Спосіб прогнозування небажаних клінічних подій протягом трьох років у хворих на ішемічну хронічну серцеву недостатність

Реферат: Винахід стосується способу прогнозування небажаних клінічних подій протягом трьох років у хворих на ішемічну хронічну серцеву недостатність, за яким проводять аналіз крові методом проточної цитофлуометрії, визначають співвідношення ендотеліальних апоптичних UA 109221 C2 (12) UA 109221 C2 мікрочастинок до ендотеліальних прогеніторних мононуклеарів, і якщо показник складає 1,321,69, то прогнозують прогресування хронічної серцевої недостатності і з високим ризиком несприятливих подій протягом наступних 3 років, а якщо він є 1,69 і більше, то прогнозують виникнення раптової серцевої смерті у короткотривалій перспективі. UA 109221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід стосується медицини, а саме - кардіології, і може бути використаним для прогнозування стану хворих, а саме вірогідності розвитку раптової серцевої смерті, та госпіталізацій, пов'язаних з прогресуванням серцевої недостатності (СН) протягом трьох років. Хронічна серцева недостатність (ХСН) продовжує розглядатися як провідна причина кардіоваскулярної смертності. Впровадження сучасних технологій діагностики, лікування та реабілітації хворих на ішемічну хронічну серцеву недостатність суттєво вплинуло на перебіг, результат захворювання, та все ж проблема прогнозування розвитку несприятливих клінічних подій, а саме раптової серцевої смерті, прогресування СН, залишається не вирішеною, що робить розробку нових, більш достовірних способів прогнозування таких станів актуальною. Відомий спосіб прогнозування кардіоваскулярних подій, який полягає у визначенні хвилинного об'єму серця і швидкості клубочкової фільтрації, зокрема розраховується коефіцієнт стандартизованої швидкості клубочкової фільтрації і при показнику менше 9 прогнозується несприятливий прогноз протягом 3 років після обстеження (Патент РФ № 245239, МПК А61В10/00. Способ прогнозирования риска смерти больных с хронической сердечной недостаточностью. - Опубликовано: 10.06.2012). Спільною суттєвою ознакою аналога та способу, що заявляється, є проведення аналізу крові для прогнозування виникнення несприятливих кардіоваскулярних подій. Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що, по-перше на рівень швидкості клубочкової фільтрації можуть впливати багато неспецифічних факторів, які не мають безпосереднього впливу на розвиток СН ішемічного ґенезу, зокрема гострий і хронічний нефрит, хронічна ниркова недостатність, нефротичний синдром, порушення кровообігу в нирках, масивна крововтрата, шок. По-друге, окрім дослідження крові даний спосіб потребує додаткового інструментального аналізу з визначення хвилинного об'єму серця, на який так само можуть впливати безліч неспецифічних чинників таких як: фізичне навантаження, частота серцевих скорочень, кількість крові, що надходить до серця (венозний повернення крові). Найбільш близьким за технічною суттю та результатом є спосіб, який полягає у визначенні в крові пацієнтів інсуліноподібного фактора росту-зв'язуючого білка 4 або інсуліноподібного фактора росту-зв'язуючого білка 5 (IGFBP-4 або IGFBP-5). Даний винахід використовують для визначення ризику майбутніх серйозних несприятливих серцево-судинних подій. У цьому винаході фрагменти IGFBP запропоновані для використання як біомаркерів крові для прогнозування ризику серйозних несприятливих серцево-судинних подій. (Раt. US2014017714 (A1), Classification: G01N33/68. Method for determining the risk of cardiovascular events using IGFBP fragments. - 2014-01-16). Спільною суттєвою ознакою прототипу та способу, що заявляється, є проведення аналізу крові для визначення прогнозу виникнення кардіоваскулярних подій. Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що IGFBP-4 або І GFBP-5 мають переважно нирковий кліренс, тісно залежать від віку та статі хворих. Ці біологічні маркери є найбільш специфічні при їх нормальному рівні. Крім того, при використанні отриманих даних щодо концентрації обох біомаркерів необхідно враховувати вік та стать хворих, для яких рівень плазмової концентрації біомаркерів є різною величиною. Все це суттєво обмежує впровадження цих біомаркерів в рутинну клінічну практику. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу прогнозування несприятливих клінічних подій у хворих на ішемічну ХСН шляхом використання для аналізу крові методу проточної цитофлуорометрії з визначенням співвідношення циркулюючих ендотеліальних апоптичних мікрочастинок (ЕМА) і ендотеліальних прогеніторних мононуклеарів (ЕПМ), що забезпечить підвищення достовірності прогнозу розвитку небажаних клінічних подій, а саме раптової серцевої смерті, прогресування серцевої недостатності у хворих на ішемічну хронічну серцеву недостатність протягом трьох років. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає проведення аналізу крові, новим є те, що проводять проточну цитофлуометрію за допомогою моноклональних антитіл, мічених флуорохромами FITC (флуоресцеїн ізотіоціанат) або подвійною міткою FITC/РЕ (фікоеритрин), до антигенів CD31, annexin V +, CD45, CD34, CD14, Тіе-2 і CD309 (VEGFR2) за методологією HD-FACS (High-Definition Fluorescence Activated Cell Sorter), визначають співвідношення циркулюючого рівня ендотеліальних апоптичних мікрочастинок та циркулюючого рівня ендотеліальних прогеніторних мононуклеарів (ЕАМ/ЕПМ), і якщо показник знаходиться в межах від 1,32 до 1,69 прогнозують прогресування СН, а якщо він є 1,69 та більше, то прогнозують розвиток раптової серцевої смерті. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, за технічним результатом полягає у такому. 1 UA 109221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дисфункція ендотелію відіграє важливу роль у виникненні та прогресуванні багатьох кардіоваскулярних захворювань, включаючи ХСН. Пошкодження моношару ендотеліоцитів, викликане різними причинами, супроводжується досить значним підвищенням циркулюючого рівня ендотеліальних апоптичних мікрочастинок (EАМ). ЕАМ являють собою гетерогенну популяцію мікровезикул, яка вивільняється з ендотеліоцитів у відповідь на їх активацію або внаслідок апоптозу. Збільшення циркулюючого рівня ЕАМ виявлено при багатьох кардіоваскулярних захворюваннях, таких як гострий коронарний синдром/інфаркт міокарда, асимптомний атеросклероз, артеріальна гіпертензія, дисліпідемія, інсульт, фібриляція передсердь, а також при сепсисі, ревматичних і онкологічних захворюваннях, цукровому діабеті, ожирінні, хронічної хвороби нирок. Крім того, відомо, що циркулюючі ендотеліальні прогеніторні мононуклеари (ЕПМ) беруть участь у репаративних процесах, включаючи реендотелізацію фрагментів васкулярного пошкодження, ремоделювання позаклітинного матриксу, неоваскуляризацію і ангіогенез. Також як ЕАМ, циркулюючі проангіогені ЕПМ різного походження залучаються до процесів репарації тканин, васкулогенезу і васкулярного ремоделювання. Визначення прогностичних факторів виникнення кардіоваскулярних подій у хворих з ішемічною ХСН є важливою і до кінця не з'ясованою задачею. Зрозуміло, що для прогнозування виникнення кардіоваскулярних подій та несприятливого клінічного перебігу у хворих з ішемічною хворобою серця необхідно застосовувати специфічні маркери, які пов'язані зі всіма факторами ризику на механізмами виникнення кардіоваскулярних подій в популяції. Враховуючи прогностичні властивості ЕАМ та ЕПМ, дані маркери можливо використовувати з метою прогнозування клінічного перебігу ішемічної хвороби серця зокрема. Шляхом динамічного спостереження протягом трьох