розчин етанолу вводять внутрішньочеревно в наркотичній дозі, а потім для попередження самореабілітації тварин переводять на напівпримусову алкоголізацію за допомогою етанолвмісного єдиного джерела питва. UA 106382 U (12) UA 106382 U UA 106382 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до медицини, а саме до способів моделювання алкогольного стеатогепатозу в експерименті, та може бути використаний в лабораторіях, науково-дослідних установах як для вивчення патогенетичних механізмів ураження печінки, так і ефективності впливу терапевтичних препаратів на морфо-функціональний стан гепатоцитів на прикладі дрібних лабораторних тварин. Однією з ключових проблем сучасної гепатології є стеатогепатоз - захворювання, при якому в гепатоцитах накопичується жир у вигляді тригліцеридів у кількості понад 5 % від маси печінки. Актуальність проблеми зростає з огляду на те, що у 20 % хворих на стеатоз печінки розвивається стеатогепатит, який у 10 % трансформується у цироз печінки, а у 2 % хворих надалі розвивається гепатоцелюлярна карцинома. Припускається, що стеатогепатит займає перше місце серед причин розвитку фіброзу та цирозу печінки [1]. Сучасна література достатньо широко висвітлює вплив на печінку різних екзогенних факторів, зокрема етанолу, проте з'ясовано ще не все. Однією з основних гістологічних особливостей розвитку алкогольного гепатиту є стеатоз, при цьому його розвиток пов'язано, в першу чергу, з порушенням метаболізму жирних кислот, у зв'язку з перетворенням етанолу в ацетальдегід і ацетат і підвищенням синтезу тригліцеридів [2-4]. Відомо, що зростання вмісту ацетальдегіду в печінці щурів після введення етанолу призводить до дисбалансу фосфоліпідних фракцій мембран гепатоцитів - збільшується вміст в них холестеролу, підвищується хаотропність, текучість та проникність мембрани [5-8]. Тому вивчення механізмів впливу етанолу та його метаболітів на експериментальних моделях уражень печінки у щурів дозволять зрозуміти фундаментальні основи виникнення та розвитку алкогольного стеатозу. Одним із найбільш поширених способів моделювання алкогольних уражень печінки є добровільне вживання тваринами 15 % розчину етанолу за умов вільного доступу до води [9]. Проте недоліком цього способу є нерівномірне вживання тваринами розчину етанолу при груповому утриманні та необхідність відбирати тварин, схильних до алкоголю, при формуванні піддослідних груп. Найближчим прототипом до заявлюваного способу є модель примусового введення етанолу двічі на добу в наркотичній дозі (3,5 г/кг, інтрагастрально у вигляді 25 % розчину) протягом чотирьох діб з перервою в три доби, протягом двох-чотирьох тижнів [10]. Але недоліком такого способу моделювання хронічних процесів є розвиток адаптаційно-компенсаторних реакцій вже після 3-4 повторних циклів. Окрім того, процедура інтрагастрального зондового введення етанолу є стресуючою для тварин і потребує неабияких навиків та суттєвих працезатрат. В основу корисної моделі поставлена задача розробити ефективну модель хронічного алкогольного стеатогепатозу, яку можна відтворити за відносно короткий проміжок часу з максимально вираженими морфологічними змінами в печінці та з мінімальними затратами ресурсів. Поставлена задача відтворення моделі алкогольного стеатогепатозу вирішується наступним чином: попередньо відтворюється гостра етанольна інтоксикація шляхом введення наркотичної дози водного розчину етанолу, в подальшому щурів переводять на тривалу напівпримусову алкоголізацію. Загальною ознакою з прототипом є використання як гепатотоксину водного розчину етанолу для відтворення алкогольного стеатогепатозу у щурів. Відмінною ознакою є те, що спочатку водний розчин етанолу вводять внутрішньочеревно в наркотичній дозі, а потім для попередження самореабілітації переводять на напівпримусову алкоголізацію за допомогою етанолвмісного єдиного джерела питва. Спосіб здійснюють наступним чином: лабораторним щурам масою 180-230 г примусово проводили переривисту алкоголізацію протягом 5 днів з повтором через два дні, шляхом внутрішньочеревного введення 16,5 % водного розчину етанолу в 5 % водному розчині глюкози з розрахунку 4 мл етанолу на 1 кг ваги тварини. В подальшому через 14 днів від початку примусової алкоголізації їх переводили на напівпримусову алкоголізацію, тобто тварини вживали як єдине джерело пиття 10% водний розчин етанолу. Виведення тварин здійснювали через 8 тижнів від початку моделювання. Після 60 днів від початку хронічної напівпримусової алкоголізації та 10-денного введення алкоголю в печінці щурів розвивався комплекс характерних структурних змін. В основі цих змін лежала дифузна розповсюджена мікровезикулярна жирова дистрофія, яка залучала до 80 % всіх клітин. Крім цього, у 83,3 % випадків спостерігалися осередки дрібнота середньокрапельної жирової дистрофії, здебільшого в 3-й зоні ацинуса, навколо центральної вени (фіг. 1А). Слід також звернути увагу на велику кількість клітин у стані еозинофільної дегенерації, які були розташовані поодиноко, або групами в 2-й та 3-й зоні (фіг. 1Б). Підрахунок показав, що в 1 UA 106382 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 середньому