Застосування 2-(4-аміно-5-(4-нітрофеніл)-4н-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетатної кислоти як антиоксидантного засобу

Реферат: UA 108689 C2 (12) UA 108689 C2 Об'єкт винаходу: застосування 2-(4-аміно-5-(4-нітрофеніл)-4Н-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетатної кислоти як антиоксидантного засобу. Галузь застосування: фармація, медицина та ветеринарія. Суть винаходу: 2-(4-аміно-5-(4-нітрофеніл)-4Н-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетатна кислота містить при N4-атомі ядра 1,2,4-триазолу аміногрупу, в положенні 5 ядра 1,2,4-триазолу містить нітрофенільний радикал, а також має в своєму складі карбоксильну групу та двовалентний атом сірки. Технічний результат: здатність пригнічувати процеси вільнорадикального окиснення, висока розчинність, стійкість при зберіганні, нескладна методика отримання, доступність реактивів для синтезу. N O2N N N NH2 S H2 C COOH UA 108689 C2 5 10 15 20 Винахід стосується фармації, медицини та ветеринарії та може бути використаний у створенні нових біологічно активних сполук, а також оригінальних лікарських засобів у ряді похідних 1,2,4-триазолу, і застосований у промисловості для збільшення термінів зберігання різноманітних речовин, які окиснюються, та в медичній практиці для лікування ВРО-зумовленої патології (ішемічна хвороба серця, цукровий діабет, ожиріння, тощо). Основними показаннями до застосування антиоксидантів є надмірно активовані процеси вільнорадикального окислення, які супроводжують різну патологію. Найактивнішими антиоксидантами є вітаміни А, С, Е, селен, рутин, кверцетин. Але за останні декілька десятиліть вміст вітамінів та мікроелементів у продуктах знизився, а застосування вітамінів може призвести до їх кумуляції в тканинах організму (вітаміни А і Е), що викликає діарею. Слід зазначити, що для отримання вираженого антиоксидантного ефекту необхідне довготривале застосування вищевказаних засобів в кількостях, які перевищують середні терапевтичні дози, що приводить до гіпервітамінозу, а також викликає алергічні реакції. Синтетичні антиоксиданти з одразу декількома антиокислювальними центрами в одній молекулі, у порівнянні з вітамінами і флаваноїдами, мають у два, три, чотири рази сильніший антиоксидантний ефект. Антиоксидантні властивості таких речовин набагато сильніші. У природі подібних аналогів просто не існує. Найбільш близьким аналогом речовини, що заявляється, по фармакологічному ефекту є токоферолу ацетат (вітамін Е), що має високу антиоксидантну активність [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - X.: Торсинг, 1998. - Т. 2. - 592 с. (С. 95-96)], він широко застосовується в медичній практиці і має формулу: O H3C CH3 O H2 C O CH3 25 30 H2 C H2 C CH3 (CH2)2 C H CH3 Дана речовина хоча і має антиоксидантну дію, однак її величина недостатньо висока. Крім того, даний препарат обмежено застосовують для лікування осіб, хворих на тяжкий кардіосклероз чи інфаркт міокарду. Прототипом для речовини, що заявляється, є 5-(4-нітрофеніл)-4-аміно-1,2,4-триазол-3-тіон, що виявляє антиоксидантну активність [Пат. України № 80686; Заявл. 10.12.2012; Опубл. 