Спосіб отримання мезенхімальних стовбурових клітин з матриксу пуповини людини

Реферат: Спосіб отримання мезенхімальних стовбурових клітин матриксу пуповини включає підбір умов отримання клітин. Проводять попередню органометричну оцінку кожної пуповини: вимірюють товщину (діаметр) даного фрагмента пуповини, розраховують площу перерізу судин та визначають коефіцієнт стромально-судинного співвідношення за формулою. UA 74171 U (12) UA 74171 U UA 74171 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до клітинної терапії та регенеративної медицині і може бути використана для оптимізації отримання клітин матриксу пуповини з метою їх подальшого культивування. Сучасні способи ізолювання мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) з матриксу пуповини поділяються на три групи: ензиматичний, механічний та комбінований. І у кожного з названих є модифікації. Найпоширенішим варіантом ензиматичного способу отримання МСК є інкубація пуповини у ферментах: колагеназі та гіалуронідазі, інколи з використанням трипсину [1]. Способи, що пропонуються, відрізняються один від одного як за типами ферментів, що використовуються, так і за часом інкубації у них. Проте, не з усіх пуповин дані ферментативні способи дозволяють отримувати велику кількість клітин, що здатні швидко проліферувати у культурі. Одним із недоліків є шкідливий вплив на рецептори клітин, що спричиняє зниження стовбурових властивостей. Механічний спосіб отримання МСК полягає у подрібненні зразка пуповини на невеличкі експланти [2]. Такий метод менш шкідливий для рецепторів клітин, проте він дозволяє отримати клітини матриксу пуповини через довший проміжок часу, ніж ферментативні методи. Трапляються пуповини, з яких не вдається отримати клітини, застосовуючи лише механічний спосіб. Існують і поєднання цих методів. Комбіновані методи спрямовані на покращення якості та підвищення кількості отриманих клітин з матриксу пуповини. Однак, у жодному джерелі інформації не описується необхідність підбору конкретного співвідношення ферментативного та механічного способів у залежності від особливостей конкретної пуповини. Таким чином, основним недоліком даних способів є недостатня індивідуалізація процесу отримання клітин, оскільки кожен з них використовують для усіх без винятку пуповин, не враховуючи їх морфологічних особливостей, що призводить до зниження ефективності отримання культур. Питання підбору індивідуалізованих методичних підходів до кожного зразка пуповини не розглядалось у жодному з відомих інформаційних джерел, відповідно, як прототип даної корисної моделі взятий збірний опис відомих методичних підходів [1-4]. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб отримання МСК з пуповини шляхом оцінки її органометричних характеристик, що дозволить підвищити ефективність отримання клітин з різних типів пуповин, підвищити кількість клітин, які здатні самопідтримуватись у культурі, знизити шкідливий вплив на клітини. Поставлена задача вирішується тим, що в способі, який включає підбір умов отримання клітин, згідно з даною корисною моделлю, проводять попередню органометричну оцінку кожної пуповини: вимірюють товщину (діаметр) даного фрагмента пуповини, розраховують площу перерізу судин та визначають коефіцієнт стромально-судинного співвідношення за формулою Kccc=Scтp./Sсуд., де Sстр. - площа строми (матриксу пуповини), Sсуд. - сумарна площа судин, і при значеннях Кссс 6±0,5 використовують механічний спосіб, при значеннях К ссс 5±0,5 механічний та/або ферментативний, при значеннях Кссс 3±1- ферментативний. До даного рішення автори прийшли, досліджуючи різні способи отримання клітин пуповини з урахуванням органометричних показників пуповини. Виявлено, що кожен із запропонованих раніше способів дозволяє отримати максимальну кількість клітин лише з окремої групи пуповин. Тобто кожен органометричний тип пуповини потребує вибирання оптимального способу. Спосіб виконується наступним чином. Після отримання фрагмента пуповини з пологового будинку, проводять оцінку його органометричних характеристик: вимірюють товщину (діаметр) даного фрагмента пуповини. Перевіряють кількість судин - у нормі їх 3: дві артерії та вена. Вимірюють сумарну площу перерізу судин та вираховують площу перерізу строми за загальноприйнятою формулою 2 2 S=r = (d/2) . Оцінюють коефіцієнт стромально-судинного співвідношення за формулою Kccc=Scтp./Scyд., де Scтp. - площа строми (матриксу