Спосіб виявлення двовалентного заліза в біопсійному матеріалі
Номер патенту: 108321
Опубліковано: 11.07.2016
Автори: Фень Сергій Вікторович, Туманський Валерій Олексійович
Формула / Реферат
Спосіб виявлення двовалентного заліза в біопсійному матеріалі шляхом фіксації тканини в 10 % формаліні, забуференому до рН 7,0, основного забарвлення з використанням розчину батофенантроліну у 3 % оцтовій кислоті протягом 2 годин, стабілізації заліза в біоптаті, подальшого дозабарвлення, промивання, висушування та поміщення зрізів, який відрізняється тим, що стабілізацію здійснюють шляхом поміщення біоптату до забарвлення батофенантроліном в окремий 5 % водний розчин L-цистеїну на 20-30 хвилин, забарвлення тканини за допомогою батофенантроліну проводять у термостаті при 60 °С протягом 2-3 годин, а дофарбовування зрізів проводять водним 0,5 % розчином анілінового синього протягом 20 с, та місця локалізації двовалентного заліза визначають за кольором від блідо-рожевого до цегляно-червоного, залежно від інтенсивності накопичення заліза, а ядра клітин диференціюють за синім кольором.
Текст
Реферат: Спосіб виявлення двовалентного заліза в біопсійному матеріалі шляхом фіксації тканини в 10 % формаліні, забуференому до рН 7,0, основного забарвлення з використанням розчину батофенантроліну у 3 % оцтовій кислоті протягом 2 годин, стабілізації заліза в біоптаті, подальшого дозабарвлення, промивання, висушування та поміщення зрізів. Стабілізацію здійснюють шляхом поміщення біоптату до забарвлення батофенантроліном в окремий 5 % водний розчин L-цистеїну на 20-30 хв. Забарвлення тканини за допомогою батофенантроліну проводять у термостаті при 60 °С протягом 2-3 год., а дофарбовування зрізів проводять водним 0,5 % розчином анілінового синього протягом 20 с. Місця локалізації двовалентного заліза визначають за кольором від блідо-рожевого до цегляно-червоного, залежно від інтенсивності накопичення заліза, а ядра клітин диференціюють за синім кольором. UA 108321 U (54) СПОСІБ ВИЯВЛЕННЯ ДВОВАЛЕНТНОГО ЗАЛІЗА В БІОПСІЙНОМУ МАТЕРІАЛІ UA 108321 U UA 108321 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме патоморфології, гістохімії та гепатології, і може бути використаною для більш детальної діагностики біопсійного матеріалу паренхіматозних органів при дифузних захворюваннях, пов'язаних з порушенням метаболізму двовалентного (Fe2+) заліза. Існує декілька гістохімічних методів виявлення двовалентного (Fe2+) заліза в тканинах, в тому числі в печінці, легенях, селезінці, лімфатичних вузлах, кишечнику, але вони нерідко малоінформативні та не завжди ефективні внаслідок недостатньої специфічності реагентів, їх активності тощо, що викликало необхідність удосконалення гістохімічних методів для виявлення двовалентного (Fe2+) заліза у досліджувальному матеріалі. Найбільш близьким за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у використанні батофенантроліну (4,7-дифеніл-1,10-фенантролін), запропонований Р.В. Hukill & F.A. Putt (1962) (Лилли P. Патогистологическая техника и практическая гистохимия: [пер. с англ.] / Р. Лилли - М.: Мир, 1969. - С. 375-376). Спосіб полягає у наступному: 1. Тканину фіксують у 10 % формаліні, забуференому до рН 7.0, заливають в парафін і готують зрізи товщиною 5 мк; монтують їх на предметні скельця, депарафінізують і доводять до дистильованої води, як звичайно. 2. Забарвлюють зрізи за допомогою батофенантроліну 2 години. Для приготування основного розчину 100 мг батофенантроліну розчиняють у 100 мл 3 % оцтової кислоти і залишають на ніч при 60 °C, добре струснувши вміст колби на самому початку для рівномірного розподілу осаду в розчиннику. Отриманий розчин зберігають при кімнатній температурі або на холоді (стійкий близько місяця). Для приготування реагенту безпосередньо перед проведенням реакції до 40 мл розчину батофенантроліну додають 0,2 мл тіоглікольової кислоти і суміш добре перемішують. Використаний розчин можна вилити назад в основний, але так як реагент легко окислюється на повітрі, кожного разу потрібно перед використанням додавати все більше і більше тіоглікольової кислоти. 