Спосіб гістологічного дослідження матеріалу пункційної біопсії нирки

Реферат: Спосіб гістологічного дослідження матеріалу пункційної біопсії нирки включає стандартне гістологічне дослідження. В якому для світлооптичного й імунофлюоресцентного досліджень отримують по 10 маркірованих гістологічних препаратів, кожен з яких містить по 2 ряди наскрізно змонтованих серійних парафінових зрізів для світлової або 2 і більше рядів заморожених зрізів для імунофлюоресцентної мікроскопії, вимірюють діаметр найбільшого ниркового тільця в досліджуваному матеріалі, визначають граничний інтервал між серійними зрізами або розраховують граничну кількість серійних зрізів, підраховують кількість клубочків у парі гістологічних зрізів з максимальною кількістю клубочків, які відокремлені граничним інтервалом або граничною кількістю серійних зрізів, додають одне до одного і отримують фактичну кількість клубочків в гістологічних препаратах, оцінюють гломерулярні зміни та співвідносять кількість клубочків з наявними змінами із загальною кількістю клубочків в біоптаті, визначаючи у такий спосіб їх відносні показники, які зазначають у патогістологічному висновку. UA 107408 U (54) СПОСІБ ГІСТОЛОГІЧНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ МАТЕРІАЛУ ПУНКЦІЙНОЇ БІОПСІЇ НИРКИ UA 107408 U UA 107408 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до патологічної анатомії, та може бути використаний для підвищення ефективності патоморфологічного дослідження матеріалу пункційної біопсії нирки, зокрема при гломерулярних хворобах. Нефробіопсійне дослідження при гломерулярних хворобах повинно забезпечувати точну морфологічну діагностику, що досягається використанням комплексу гістохімічних, імуногістохімічних та електронно-мікроскопічного методів. Важливою складовою дослідження є кількісна оцінка наявних змін, з якими тісно пов'язаний прогноз хвороби. Існує чималий резерв щодо удосконалення підходів до кількісної оцінки нефробіоптату, зокрема шляхом модифікації рутинного світлооптичного та імунофлюоресцентного дослідження нефробіопсійного матеріалу. Відомий спосіб патоморфологічного дослідження нефробіопсійного матеріалу з використанням світлооптичного, імунофлюоресцентного й електронно-мікроскопічного методів (1), в якому пропонують використовувати серійні парафінові зрізи завтовшки 2 мкм для світлової мікроскопії та серійні кріостатні зрізи завтовшки 2-4 мкм для імунофлюоресцентного дослідження. Основним недоліком відомого способу є невизначеність щодо стандартної кількості серійних зрізів, які необхідно отримати для забезпечення адекватного світлооптичного та імунофлюоресцентного дослідження. Відомий також спосіб біопсії нирок (2), який вибрано за найближчий аналог, в якому пропонують при стандартному гістологічному дослідженні для світлової мікроскопії монтувати до 4-х серійних парафінових зрізів завтовшки 2-3 мкм на 10-15 предметних скелець та серійні заморожені зрізи завтовшки 2-4 мкм для імунофлюоресцентного дослідження (в кількості, достатній для визначення щонайменше 9-ти маркерів). Недоліком цього способу є неврахування просторової організації ниркових тілець при монтажі серійних парафінових та заморожених зрізів нефробіопсійного матеріалу на предметні скельця, що призводить до заниження фактичної кількості клубочків при дослідженні методами світлової та імунофлюоресцентної мікроскопії. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб монтажу серійних парафінових і заморожених зрізів нефробіопсійного матеріалу для світлової та імунофлюоресцентної мікроскопії шляхом встановлення граничного Інтервалу між серійними зрізами або граничної кількості серійних зрізів, протягом якої площина зрізу заглиблюється у досліджуваному матеріалі на величину максимального діаметра ниркового тільця, що дозволяє змінити спосіб підрахунку клубочків в нефробіоптаті та дає можливість обґрунтовано оперувати більшою кількістю досліджених клубочків. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб гістологічного дослідження матеріалу пункційної біопсії нирки, що включає стандартне гістологічне дослідження, в якому згідно з корисною моделлю, для світлооптичного й імунофлюоресцентного досліджень отримують по 10 маркірованих гістологічних препаратів, кожен з яких містить по 2 ряди наскрізно змонтованих серійних парафінових зрізів для світлової або 2 і більше рядів заморожених зрізів для імунофлюоресцентної мікроскопії, вимірюють діаметр найбільшого ниркового тільця в досліджуваному матеріалі, визначають граничний інтервал між серійними зрізами або розраховують граничну кількість серійних зрізів, підраховують кількість клубочків у парі гістологічних зрізів з максимальною кількістю клубочків, які відокремлені граничним інтервалом або граничною кількістю серійних зрізів, додають одне до одного і отримують фактичну кількість клубочків в гістологічних препаратах, оцінюють гломерулярні зміни та співвідносять кількість клубочків з наявними змінами із загальною кількістю клубочків в біоптаті, визначаючи у такий спосіб їх відносні показники, які зазначають у патогістологічному висновку. Спосіб здійснюють наступним чином: нефробіопсїйний матеріал для світлооптичного дослідження фіксують у 10 % розчині нейтрального забуференого формаліну, зневоднюють в етанолі або ізопропанолі зростаючої концентрації та заливають у парафін, за допомогою ротаційного мікротома отримують до 10-ти серійних парафінових зрізів по 2, 3 та 5 мкм (менша товщина зрізів - більша серія), які монтують послідовно на 10-ти маркірованих предметних скельцях, зазначаючи порядковий номер скельця, товщину зрізів або їх сумарну товщину, після закінчення монтажу першого ряду зрізів на останньому склі зазначають сумарну товщину всіх серійних зрізів цього ряду (так само вчиняють по закінченні монтажу другого ряду). В разі значної кількості зіпсованих зрізів, які не підлягають монтажу, сумарну товщину слід зазначати на кожному склі. Парафінові зрізи завтовшки 3 мкм використовують для забарвлення гематоксиліном і еозином, трихромом та реакції Шиффа, 5 мкм - конго червоним, 2 мкм імпрегнації сріблом за Джонсом, можна забарвлювати кожне парне або непарне предметне скло, а решту - за необхідності або для проведення імуногістохімічних досліджень. 1 UA 107408 U 5 10 15 20 25 30 35 Матеріал для імунофлюоресцентного дослідження відразу після біопсії заморожують, отримують до 5-ти серійних кріостатних зрізів завтовшки 4 мкм, які послідовно монтують на 10ти пронумерованих адгезивних предметних скельцях. Після закінчення монтажу першого ряду, формують другій та третій аж до повного зрізання замороженого нефробіопсійного матеріалу, по закінченні кожного ряду зрізів на останньому склі зазначають його сумарну товщину, імунофлюоресцентні дослідження виконують з антитілами до IgA, IgG, IgM, легких ланцюгів κ і λ, комплементу C1q та С3, фібриногену й альбуміну. За допомогою системи аналізу зображень або окулярної лінійки визначають діаметр найбільшого ниркового тільця в досліджуваному матеріалі, який відповідає граничному інтервалу між серійними зрізами або розраховують граничну кількість серійних зрізів як відношення значення діаметра найбільшого ниркового тільця до середньої товщини парафінових або заморожених зрізів, визначають зрізи з максимальною кількістю клубочків на кожному окремому рівні (відокремлені щонайменше одним граничним інтервалом або однією граничною кількістю серійних зрізів), підраховують кількість клубочків в них, додають одне до одного і отримують фактичну (сумарну) кількість клубочків в досліджених гістологічних препаратах, оцінюють гломерулярні зміни в кожному нирковому тільці, визначаючи патерни гломерулярного ушкодження, за необхідності пошарово прослідковуючи їх характер на серійних зрізах, та співвідносять їх кількість із загальною кількістю клубочків в біоптаті, отримуючи відносні показники. Апробація способу, що заявляється, проведена у лабораторії патоморфології ДУ „Інститут нефрології ΗАМН України" на нефробіопсійному матеріалі, отриманому від 227 пацієнтів віком від 2 до 73 років шляхом черезшкірної пункційної біопсії нирки із використанням біопсійних голок калібру 16G. Отримують по 2 стовпчики, які під контролем мікроскопа у променях відбитого світла розділяють для проведення світлооптичного, імунофлюоресцентного та електронномікроскопічного досліджень. Матеріал для світлооптичного дослідження вміщують у ємність з 10 % розчином нейтрального забуференого формаліну, імунофлюоресцентного - у вологу камеру, електронно-мікроскопічного - у ємність з 2,5 % розчином глютаральдегіду на 0,1М какодилатному буфері. Після отримання гістологічних препаратів визначають граничний інтервал між серійними зрізами та підраховували фактичну кількість клубочків на парафінових і кріостатних зрізах. Після оцінки наявних морфологічних змін, визначених з використанням світлооптичного, імунофлюоресцентного й електронно-мікроскопічного методів дослідження, оформлюють патогістологічний висновок, в якому серед іншого зазначають кількісні характеристики гломерулярних змін та розраховують відносні показники гломерулярного