10.06.2013, Бюл. № 11] і має формулу: N N NH2 45 H2 C . O2N 40 C H CH3 N 35 CH3 SH . Суттєві ознаки прототипу і винаходу, що збігаються, є такі: - наявність в положенні 5 ядра 1,2,4-триазолу нітрофенільного радикалу; - наявність аміногрупи при N4-aтомі ядра 1,2,4-триазолу; - молекули даних речовин містять у складі двовалентний атом сірки; - молекули даних речовин містять атоми вуглецю, що мають ступінь окиснення -3, -2 і -1. Але прототип у порівнянні зі сполукою, що заявляється, менш активно пригнічує процеси вільнорадикального окиснення. Таким чином, прототип відповідно має менші показники антиоксидантної активності. Крім того, прототип менш розчинний у воді, потребує зберігання в особливих умовах (темному місці, через наявність вільної сульфгідрильної групи), здатний до розкладання. В основу винаходу поставлено задачу створення нових біологічно активних сполук, що можуть знайти своє застосування як оригінальні лікарські засоби в ряду 1,2,4-триазолу і проявляють антиоксидантну активність, значно вищу за показники вже відомих антиоксидантних препаратів. Поставлена задача вирішується тим, що 2-(4-аміно-5-(4-нітрофеніл)-4Н-1,2,4-триазол-3ілтіо)ацетатна кислота містить при N4-aтомі ядра 1,2,4-триазолу аміногрупу, в положенні 5 ядра 1 UA 108689 C2 1,2,4-триазолу містить нітрофенільний радикал, а також має в своєму складі карбоксильну групу та двовалентний атом сірки і має формулу: N O2N N N S NH2 H2 C COOH . 5 10 15 20 25 30 Сполуку, що заявляється, отримують взаємодією 5-(4-нітрофеніл)-4-аміно-1,2,4-триазол-3тіону з кислотою монохлороцтовою у середовищі диметилформаміду та з додаванням еквімолекулярної кількості натрію гідроксиду при температурі 100-105 °C. Приклад В літрову колбу, обладнану змішувачем, холодильником, термометром завантажують 23,7 г (0,1 моль) 5-(4-нітрофеніл)-4-аміно-1,2,4-триазол-3-тіону, 50 мл диметилформаміду, нагрівають до розчинення. В другій колбі розчиняють 9,45 г (0,1 моль) монохлороцтової кислоти у 20 мл диметилформаміду і переносять у першу, додають розчин 4 г (0,1 моль) натрію гідроксиду у 10 мл води. Суміш при постійному перемішуванні нагрівають до 100 °C, витримують 5 годин (при 100-105 °C), охолоджують. Осад відфільтровують, фільтрат упарюють. Вихід складає 25,7 г (87 % в розрахунку на 5-(4-нітрофеніл)-4-аміно-1,2,4-триазол-3-тіон). Коричнева кристалічна речовина з Тпл. 126-128 °C мало розчинна у воді, розчинна в органічних розчинниках. Для аналізу сполуку перекристалізовано із суміші диметилформамід-вода 5:1. Знайдено, %: С - 40,74, Н - 3,09, N-23,68, S-10,85. C10H9N5O4S. Вирахувано, %: С - 40,68, Н - 3,07, N-23,72, S-10,86. -1 В ІЧ-спектрі сполуки, що заявляється, наявні смуги поглинання C-S-групи при 664 см , -1 -1 симетричної NO2-групи при 1370 см , асиметричної NO2-групи при 1505 см , ароматичної групи -1 -1 -1 при 1600 см , смуги коливання NH2-групи при 3560 см , а при 1697 см наявна смуга поглинання, що характерна для аліфатичних кислот, які містять групу -СН2-СООН. Кількісне визначення сполуки, що заявляється, проводили спектрофотометричним методом. Методика проведення експерименту: 2,50 мл 1 % (або 1,00 мл 2,5 %) розчину 2-(4-аміно-5-(4нітрофеніл)-4Н-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетатної кислоти вміщують в мірну колбу на 100,0 мл, доводять водою дистильованою до позначки, перемішують. 