Спосіб кріогенного збереження фрагментів пуповини людини

Реферат: Спосіб кріогенного збереження фрагментів пуповини людини, який передбачає розміщення фрагментів пуповини у суміші поживного середовища (для культивування клітин) та кріопротектора - диметилсульфоксиду, з подальшим поступовим охолодженням одержаної суміші аж до температури її замороження. Як поживне середовище використовують DMEM/F12 та аутологічну плазму, причому співвідношення диметилсульфоксиду, DMEM/F12 та аутологічної плазми складає, мас. %: 20:30:50, а перед подальшим кріозбереженням, яке виконують при -196 °C, поступово знижують температуру до -80 °C. UA 107296 U (12) UA 107296 U UA 107296 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до кріобіології та регенеративної медицини і може бути використана для оптимізації зберігання зразків пуповини за низьких температур з метою подальшого отримання та культивування клітин. Одною із сучасних та найбільш актуальних проблем клітинної біології та регенеративної медицини є оптимізація способів підготовки до застосування мезенхімальних стовбурових клітин (МСК). Ці клітини можуть застосовуватись для лікування багатьох захворювань опорнорухового апарату, аутоімунних розладах та для відновлення функцій різних органів [1]. МСК належать до мультипотентних клітин, що здатні впливати на пошкоджені тканини як прямим шляхом заміщення клітин, так і виділяючи специфічні сигнальні молекули, що впливають на мікрооточення. МСК мають фібробластоподібну форму у культурі, прикріплюються до пластику, експресують певний набір поверхневих маркерів (основні позитивні CD73, CD90, CD105 та негативний CD34) та здатні диференціюватись у хондроцити, остеоцити та адипоцити під впливом індукуючих факторів [2]. Пуповина, як джерело стовбурових клітин, є більш оптимальним та доступним, аніж кістковий мозок та інші відомі джерела, адже не викликає етичних протиріч та не потребує інвазивного втручання в організм [3]. Однак можливість отримати клітини з пуповини для аутологічного застосування надається лише один раз - при народженні. Тому окрім власне отримання та культивування клітин постає питання найбільш безпечного та ефективного кріогенного збереження тканини пуповини людини. На даний час широкого застосування набуло зберігання тканини пуповини у кріобанках з метою отримання життєздатних клітин, що відловідають ознакам МСК [3-7]. Однак єдиної думки з приводу підбору оптимальних умов та стандартизованих рекомендацій досі не існує. Із відміченого вище випливає, що фрагменти тканини пуповини являють собою цінність і їх ефективне кріогенне збереження особливо важливе з метою подальшого отримання та застосування МСК, що здатні відновлювати пошкоджені тканини організму. Слід зауважити, що під час кріогенного зберігання надзвичайно важливим є збереження життєздатності клітин та їхніх функціональних властивостей, що притаманні МСК. На цей час існує декілька способів кріозбереження тканини пуповини людини, вони всі пов'язані з застосуванням кріопротекторів та додаткових речовин, однак жоден не дозволяє зберегти всі властивості МСК, використовуючи економічно доцільний та безпечний спосіб. Так, зазвичай, при збереженні тканини пуповини застосовують бичачу сироватку, яка може бути джерелом різноманітних інфекцій, а також є досить дорогим реактивом, або сироватку крові людини, отримання якої пов'язано з додатковими методичними складностями. Застосовують і інші складові та підходи, що потребують тривалого часу. При збереженні фрагментів сполучної тканини пуповини повинен бути дотриманий принцип максимального збереження властивостей та життєздатності клітин, процедура має бути економічно виправданою та простою у виконанні. На цей час найближчим аналогом корисної моделі, що заявляється, є патент US 8703411 В2, кл. C12N5/071, A01N1/02, публ. 22.04.2014 р. Відомий спосіб кріогенного збереження пуповини полягає у збереженні подрібнених не більше ніж до 2 мм фрагментів тканини пуповини. Вказаний спосіб передбачає вміщення подрібнених фрагментів пуповини у середовище, яке містить кріопротектор та джерело білкових факторів. Як кріопротектор використовують диметилсульфоксид та декстран, а білок пропонується отримувати з сироватки кордової крові або використовувати як джерело білка альбумін. Варіанти співвідношень запропонованих компонентів зазначаються наступні: сироватка кордової крові 30-50 % або альбумін 2.5-25 %; диметилсульфоксид 5.5-55 %; декстран 0.5-5 %. Також зазначається, що як джерело білка може застосовуватись фракція плазматичних білків, бичача сироватка, а як кріопротектор - гліцерол, етилен гліколь чи пропілен гліколь. Показано, що різні комбінації цих речовин можуть бути застосовані для кріогенного збереження пуповини. Однак, вказується, що перед проведенням