пуповини), a Scyд. - сумарна площа судин. При отриманих значеннях Кссс 6±0,5 вважається високим, що свідчить про переважання стромального компонента, часто більш пухку структуру або набряк, що призводить до незручностей при отриманні клітин за допомогою ферментів, тому оптимальним для отримання клітин є механічний шлях. При значеннях Кссс 5±0,5 вважається середнім, що притаманно пуповинам з найбільш придатною для отримання клітин структурою: їх легко різати на експланти та зручно працювати з ферментами. При значеннях Кссс 3±1 вважається низьким, що властиво для тонких, жорстких пуповин, клітини з яких найзручніше отримувати ферментативним шляхом. 1 UA 74171 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Відмічають будь-які відхилення від норми: наявність кіст, гематом, вузлів, аномальних утворень. Враховують всі вказані особливості даної пуповини та вибирають шлях її подальшої обробки. Приклад. Отримано фрагмент пуповини. Проведено її первинну оцінку: судини у нормі, діаметр перерізу - 1,5 см. Прийнявши умовно форму перерізу за коло, розраховуємо площу перерізу за 2 2 2 стандартною формулою S=r =(d/2) = 1,77 см . Діаметр перерізів артерій становить 0,2 та 0,3 см відповідно, вени - 0,5 см. Прийнявши умовно форму судин за коло, за вищевказаною стандартною формулою вираховують площу 2 2 2 кожної судини (отримуємо 0,03 см , 0,07 см та 0,2 см відповідно). Сума цих площ складає 2 площу судин (0,3 см ). 2 Від загальної площі віднімають сумарну площу судин та отримують площу строми: 1,77 см 2 2 0,3 см =1,47 см . Для розрахунку коефіцієнта стромально-судинного співвідношення підставляємо отримані дані у формулу: Kccc=Scтp./Scyд. 2 2 Отримуємо Кссс= 1,47 см /0,3 см =4,9. Відповідно, пуповина належить до групи з середнім коефіцієнтом стромально-судинного співвідношення (5±0,5), що означає, що для неї оптимальним є комбінований шлях обробки: Фрагмент пуповини розрізається скальпелем або ножицями на дві рівні частини. З обох частин видаляються судини. Одна з частин подрібнюється ножицями на фрагменти 0,3-0,7 см (експланти) та вміщується у культуральний посуд з поживним середовищем. Через 7-28 днів очікується отримати з експлантів клітини. Друга частина подрібнюється ножицями на фрагменти 0,5-1 см та вміщується у суміш 1 % розчинів колагенази та гіалуронідази на 75 хв. Після інкубації з ферментами, розчин відбирається та двічі центрифугується з метою відмивання клітини. Осад висівається у культуральний посуд з поживним середовищем. Через 3-7 днів очікується отримання клітини. Таким чином, спосіб дозволяє отримати МСК з більшості пуповин, а підбір індивідуального методу обробки знижує вірогідність пошкодження клітин під час їх виділення. Джерела інформації: 1. Isolation of mesenchymal stem cells using the total length of umbilical cord for transplantation purposes / N.Tsagias, I.Koliakos, V.Karagiannis [et al.] // Transfusion Medicine. -2011. - Vol. 21. - P. 253-261. 2. Meuleman N., Pieters K., Stamatopoulos B., Delforge A., Bron D., Lagneaux L. A rapid, simple, and reproducible method for the isolation of mesenchymal stromal cells from Wharton's jelly without enzymatic treatment / С. De Bruyn, M.Najar, G.Raicevic [et al.] // Stem Cells Dev. - 2011. - Vol. 20(3). - P:547-557. 3. Koliakos I. Mesenchymal cells isolation from Wharton's jelly, in perspective to clinical applications / I.Koliakos, N.Tsagias, V.Karagiannis // Journal of Biological Research-Thessaloniki. 2011. – Vol. 16. - P. 194-201 4. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combinat on enzymatic and mechanical disassociation method / C.K.Tong, S.Vellasamy, B.C.Tan [et al.] // Cell Biology International. - 2011. - Vol. 35. - P: 221-226. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання мезенхімальних стовбурових клітин матриксу пуповини, що включає підбір умов отримання клітин, який відрізняється тим, що проводять попередню органометричну оцінку кожної пуповини: вимірюють товщину (діаметр) даного фрагмента пуповини, розраховують площу перерізу судин та визначають коефіцієнт стромально-судинного співвідношення за формулою Kccc=Scтp./Scyд., де Scтр. - площа строми (матриксу пуповини), Scyд. - сумарна площа судин, і при значеннях Кссс 6±0,5 використовують механічний спосіб, при значеннях Кссс 5±0,5 - механічний та/або ферментативний, при значеннях Кссс 3±1 ферментативний. 55 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2