2,00 мл одержаного розчину вміщують в мірну колбу ємністю 25,00 мл, доводять водою дистильованою до позначки, перемішують. Вимірюють оптичну густину при 275 нм на фоні компенсаційного розчину (води дистильованої). Визначення проводять методом стандарту. Як розчин порівняння використовували 2,00 мл 0,025 % розчину морфолінію 2-(5-(4-піридил)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4триазол-3-ілтіо)-ацетату. Розрахунок відсоткового вмісту проводять за формулою: C%  35 A  C 0  100  25 , A0 p  2l де A - оптична густина досліджуваного розчину, A 0 - оптична густина розчину порівняння, 40 45 50 C 0 - концентрація розчину порівняння (0,002 г/100 мл), p - наважка, мл, l - товщина шару, см. Розчинність сполуки, що заявляється, проводили згідно ДФУ п. 1.4. Згідно з даною класифікацією 2-(4-аміно-5-(4-нітрофеніл)-4Н-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетатна кислота належить до легкорозчинних, а 5-(4-нітрофеніл)-4-аміно-1,2,4-триазол-3-тіон - до розчинних. Дослідження антиоксидантної активності сполуки, що заявляється, проводили in vitro методом неферментативного ініціювання вільнорадикального окислення, яку оцінювали за концентрацією ТБК-реактантів (ТБК - тіобарбітурова кислота). Реактиви та їх приготування: а) суспензія яєчних ліпопротеїдів - до 1 яєчного жовтка додають 1 л фосфатного буферного розчину з рН 7,4 (визначають за допомогою рН-метру); б) 20 % розчин трихлоретанової кислоти - 20 г трихлоретанової кислоти розчиняють в 80 г води очищеної; в) 0,8 % розчин тіобарбітурової кислоти - 800 мг тіобарбітурової кислоти поміщають в мірну колбу на 100 мл і доводять до мітки водою очищеною. 2 UA 108689 C2 5 10 г) 10 % розчин ферум (ІІ) сульфату - 10 г ферум (II) сульфату розчиняють в 90 мл води очищеної. Хід проведення експерименту. До 4 мл суспензії яєчних ліпопротеїдів додають 0,5 мл розчину сполук 1-9 в димексиді в -3 концентрації 110 моль/л, 1 мл 10 % розчину ферум (II) сульфату. Суміш перемішують і витримують 1 годину при 37 °C в термостаті. До 1 мл суміші додають 1 мл 20 % розчину трихлоретанової кислоти і обертають в центрифузі 15 хв при 3000 об/хв. Надосадну рідину змішують з 1 мл 0,8 % розчину тіобарбітурової кислоти і поміщають на 1 годину в парову баню, після чого додають 4 мл бутанолу-1 і обертають в центрифузі 15 хв при 3000 об/хв. Відбирають 2 мл верхнього бутанольного шару і вимірюють його оптичну густину при довжині хвилі 532 нм. Контрольну пробу готували аналогічно, але без додавання досліджуваних сполук. В якості препарату порівняння використовували токоферолу ацетат, що вводили в аналогічних дозах. Антиоксидантну активність розраховували за формулою: AOA  15 де Eконтроль  Е дослід Eконтроль  100% , АОА - антиоксидантна активність, % E контроль - оптична густина контрольного розчину; Е дослід - оптична густина розчину, що містив досліджувані сполуки (або токоферолу ацетат). Результати антиоксидантної активності наведені в табл. 1. Таблиця 1 № з/п Речовина 1 Контроль 2-(4-аміно-5-(4-нітрофеніл)-4Н-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетатна 2 кислота (сполука 1) 3 5-(4-нітрофеніл)-4-аміно-1,2,4-триазол-3-тіон (прототип) 4 Токоферолу ацетат (вітамін Е) Е АОА , % 0,110 0,014 95,1 0,012 0,023 89,1 79,0 20 25 З результатів дослідження видно, що 2-(4-аміно-5-(4-нітрофеніл)-4Н-1,2,4-триазол-3ілтіо)ацетатна кислота має більші показники антиоксидантної активності, а отже більш активно пригнічує процеси вільнорадикального окиснення. Крім того, сполука, що заявляється, легко розчинна у воді, на відміну від прототипу, та не потребує особливих умов зберігання. На основі цих результатів сполука, що заявляється, може бути рекомендована як винахід. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Застосування 2-(4-аміно-5-(4-нітрофеніл)-4Н-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетатної кислоти формули 30 N O2N N N S H2 C COOH NH2 як антиоксидантного засобу. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3