заморожування необхідно витримати фрагменти пуповини у середовищі для кріогенного заморожування протягом не менш ніж 20 та не більш ніж 40 хвилин за зниженої температури від 0 до 10 °C, застосовуючи спеціальний прилад для перемішування - шейкер. Після цього одразу матеріал вміщується в умови наднизьких температур рідкого азоту -196 °C. Автори зазначають, що хімічні компоненти, що використовуються в процесі кріозбереження пуповини, забезпечують запобігання цитотоксичності та пошкоджень спричинених низькими температурами. Недоліком відомого рішення є технологічна складність його здійснення, пов'язана, в першу чергу, з додатковою тривалою інкубацією у розчині кріопротектора, що може призвести до пошкодження клітин; отриманням сироватки з кордової крові та застосуванням додаткових компонентів, що збільшує собівартість процедури. Окрім цього потрібно застосовувати прилад для перемішування тканин - шейкер. Також пропонується подрібнювати тканину пуповини до 1 UA 107296 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагментів розміром не більше 2 мм, що потребує додаткового набору інструментів та витрат часу. Важливим недоліком також є відсутність перехідного температурного етапу між температурою вище 0 °C та наднизькою температурою рідкого азоту -196 °C, що може спричинити значне зниження життєздатності клітин. Задачею цієї корисної моделі є вдосконалення рішення, що заявляється, шляхом використання особливих умов кріозбереження сполучної тканини пуповини, у тому числі - клітин у її складі, що забезпечує низьку собівартість процедури, її високу ефективність, швидкість виконання і безпечність для наступних маніпуляцій (культивування та подальше застосування клітин у регенеративній медицині). Поставлена задача вирішується тим, що спосіб кріогенного збереження фрагментів пуповини людини передбачає розміщення підготованих фрагментів пуповини в суміші поживного середовища (для культивування клітин) та кріопротектора - диметилсульфоксиду, з подальшим поступовим охолодженням одержаної суміші аж до температури її замороження, який відрізняється тим, що як поживне середовище використовують DMEM/F12 та аутологічну плазму (як джерело ростових факторів), причому співвідношення диметилсульфоксиду, DMEM/F12 та аутологічної плазми складає, мас. %: 20: 30: 50, а перед подальшим кріозбереженням, яке виконують при -196 °C, поступово знижують температуру до -80 °C. Такий склад було вибрано шляхом аналізу існуючих способів та підбору формули, що забезпечує, по-перше, максимальне виживання клітин після розморожування та, по-друге, безпеку при подальшому застосуванні отриманого матеріалу у терапії. Авторами технічного рішення, що заявляється, також показано, що сполучна тканина пуповини є оптимальним джерелом життєздатних МСК. Але властивості цих клітин повинні бути збережені від моменту народження до часу їх застосування, шляхом культивування та використання у клітинній терапії. Запропоновані умови кріозбереження тканини пуповини, які передбачають витримку її фрагментів у суміші диметилсульфоксиду, який виконує роль кріопротектора, DMEM/F12 та аутологічної плазми, які призначені для культивування клітин та для їх росту, відповідно. Співвідношення вказаних компонентів в повній мірі відповідають результату, що досягається. Слід відмітити, що поступовий процес охолодження, а потім заморожування пуповини у вказаному вище середовищі сприяє оптимальним процесам культивування і росту клітин, що є визначальним фактором у кріозбереженні тканини пуповини. Витримування пуповини при температурі -196 °C (температура рідкого азоту) не викликає негативних або шкідливих ефектів та дозволяє зберігати пуповину максимально тривалий час, а попереднє поступове зниження температури у програмному заморожувані оптимально готує клітини до такого глибокого заморожування. Для здійснення контролю якості пуповини перед і після кріозбереження авторами були виконані наступні дослідження. Життєздатність клітин пуповини показана шляхом порівняльного культивування фрагментів, що підлягали кріогенному зберіганню, та свіжоотриманої пуповини за стандартною методикою [8]. Отримані з усіх зразків (n=8) клітини характеризувались типовою фібробластоподібною морфологією, були здатні до активної проліферації та демонстрували високі рівні експресії поверхневих маркерів CD73, CD90, CD105, що є обов'язковою ознакою мезенхімальних клітин. Експресія поверхневих маркерів оцінюється за допомогою проточного цитофлюориметра BD FACS Aria. Культури, отримані із свіжих та заморожених фрагментів пуповини не мали морфологічних відмінностей та характеризувались швидким прикріпленням до пластику, веретеноподібною формою. Більше того, вихід клітин з тканинних експлантів відбувався на 2426 годин швидше, аніж із свіжого