Спосіб прогнозування рецидиву менінгіоми головного мозку

Реферат: Спосіб прогнозування рецидиву менінгіоми головного мозку шляхом проведення імуногістохімічного дослідження зразків пухлинної тканини менінгіом і визначення експресії VEGFR-1 (Flt-1) рецептора до судинно-ендотеліального фактора росту. Додатково проводять морфометричне дослідження отриманих гістологічних препаратів з використанням поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ. Якщо площа імунопозитивних ендотеліальних клітин з експресією цього рецептора складає 1,85±0,22 % і більше, то прогнозують рецидив пухлини. UA 108149 U (54) СПОСІБ ПРОГНОЗУВАННЯ РЕЦИДИВУ МЕНІНГІОМИ ГОЛОВНОГО МОЗКУ UA 108149 U UA 108149 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується медицини, а саме патологічної анатомії та нейрохірургії, і може бути використаною для визначення можливості рецидиву менінгіом головного мозку. Складність прогнозування рецидиву менінгіоми головного мозку полягає в тому, що патогенез і молекулярно-генетичні механізми пухлинної прогресії є недостатньо зрозумілими у випадку цих пухлин, не дивлячись на те, що наразі описані різноманітні хромосомні аберації, порушення сигнальних шляхів та зміни ростових факторів, які сприяють рецидиву менінгіом. Існує небагато способів прогнозування рецидиву менінгіоми головного мозку, до того ж вони недостатньо інформативні, трудомісткі, потребують значної кількості часу, наявності спеціального лабораторного устаткування та вимагають значних фінансових витрат. Найбільш близьким за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у визначенні мРНК рецептора 2-го типу до судинно-ендотеліального фактора росту VEGFR-2 (KDR/Flk-1) та рецептора 1-го типу до судинно-ендотеліального фактора росту VEGFR-1 (Fit-1) методом іnsitu гібридизації в ендотелії менінгіом. При цьому в рецидивуючих менінгіомах було виявлено достовірне підвищення експресії мРНК VEGFR-2. (Microvascularization and expression of VEGF and its receptors in recurring meningiomas: pathobiological data in favor of anti-angiogenic therapy approaches / M.Preusser, M.Hassler, P.Birner, M.Rudas, T.Acker, K.H.Plate, G.Widhalm, E.Knosp, H.Breitschopf, J.Berger, C.Marosi // Clin. Neuropathol.-2012. -V.31, №5.-P.352-360). Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі, що заявляється, є такі: проводять імуногістохімічне дослідження зразків пухлинної тканини менінгіом; визначають експресію VEGFR-1 (Fit-1) рецептора до судинно-ендотеліального фактора росту. Цей спосіб є недостатньо ефективним, оскільки має багатоступеневість виконання, досить дорогий та потребує спеціального навчання як середнього медичного персоналу, так і лікарів. Не може бути проведене повторне дослідження на тому ж матеріалі з використанням імуногістохімічного методу, оскільки матеріал поміщається у рідкий азот. Внаслідок цього спосіб не може бути запропонованим всім патогістологічним лабораторіям. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу прогнозування рецидиву менінгіоми головного мозку шляхом проведення морфометричного аналізу отриманих даних з використанням поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ, що забезпечить можливість розробки більш точних діагностичних критеріїв прогнозування рецидиву менінгіоми головного мозку для подальшого вибору лікувальної тактики та визначення прогнозу для хворих. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який полягає у проведенні імуногістохімічного дослідження зразків пухлинної тканини менінгіом і визначення експресії VEGFR-1 (Fit-1) рецептора до судинно-ендотеліального фактора росту, новим є те, що додатково проводять морфометричне дослідження отриманих гістологічних препаратів з використанням поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ і, якщо площа імунопозитивних ендотеліальних клітин з експресією цього рецептора складає 1,85±0,22 % і більше, то прогнозують рецидив пухлини. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. Враховуючи те, що неоангіогенез пов'язаний з біологічною агресивністю і несприятливим клінічним перебігом менінгіом головного мозку, в ряді досліджень показано, що ступінь кровопостачання пухлини є фактором, який визначає клінічний перебіг захворювання. Судинноендотеліальний фактор росту (VEGF) є головним регулятором патологічного ангіогенезу. В менінгіомах спостерігається поступове збільшення щільності судин мікроциркуляторного русла від пухлин, які не експресують VEGF, до тих, в яких виявляється помірна та сильна експресія цього фактора росту. Існує три тирозинкіназних рецептори до VEGF (VEGFR1-3),але VEGFA зв'язується лише з VEGFR1 (FLTj) та VEGFR2 (KDR), і більшість сигнальних шляхів опосередкована останніми двома. VEGFR1 має найвищу константою зв'язування з VEGF-A. Вважають, що розчинний екстраклітинний фрагмент sVEGFRl переважно виконує функцію фізіологічного інгібітора VEGF, яка здійснюється шляхом зв'язування ліганду без проведення внутрішньоклітинного сигналу, функціонуючи подібно пастці. Не дивлячись на зменшену кіназну активність, VEGFR1 може проводити внутрішньоклітинний сигнал при взаємодії з лігандом. Крім того, VEGFR1 приймає участь в пухлинній прогресії, активуючи клітинну міграцію та інвазію деяких ліній пухлинних клітин через цитоплазматичну Scr-кіназу та ERK1/2. В пухлинах з гіперекспресією VEGFR-1 спостерігається збільшення новоутворених мікросудин. Використання поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ дозволяє отримати більш достовірні дані, що збільшує об'єктивність дослідження; 1 UA 108149 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виконувати морфометричні дослідження без застосування спеціального лабораторного обладнання та необхідності у дорогому устаткуванні. Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних ознак дозволить підвищити достовірність та точність прогнозування рецидиву менінгіоми головного мозку та удосконалити спосіб визначення виразності неоангіогенезу при проведенні патогістологічного дослідження тканини менінгіоми, що дозволить визначити подальшу правильну лікувальну тактику та прогноз для хворих. Спосіб здійснюють таким чином. Під час нейрохірургічного втручання отримували шматочки тканини менінгіоми, біоптати фіксували в 10 % нейтральному забуференому формаліні. Після традиційного виготовлення парафінових блоків на санному мікротомі робили зрізи товщиною 4 мкм і фарбували препарати гематоксиліном та еозином. За допомогою світлової мікроскопії встановлювали гістологічний варіант менінгіоми та ступінь злоякісності за критеріями ВОЗ (2007). Визначали основні патогістологічні зміни, характерні для злоякісних менінгіом, а саме оцінювалася наявність і кількість мітозів, вогнища некрозу, розшаровуючий ріст, клітини зі збільшеним ядерноцитоплазматичним співвідношенням та клітини з везикулярними ядрами. Для імуногістохімічного дослідження в депарафінованих зрізах проводили демаскування антигенів у цитратному буфері на водяній бані протягом 20 хвилин та непрямим імунопероксидазним методом визначали експресію VEGFR-1 з використанням моноклональних антитіл до рецептора 1-го типу до судинно-ендотеліального фактора росту Mo a-Hu Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1(VEGFR-1), Clone FLT-1 і системи візуалізації DAKO EnVision+ (Данія) з діамінобензидином. Зрізи дофарбовували гематоксиліном Майєра та поміщали у бальзам. Для морфометричних вимірювань фотографували 5 полів зору з наявною експресією VEGFR-1 в одному випадку менінгіоми. З використанням поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ (розробка ініційована автором Wayne Rasband в Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA) в отриманих зображеннях шляхом багаторазового вимірювання оптичної щільності зон експресії VEGFR-1в зображенні досягався статистичний достовірний поріг чутливості. З урахуванням цього порога цифрове зображення переводилось у розряд бінарного. Потім визначали площу імунопозитивних ендотеліальних клітин в тканині менінгіоми головного мозку, яка являла собою відсоткове співвідношення числа пікселів цифрового зображення, що відповідають VEGFR-1позитивним клітинам до числа всіх пікселів у зображенні. Результати оцінювали наступним чином: якщо площа імунопозитивних ендотеліальних клітин складала 1,85±0,22 % і більше, то прогнозували рецидив пухлини. Приклад 1. Хворий Ф., 1966 р.