на 100 гепатоцитів в цій групи приходилося по 34,5±13,9 таких клітин. Згідно з літературними даними, еозинофільна дегенерація, яку часто супроводжує конденсація ядерного хроматину (тільця Каунсільмена), дозволяє віднести ці клітини до числа тих, що незабаром загинуть шляхом апоптозу [11]. Отриманий нами показник досить високий у порівнянні з групою контролю та може свідчити про активність процесу. Загибель клітин шляхом апоптозу, на противагу некрозу, може пояснити мінімальну перипортальну інфільтрацію, яка переважно складалася з середніх лімфоцитів. У той же самий час, в порівнянні з контролем, де інфільтрація була відсутньою, в тому числі в області портальних трактів, незначне накопичення лімфоцитів може свідчити про початкові стадії захисної відповіді на пошкодження. Заявлений спосіб пояснюється схемами, на яких зображено: фіг. 1 - печінка щура контрольної групи: А - нормальна будова печінки, пасаж через синусоїди збережено; фарбування гематоксиліном та еозином, зб. 200Х; Б - нормальна будова печінки, ядра гепатоцитів розташовані регулярно, майже не відрізняються за розміром; фарбування за Маллорі в мод. Сліпченко, зб. 100Х; фіг. 2 - печінка щура, який отримував алкоголь (І група): А - розширення синусоїди; розсіяна мікровезикулярна жирова дистрофія, осередок середньо крапельного стеатозу; фарбування гематоксиліном та еозином, зб. 200Х; Б - групи гепатоцитів у стані еозинофільної дегенерації; фарбування гематоксиліном та еозином, зб. 100Х. Опосередкованою ознакою активності процесу при алкогольному гепатозі може бути також розширення синусоїдів. Так, у порівнянні з контролем, ми спостерігали збільшення діаметра синусоїдів від 10,55±3,32 мкм до 27,48±11,67 мкм, але статистичний аналіз не виявив достовірності розбіжностей, що пояснюється широким діапазоном значень, навіть в межах сусідніх полів зору. Застосування заявленого способу підтвердило модель алкогольного стеатогепатозу, що супроводжувалося характерними морфологічними змінами. Хронічна алкоголізація обумовлювала у щурів розвиток стеатогепатозу алкогольного генезу, який супроводжувався розширенням синусоїдів та значним підвищенням апоптотичної активності. Все це свідчить про працеспроможність даної методики і дає можливість застосовувати її для вивчення патогенетичних механізмів та впливу лікарських засобів на стан гепатоцитів. Заявлений спосіб має суттєві відмінні ознаки у порівнянні з прототипом, які разом із вже відомими, дозволять досягнути технічний результат: запропонувати модель алкогольного стеатогепатозу, яка потребує меншого часу та менш затратна. Джерела інформації: 1. Зінчук О.М., Пасічна І.О. Значення стеатогепатозу у патології людини // Гепатологія. 2009. - № 1. - С. 28-35. 2. Особенности фосфолипидного состава мембран еритроцитов в условиях постинфактного кардиосклероза /Т.Ю. Реброва [и др.] // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - Том 26. - № 11. - Выпуск 1 - С. 131-134. 3. Кешилева Р. Характер липидно-фосфолипидных нарушений у больных псориазом / Р.К. Кешилева, А.Б. Рахматов // Український журнал дерматології, венерології, косметології. - 2010. № 2 (37). - С. 51-56. 4. Phospholipidomic identification of potential plasma biomarkers associated with type 2 diabetes mellitusand diabeticnephropathy, Chao Zhu, Qiong-lin Liang, Ping Hu, Yi-mingWang, Guo-an Luo // Talanta. - 2011. 5. Заболотна І.В. Морфологічна перебудова печінки зрілих щурів при гіпергідратаційних порушеннях водно-сольового обміну організму // Вісник морфологі - 2009. - № 15 (2). - С. 260263. 6. Crawford J.M. Histologic findings in alcoholic liver disease / Crawford JM //Clin Liver Dis. 2012. - № 16. - P. 699-716. 7. Морфофункциональные изменения соеденительной ткани у крыс с экспериментальной патологией печени, вызванной интрагастральным и интраперитонетальным введением тетрахлорметана / С.Б. Павлов [и др.] //Теоретична і експериментальна медицина. - 2010. № 4(49). - С. 21-24. 8. Токсикокинетическое взаимодействие этилового и метилового спиртов в организме белых мышей /Н.Я. Головенко [и др.] // Современные проблемы токсикологии. - 2008. - №1. - С. 32-36. 2 UA 106382 U 5 9. Бовт В.Д. Вивчення алкогольної мотивації зі змінами вмісту цинку в гіпокампа / Фізіол. журнал., 2001. - Т. 47. - № 3. 10. Прерывистая алкоголизация и печень: свободнорадикальный гомеостаз, оксид азота, адаптационные механизмы, Д.А. Мискевич, А.Н. Бородинский, Н.Э. Петушок, О.В. Коноваленко, В.В. Лелевич. - Биомедицинская химия. - 2006. - Том 52, вып. 5. - С. 489-495. 11. Guicciardi Μ.Ε. Apoptosis: a mechanism of acute and chronic liver injury /M.E. Guicciardi, G.J. Gores // Gut. 2005. - № 54(7). - P.1024-1033. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб моделювання алкогольного стеатогепатозу в експерименті на лабораторних тваринах, що включає введення водного розчину етанолу, який відрізняється тим, що спочатку водний розчин етанолу вводять внутрішньочеревно в наркотичній дозі, а потім для попередження самореабілітації тварин переводять на напівпримусову алкоголізацію за допомогою етанолвмісного єдиного джерела питва. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3