матеріалу. Клітини мали 1-2 світлих ядра з кількома ядерцями. Середні значення рівнів експресії поверхневих маркерів були наступні: CD73+ (80 % популяції клітин, отриманих із свіжих зразків, та 81 % популяції клітин, отриманих з тканини після замороження); CD90+ (97 % популяції клітин, отриманих із свіжих зразків, та 95 % популяції клітин, отриманих з тканини після замороження), CD105+ (92 % популяції клітин, отриманих із свіжих зразків, та 90 % популяції клітин, отриманих з тканини після замороження). Середня 6 кількість фібробластоподібних клітин отриманих на 1 пасажі із 10 см свіжого зразка: 4,7×10 , із 6 10 см розмороженого: 4,5×10 , що демонструє високу ефективність запропонованого способу кріозбереження. Корисна модель пояснюється прикладом конкретного виконання способу, що заявляється. Приклад Після отримання зразка пуповини (10-15 см довжиною) його обробляють за стерильних умов (у ламінарному боксі), нарізають на фрагменти близько 1 см та вміщують у кріоємності, що містять підготовлене середовище для кріозбереження. Середовище для кріозбереження 2 UA 107296 U 5 10 15 20 25 30 35 40 складається з наступних компонентів: кріопротектор - диметилсульфоксид (DMSO), поживне середовище для культивування клітин DMEM/F12 та компонент, що містить ростові фактори (аутологічна плазма) у співвідношенні, мас. %: 20: 30: 50. Таке співвідношення дозволяє забезпечити клітинам найбільш близькі до фізіологічних умови без застосування ксеногенних (тваринних) компонентів та дорогих додатків. Середовище готують безпосередньо перед обробкою пуповини у стерильних умовах. Дана композиція дозволяє залишити клітини у складі тканини пуповини життєздатними. Це доведено шляхом культивування клітин. Кріопробірки з фрагментами пуповини вміщують у металеву стійку для зразків. Після цього зразки переносять у пристрій для програмного заморожування тканин PlanerCryo-516. Зразки підлягають заморожуванню за автоматизованою програмою, що виконує поступове зниження температури з +18 °C до -80 °C, після цього металеву стійку вміщують у судину Дьюара, наповнену рідким азотом, що підтримує температуру -196 °C. Таким чином, спосіб, що заявляється, характеризується такою сукупністю дій та прийомів кріозбереження, які визначають високу ефективність й надійність наступних маніпуляцій з метою отримання клітин, зокрема, мезенхімальних. Джерела інформації: 1. Squillaro T, Peluso G, Galderisi U. Clinical Trials with Mesenchymal Stem Cells: An Update. Cell transplantation. 2015 Sep. 2. Dominici M, LeBlanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Krause DS, Deans RJ, Keating A, Prockop DJ, Horwitz EM. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006 Jan 1;8(4):315-7. 3. Kalaszczynska I, Ferdyn K. Wharton's Jelly Derived Mesenchymal Stem Cells: Future of Regenerative Medicine? Recent Findings and Clinical Significance. Bio Med research international. 2015 Mar 15; 2015. 4. Naaldijk Y, Federova V, Stolzing A. Cryopreservation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in complex sugar based cryoprotective solutions. J of Biotech, ISSN. 2013:0976-7045. 5. Yong KW, Wan Safwani WK, Xu F, Wan Abas WA, Choi JR, Pingguan-Murphy B. Cryopreservation of Human Mesenchymal Stem Cells for Clinical Applications: Current Methods and Challenges. Biopreservation and biobanking. 2015 Aug 1; 13(4):231-9. 6. Dulugiac M, Moldovan L, Zarnescu O. Comparative studies of mesenchymal stem cells derived from different cord tissue compartments-The influence of cryopreservation and growth media. Placenta. 2015 Oct 31; 36 (10): 1192-203. 7. Anzalone R, Farina F, Zummo G, La Rocca G. Recent patents and advances on isolation and cellular therapy applications of mesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton's jelly. Recent Patents on Regenerative Medicine. 2011 Sep 1; 1(3):216-27. 8. Maslova OO, Shuvalova NS, Sukhorada OM, Zhukova SM, Deryabina OG, Makarenko MV, Govseiev DO, Kordium VA. Heterogeneity of umbilical cords as a source for mesenchymal stem cells. Dataset Papers in Science. 2012 Aug 9; 2013. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Спосіб кріогенного збереження фрагментів пуповини людини, який передбачає розміщення фрагментів пуповини у суміші поживного середовища (для культивування клітин) та кріопротектора - диметилсульфоксиду, з подальшим поступовим охолодженням одержаної суміші аж до температури її замороження, який відрізняється тим, що як поживне середовище використовують DMEM/F12 та аутологічну плазму, причому співвідношення диметилсульфоксиду, DMEM/F12 та аутологічної плазми складає, мас. %: 20:30:50, а перед подальшим кріозбереженням, яке виконують при -196 °C, поступово знижують температуру до 80 °C. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3