н., звернувся в лікарню зі скаргами на тупий ниючий головний біль в тім'яній ділянці, переважно в нічні та ранішні години, судоми 2 рази на тиждень, нудоту, в умовах нейрохірургічного відділення Запорізької обласної клінічної лікарні було діагностовано конвекситальну пухлину правої тім'яної долі. 24.01.2012 р. хворому було виконано макроскопічно повне видалення пухлини з коагуляцією твердої мозкової оболонки в місці вихідного росту (тип 2 за модифікованою шкалою Сімпсона, 1957) та отримані шматочки тканини менінгіоми головного мозку. Після проведення традиційного гістологічного дослідження встановлений діагноз: "Анапластична менінгіома з поширеними полями некрозу". Після проведення імуногістохімічного дослідження виявлена виражена ендотеліальна експресія VEGFR-1 в мікросудинах менінгіоми. Далі фотографували 5 полів зору з наявною експресією VEGFR-1 в зразку пухлини та з використанням медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ в отриманих зображеннях проводилося вимірювання співвідношення числа пікселів "чорного" кольору, що в даному випадку відповідало площі VEGFR-1-позитивних ендотеліальних клітин до пікселів "білого" кольору. У даному зображенні "чорних" пікселів - 97400, "білих" - 2065575. Всього зображення складено з 2162975 пікселів. Розрахунок відсотка VEGFR-1 - позитивних клітин, виконують обчисленням частки від ділення числа "чорних" пікселів на загальне число пікселів в зображенні - 97400/2162975* 100 % = 4,5 %. Середнє значення площі VEGFR-1 - позитивних ендотеліальних клітин визначене в 5 полях зору з наявною експресією VEGFR-1 в тканині менінгіоми дорівнювало 3,64 %, що відповідає критеріям рецидивуючої менінгіоми. В подальшому хворий через рік звернувся зі скаргами на прогресивне порушення самопочуття. Був діагностований рецидив пухлини, проведено повторне оперативне втручання. Приклад 2. Хвора Б, 1975 р.н., звернулася в лікарню зі скаргами на тупий ниючий головний біль в лівій лобній ділянці, переважно в нічні години, слабкість у правій верхній кінцівці, нудоту. В умовах нейрохірургічного відділення Запорізької обласної клінічної лікарні було діагностовано конвекситальну пухлину лівої лобної долі. 15.02.2013 р. хворій було виконано макроскопічно 2 UA 108149 U 5 10 15 повне видалення пухлини з висіченням твердої мозкової оболонки та резекцією ураженої кістки (тип 1 за модифікованою шкалою Сімпсона, 1957) та отримані шматочки тканини менінгіоми головного мозку. Після проведення традиційного гістологічного дослідження встановлений діагноз: "Доброякісна менінгіома (grade І), перехідний варіант". Після проведення імуногістохімічного дослідження виявлена помірна та слабка ендотеліальна експресія VEGFR-1 в мікросудинах менінгіоми. Далі фотографували 5 полів зору з наявною експресією VEGFR-1 в зразку пухлини та з використанням медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ в отриманих зображеннях проводилося вимірювання співвідношення числа пікселів "чорного" кольору, що в даному випадку відповідало площі VEGFR-1-позитивних ендотеліальних клітин до пікселів "білого" кольору. У даному зображенні "чорних" пікселів 22469, "білих" -2140506. Всього зображення складено з 2162975 пікселів. Розрахунок відсотка VEGFR-1 - позитивних клітин виконують обчисленням частки від ділення числа "чорних" пікселів на загальне число пікселів в зображенні - 22469/2162975* 100 %=1,04 %. Середнє значення площі VEGFR-1 - позитивних ендотеліальних клітин, визначене в 5 полях зору з наявною експресією VEGFR-1 в тканині менінгіоми, дорівнювало 0,92 %, що відповідає сприятливому прогнозу менінгіоми. На 2015 рік повторних звернень хворої з приводу даного захворювання не було. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб прогнозування рецидиву менінгіоми головного мозку шляхом проведення імуногістохімічного дослідження зразків пухлинної тканини менінгіом і визначення експресії VEGFR-1 (Flt-1) рецептора до судинно-ендотеліального фактора росту, який відрізняється тим, що додатково проводять морфометричне дослідження отриманих гістологічних препаратів з використанням поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ і, якщо площа імунопозитивних ендотеліальних клітин з експресією цього рецептора складає 1,85±0,22 % і більше, то прогнозують рецидив пухлини. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3