років був розрахований прогностичний потенціал співвідношення ЕАМ і ЕПМ з визначенням оптимальних точок розподілення на кривій AUC, які мали найбільшу прогностичну цінність щодо прогресування СН та розвитку раптової серцевої смерті хворих на ХСН ішемічного генезу. Такий прогностичний потенціал раніше не був відомий і був визначений в результаті власних припущень та підтверджений результатами подальших цілеспрямованих досліджень. Враховуючи вищезазначене співвідношення ЕАМ і ЕПМ є більш надійним індикатором дисбалансу між про-і антиангіогенною відповіддю при реалізації кардіоваскулярного ремоделювання з великим прогностичним потенціалом. Співвідношення ЕАМ та ЕПМ є найбільш достовірно чутливим та специфічним маркером прогресування СН та раптової серцевої смерті у хворих на ХСН ішемічного генезу. Таким чином, запропонована методика дозволить визначити пацієнтів групи високого ризику виникнення несприятливих клінічних подій у хворих на ішемічну ХСН, що свою чергу дозволить своєчасно провести профілактику цих подій. Спосіб здійснюють таким чином. Хворому на хронічну ішемічну хворобу серця, натщесерце беруть кров з ліктьової вени одноразовою голкою (діаметр 0,8-1,1 мкм) в одноразовий шприц об'ємом 5 мл. Під час забору крові в шприц кров з нього обережно (без утворення піни) переноситься в одноразову пробірку. Відділяють плазму як можна швидше для уникнення гемолізу, використовуються тільки негемолізовані зразки. Пробірку з кров'ю центрифугують протягом 15 хвилин при 3000 обертів за хвилину для відділення плазми. Пробу плазми з пробірки переміщують безпосередньо у мікропланшети для проведення аналізу методом проточної цитофлуометрії. Фенотипування популяцій ендотеліальних апоптичних мікрочастинок і мононуклеарних клітин здійснюється методом проточної цитофлуориметрії за допомогою моноклональних антитіл, міченими флуорохромами FITC (флуоресцеїн ізотіоціанат) або подвійний міткою FITC/РЕ (фікоеритрин) (BD Biosciences, США), до антигенів CD31, annexin V +, CD45, CD34, CD14, Тіе-2 і CD309 (VEGFR2) за методологією HD-FACS (High-Definition FluorescenceActivatedCellSorter) з видаленням еритроцитів лізучим буфером відповідно до протоколу гейтування ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering sequential). Визначення проводять при кімнатній температурі одразу після того, як був взятий зразок крові. Отримані результати інтерпретуються таким чином: якщо показник співвідношення ендотеліальних апоптичних мікрочастинок до ендотеліальних прогеніторних мононуклеарів складає від 1,32 до 1,69, то прогнозують прогресування ХСН протягом наступних 3 років, а якщо він є 1,69 і більше, то прогнозують виникнення раптової серцевої смерті у короткотривалій перспективі. Приклад 1. Хвора, К., 1941 р.н. була госпіталізована в КУ "Запорізька обласна клінічна лікарня" ЗОР з діагнозом "ІХС. Кардіосклероз. Персистуюча форма фібриляції передсердь. СН ІФК IINYHA", історія хвороби № 4956. На першу добу від розвитку хвороби у пацієнтки натщесерце взяли з ліктьової вени кров одноразовою голкою діаметром 1,1 мм в одноразовий 2 UA 109221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 шприц об'ємом 5 мл. Кров в шприц обережно (без утворення піни) перенесли в одноразову пробірку. Відділили плазму, а саме пробірку з кров'ю центрифугували протягом 15 хвилин при 3000 обертів за хвилину для відділення плазми. Пробу плазми з пробірки перемістили безпосередньо у мікропланшети для проведення аналізу методом проточної цитофлуометрії. Фенотипування популяцій ендотеліальних апоптичних мікрочастинок і мононуклеарних клітин здійснюється методом проточної цитофлуориметрії за допомогою моноклональних антитіл, міченими флуорохромами FITC (флуоресцеїн ізотіоцианат) або подвійний міткою FITC/РЕ (фікоеритрин) (BD Biosciences, США), до