3. Після фарбування зрізи споліскують в дистильованій воді, дофарбовують 3 хв. у 0,5 % водному розчині метиленового синього і промивають у трьох змінах дистильованої води (по 1 хв. у кожній). 4. Промокають, висушують і укладають в пермаунт. Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі, що заявляється, є такі: - фіксація тканини в 10 % забуференому формаліні, при рН 7.0, - основне забарвлення з використанням розчину батофенантроліну з 3 % оцтовою кислотою протягом 2 годин, - стабілізація заліза в біоптаті, - подальше дозабарвлення, - промивання зрізів в дистильованій воді, - висушування зрізів, - заключення зрізів в бальзам або полістирол. Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що у запропонованому авторами способі використовується комплексний розчин батофенантроліну та тіоглікольової кислоти, чим довше використовується розчин батофенантроліну, тим більша кількість додається тіоглікольової кислоти, але це знижує аналітичну ефективність розчину, і перешкоджає більш точному визначенню двовалентного (Fe2+) заліза. Також тіоглікольова кислота утворює з важкими металами (Ag, Cu, Mn, Ni, Co) комплексні забарвлені сполуки, що при мікроскопічному дослідженні матеріалу дає помилковий результат у вигляді додаткових забарвлених гранул. Фарбування тканини за оригінальною методикою в розчині батофенантроліну відбувається при кімнатній температурі, де реакція проходить дуже слабко або зовсім не відбувається, та при патоморфологічному аналізі залізо виявляється в дуже мізерних об'ємах. Дофарбовування тканини 3 хв. автори рекомендують в 0,5 %-му водному розчині метиленового синього, після чого потрібно промивати зрізи в трьох змінах дистильованої води, що в підсумку робить тканину блідою або зовсім її знебарвлює. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу виявлення двовалентного (Fe2+) заліза шляхом введення додаткових етапів та використання інших реактивів, що забезпечить підвищення ефективності та достовірності виявлення двовалентного (Fe2+) заліза в біопсійному матеріалі. Поставлена задача вирішується тим, що у способі виявлення двовалентного заліза в біопсійному матеріалі шляхом фіксації тканини в 10 % формаліні, забуференому до рН 7,0, основного забарвлення з використанням розчину батофенантроліну у 3 % оцтовій кислоті протягом 2 годин, стабілізації заліза в біоптаті, подальшого дозабарвлення, промивання, висушування та поміщення зрізів, новим є те, що стабілізацію здійснюють шляхом поміщення 1 UA 108321 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біоптату до забарвлення батофенантроліном в окремий 5 % водний розчин L-цистеїну на 20-30 хвилин, забарвлення тканини за допомогою батофенантроліну проводять у термостаті при 60 °C протягом 2-3 год., а дофарбовування зрізів проводять водним 0,5 % розчином анілінового синього протягом 20 с, та місця локалізації двовалентного (Fe2+) заліза визначають за кольором від блідо-рожевого до цегляно-червоного кольору, залежно від інтенсивності накопичення заліза, ядра клітин диференціюють за синім кольором. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у наступному. Заміна тіоглікольової кислоти на L-цистеїн дозволяє більшою мірою виявити депозити двовалентного (Fe2+) заліза в тканині без супутніх металів та зберегти гістологічну структуру клітин. Приготування двох окремих розчинів L-цистеїну та батофенантроліну без їхнього змішування зберігає реактиви в чистому вигляді, не погіршуючи аналітичний ефект, гістологічні зрізи занурюють спочатку в окремий розчин L-цистеїну, який не змішують з батофенантроліном, що більшою мірою підвищує ефективність виявлення двовалентного (Fe2+) заліза, не окислюючи його в тканині, та стабілізує валентність (II) заліза завдяки (-SH) групі цистеїну. Виявлення двовалентного (Fe2+) заліза в розчині батофенантроліну відбувається в термостаті при температурі 60 °C, що підвищує аналітичну ефективність реактиву. Для дофарбовування зрізів використовують 0,5 %-й водний розчин анілінового синього, що більш ефективніше візуалізує тканину при патогістологічному дослідженні та зменшує час фарбування з 3 хв. до 20 с. Пропонований спосіб пояснюється мікрофотографіями, де на фіг. 1 зображено класичний метод Хьюкіла-Пута, а на фіг. 2 - модифікований метод Хьюкіла-Пута. Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних впливів дозволить підвищити ефективність та специфічність способу. Спосіб здійснюють таким чином: 1. Тканину фіксують у 10 % забуференому формаліні рН 7,0, заливають в парафін і готують зрізи товщиною 4 мкм, монтують на предметні скельця, депарафінізують і доводять до дистильованої води. 2. Після дистильованої води зрізи поміщають в 5 % водний розчин L-цистеїну на 20-30 хвилин. 3. Після цього зрізи переносять у розчин батофенантроліну на 2-3 години в термостат при температурі 60 °C, до появи рожевого кольору тканини (робочий розчин батофенантроліну готують за відомим способом - Р.В. Hukill & F.A. Putt (1962)) таким чином: (100 мг батофенантроліну розчиняють у 100 мл 3 % оцтової кислоти і залишають на 24 години в термостаті при температурі 60 °C, добре струснувши вміст колби на самому початку для рівномірного розподілу осаду в розчиннику). 4. Після фарбування зрізи необхідно промити в одній зміні дистильованої води 30 с, потім їх дофарбовують 20 с в 0,5 %-му водному розчині анілінового синього і промивають в двох змінах 2+ дистильованої води по 1 хв. у кожній (комплекс металу з батофенантроліном [Fe(C20H16N2)3] легко розчинний в спиртах та більшості рідин, що розчиняють ліпіди (ксилол, толуол та ін.), але не розчинний у воді). 5. Зрізи висушують (в термостаті 60 °C, без застосування фільтрувального паперу, контакт тканини з фільтрувальним папером змінює забарвлення двовалентного заліза з червоного на чорний) і укладають в бальзам або полістирол. Результат: місця локалізації двовалентного (Fe2+) заліза забарвлюються від блідо-рожевого до цегляно-червоного кольору, залежно від інтенсивності накопичення заліза, ядра забарвлюються в синій колір. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб виявлення двовалентного заліза в біопсійному матеріалі шляхом фіксації тканини в 10 % формаліні, забуференому до рН 7,0, основного забарвлення з використанням розчину батофенантроліну у 3 % оцтовій кислоті протягом 2 годин, стабілізації заліза в біоптаті, подальшого дозабарвлення, промивання, висушування та поміщення зрізів, який відрізняється тим, що стабілізацію здійснюють шляхом поміщення біоптату до забарвлення батофенантроліном в окремий 5 % водний розчин L-цистеїну на 20-30 хвилин, забарвлення тканини за допомогою батофенантроліну проводять у термостаті при 60 °С протягом 2-3 годин, а дофарбовування зрізів проводять водним 0,5 % розчином анілінового синього протягом 20 с, та місця локалізації двовалентного заліза визначають за кольором від блідо-рожевого до 2 UA 108321 U цегляно-червоного, залежно від інтенсивності накопичення заліза, а ядра клітин диференціюють за синім кольором. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3
ДивитисяДодаткова інформація
МПК / Мітки
МПК: G01N 21/00, G01N 1/00
Мітки: спосіб, виявлення, біопсійному, матеріали, двовалентного, заліза
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/5-108321-sposib-viyavlennya-dvovalentnogo-zaliza-v-biopsijjnomu-materiali.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виявлення двовалентного заліза в біопсійному матеріалі</a>
Попередній патент: Спосіб діагностики розвитку остеопорозу
Наступний патент: Спосіб вирощування зерна гречки з урахуванням умов мінерального живлення в правобережному лісостепу україни
Випадковий патент: Водонапірна башта