ушкодження із врахуванням загальної кількості клубочків в біоптаті. Результати підрахунку кількості клубочків у нефробіопсійному матеріалі показали, що застосування заявленого способу призводить до збільшення кількості оцінюваних клубочків у середньому в 1,9 і 2,1 разу на парафінових та кріостатних зрізах відповідно, дані наведені в таблиці. Таблиця Кількість клубочків у нефробіопсійному матеріалі на парафінових і кріостатних зрізах за традиційним та заявленим способом (n=227, M±s) Пацієнти Діти, n=67 Дорослі, n=160 Вік, років 12,8±4,2 (2-17) 40,4±15,3 (18-78) ПЗ 16,1±9,9 (3-37) 9,7±5,7 (1-44) Фактична кількість клубочків (оцінка за заявленим способом) ПЗ КЗ 31,4±21,2 13,4±4,8 (5-81) (2-28) 18,1±11,4 11,3±4,1 (2-72) (1-25) Кількість клубочків (традиційна оцінка) КЗ 6,0±2,2 (2-14) 5,5±1,8 (1-12) Відносне зростання ПЗ 1,89±0,33 (1,3-2,7) 1,86±0,37 (1,0-2,9) КЗ 2,23±0,41 (1,0-3,2) 2,07±0,38 (1,0-3,1) 40 45 Примітки: ПЗ - парафінові зрізи, КЗ - кріостатні зрізи, в дужках наведені мінімальне та максимальне значення. Наводимо приклад практичного здійснення заявленого способу. Приклад. Пацієнт П., і.х. № 1215, 1998 р.н., клінічний діагноз: гострий гломерулонефрит, виразний сечовий синдром без порушення функції нирок; патогістологічний висновок № 20/2014. При світлооптичному дослідженні парафінові зрізи з найбільшою кількістю клубочків містять 14 клубочків, з яких 1 - глобально склерозований, 2 - із сегментарним склерозом на 2 UA 107408 U 5 10 15 20 25 30 35 тубулярному полюсі ("tiр»-зміни). Поза граничним інтервалом від цього зрізу наступні зрізи містять максимально 12 клубочків, з яких 1 - глобально склерозований, 2 - з перихилярним склерозом, 3 - із сегментарним склерозом поза судинним або тубулярним полюсами (патерн "NOS"). Фактична кількість клубочків на парафінових зрізах: 14+12=26. При імунофлюоресцентному дослідженні кріостатні зрізи з найбільшою кількістю клубочків містять 6 клубочків, з яких 3 - із сегментарним склерозом (сегментарне світіння IgM та легких ланцюгів κ і λ), поза межами граничного інтервалу виявлені ще 4 клубочки, з яких 1 - із сегментарним склерозом. Фактична кількість клубочків на заморожених зрізах: 6+4=10. Напівтонких зрізах наявні 8 клубочків, з яких 1 - глобально склерозований, 2 - сегментарно склерозовані з "tiр»змінами. Загальна кількість клубочків у біоптаті: 26+10+8=44. Патогістологічний висновок: фокальний сегментарний гломерулосклероз, варіант "NOS". Глобально склерозованих клубочків - 3/44 (7 %), сегментарно склерозованих-13/41 (32 %). Наведений приклад показує наявність відмінностей у відносних показниках змінених клубочків: при традиційному способі оцінки в досліджуваному матеріалі кількість сегментарно склерозованих клубочків складала би 7/26 (27 %), проти фактичної- 13/41 (32 %). Таким чином, заявлений спосіб гістологічного дослідження матеріалу пункційної біопсії нирки дає можливість отримати надійнішу кількісну оцінку гломерулярних змін, порівняно з традиційним способом, при тій самій кількості отриманого нефробіопсійного матеріалу. Джерела інформації: 1. Walker P.D. Practice guidelines for the renal biopsy / P.D. Walker, T. Cavallo and S.M. Bonsib//Modern Pathology.-2004. -№17. -P. 1555-1563. 2. Walker P.D. The Renal Biopsy / P.D. Walker // Arch. Pathol. Lab. Med. -2009. - Vol.133. P.181-188. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб гістологічного дослідження матеріалу пункційної біопсії нирки, що включає стандартне гістологічне дослідження, який відрізняється тим, що для світлооптичного й імунофлюоресцентного досліджень отримують по 10 маркірованих гістологічних препаратів, кожен з яких містить по 2 ряди наскрізно змонтованих серійних парафінових зрізів для світлової або 2 і більше рядів заморожених зрізів для імунофлюоресцентної мікроскопії, вимірюють діаметр найбільшого ниркового тільця в досліджуваному матеріалі, визначають граничний інтервал між серійними зрізами або розраховують граничну кількість серійних зрізів, підраховують кількість клубочків у парі гістологічних зрізів з максимальною кількістю клубочків, які відокремлені граничним інтервалом або граничною кількістю серійних зрізів, додають одне до одного і отримують фактичну кількість клубочків в гістологічних препаратах, оцінюють гломерулярні зміни та співвідносять кількість клубочків з наявними змінами із загальною кількістю клубочків в біоптаті, визначаючи у такий спосіб їх відносні показники, які зазначають у патогістологічному висновку. 40 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3