антигенів CD31, annexin V +, CD45, CD34, CD14, Тіе-2 і CD309 (VEGFR2) за методологією HD-FACS (High-Definition Fluorescence Activated Cell Sorter) видалення меритроцитівлізучих буфером відповідно до протоколу гейтування ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering sequential). Визначили співвідношення ендотеліальних апоптичних мікрочастинок до ендотеліальних прогеніторних мононуклеарів методом проточної цитофлуометрії при кімнатній температурі одразу після того, як був взятий зразок крові. Результат склав 1,42. Отриманий показник свідчить про високу вірогідність розвитку прогресування ХСН протягом наступних 3 років. Необхідно відповідним чином посилити моніторинг стану пацієнта та за необхідності призначити більш агресивне лікування або альтернативну стратегію терапії для попередження прогресування серцевої недостатності. Приклад 2. Хворий, P., 1958 р.н., був госпіталізований КУ "Запорізька обласна клінічна лікарня" ЗОР, історія хвороби № 6927, якому на підставі клінічної картини, інструментальних досліджень діагностовано стенокардію наруги II функціонального класу з хронічною серцевою недостатністю I стадії II функціонального класу. На першу добу від розвитку хвороби у пацієнта натщесерце взяли з ліктьової вени кров одноразовою голкою діаметром 1,1 мм в одноразовий шприц об'ємом 5 мл. Кров в шприц обережно (без утворення піни) перенесли в одноразову пробірку. Відділили плазму, а саме пробірку з кров'ю центрифугували протягом 15 хвилин при 3000 обертів за хвилину для відділення плазми. Пробу плазми з пробірки перемістили безпосередньо у мікропланшети для проведення аналізу методом проточної цитофлуометрії. Фенотипування популяцій ендотеліальних апоптичних мікрочастинок і мононуклеарних клітин здійснюється методом проточної цитофлуориметрії за допомогою моноклональних антитіл, міченими флуорохромами FITC (флуоресцеїн ізотіоціанат) або подвійний міткою FITC/РЕ (фікоеритрин) (BD Biosciences, США), до антигенів CD31, annexin V +, CD45, CD34, CD14, Тіе-2 і CD309 (VEGFR2) за методологією HD-FACS (High-Definition Fluorescence Activated Cell Sorter) з видаленням еритроцитів лізучих буфером відповідно до протоколу гейтування ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering sequential). Визначили співвідношення ендотеліальних апоптичних мікрочастинок до ендотеліальних прогеніторних мононуклеарів методом проточної цитофлуометрії при кімнатній температурі одразу після того, як був взятий зразок крові. Результат склав 1,22. Отриманий показник свідчить про низьку вірогідність розвитку прогресування ХСН протягом наступних 3 років. Необхідності призначати більш агресивне лікування або альтернативну стратегію терапії для попередження прогресування серцевої недостатності не має. Пацієнту не потрібне додаткове лікування, окрім основного. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 50 Спосіб прогнозування небажаних клінічних подій протягом трьох років у хворих на ішемічну хронічну серцеву недостатність шляхом проведення аналізу крові, який відрізняється тим, що проводять проточну цитофлуометрію за допомогою моноклональних антитіл, мічених флуорохромами FITC (флуоресцеїн ізотіоціанат) або подвійною міткою FITC/РЕ (фікоеритрин), до антигенів CD31, annexin V+, CD45, CD34, CD14, Тіе-2 і CD309 (VEGFR2) за методологією HDFACS (High-Definition Fluorescence Activated Cell Sorter), визначають співвідношення циркулюючого рівня ендотеліальних апоптичних мікрочастинок та циркулюючого рівня ендотеліальних прогеніторних мононуклеарів (ЕАМ/ЕПМ), і якщо показник знаходиться в межах від 1,32 до 1,69, прогнозують прогресування серцевої недостатності, а якщо він є 1,69 та більше, то прогнозують розвиток раптової серцевої смерті. 55 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3