Спосіб визначення мутагенної активності неіонізуючих видів випромінювання на drosophila melanogaster

Реферат: Спосіб визначення мутагенної активності неіонізуючих видів випромінювання на Drosophila melanogaster шляхом обробки мутагенним чинником самців, їх схрещування з інтактними віргінними самками та подальшого дослідження індукованих домінантних летальних мутацій у їх нащадків. Індуковані домінантні летальні мутації визначають на постембріональній стадії розвитку дрозофіли за рівнем постембріональних втрат. Наявність мутагенної активності у неіонізуючих видів випромінювання констатують при достовірному перевищенні частоти домінантних летальних мутацій над спонтанним рівнем більш ніж у 2 рази. UA 111215 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ МУТАГЕННОЇ АКТИВНОСТІ НЕІОНІЗУЮЧИХ ВИДІВ ВИПРОМІНЮВАННЯ НА DROSOPHILA MELANOGASTER UA 111215 U UA 111215 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі генетики, а саме індукованого мутагенезу, і може бути використана у сучасних схемах для короткострокового тестування, зокрема визначення мутагенної активності різноманітних видів неіонізуючого випромінювання. Відомим способом тестування на мутагенність з використанням як тест-об'єкта Drosophila melanogaster є спосіб обліку рецесивних, зчеплених зі статтю, летальних мутацій (РЗСЛМ), який полягає в обліку індукованих в Х-хромосомах самців дрозофіли дикого типу летальних мутацій [1]. Для виконання способу використовують оброблених самців лінії дикого типу (Canton-S), яких схрещують з самками тесторної лінії Меллер-5. Рецесивні, зчеплені зі статтю, летальні мутації передаються через самок F1 самцям другого покоління F2, які не доживають до стадії імаго. В кожному варіанті досліду необхідно проаналізувати не менш ніж 1000 пробірок дрозофіли. Пробірки, в яких відсутні самці дикого типу, є "летальні". Рівень РЗСЛМ розраховують за співвідношенням летальних культур до загальної кількості проаналізованих. Недоліком відомого способу є те, що для його виконання необхідна наявність спеціальної тестерної лінії Меллер-5. При виконанні способу можливе лише виявлення здатності чинників індукувати генні мутації, а не хромосомні аберації. Недоліком способу є його неекономічність необхідно проаналізувати 1000 пробірок на кожен варіант досліду. Невисока достовірність тестування, обумовлена дуже низьким спонтанним рівнем РЗСЛМ у дрозофіли, який складає від 0,1 до 0,5 %. Середній показник - 0,26 %. Найближчим аналогом способу є спосіб обліку домінантних летальних мутацій у дрозофіли [2]. Спосіб полягає в обліку індукованих у статевих клітинах самців дрозофіли домінантних летальних мутацій, які викликають загибель першого покоління нащадків. Для виконання способу використовують оброблених самців лінії дикого типу Canton-S, яких схрещують масово з інтактними віргінними самками цієї ж лінії (по 200 пар). Оцінку домінантних летальних мутацій проводять на стадії яйця (ембріональна летальність). Яйцекладка відбувається на агарові пластинки у чашки Петрі. Через 3-4 години під бінокулярною лупою проводять облік відкладених яєць. Для кожної серії експерименту відбирають не менш ніж 1000 запліднених яєць. Якщо (через 18-20 годин) з яйця виходить личинка, від нього залишається порожня прозора оболонка. В цей час за допомогою бінокулярної лупи проводять пошук та підрахунок нерозвинутих яєць. Прозорими є незапліднені яйця. Матовий окрас яєць характеризує прояв домінантних деталей із ранньою ембріональною загибеллю. Яйця із пізньою ембріональною загибеллю забарвлені у різні кольори, від жовтого до коричневого. Окремо підраховують кількість незапліднених яєць, кількість яєць із ранньою ембріональною загибеллю та кількість яєць із пізньою ембріональною загибеллю. Ембріональна летальність визначається за відношенням кількості яєць, що не розвинулись, до загальної кількості відкладених запліднених яєць та представляється у відсотках. Однак, у найближчому аналогу схрещення відбувається масово, що унеможливлює аналіз геному кожного обробленого самця окремо. Для постановки однієї серії експерименту слід мати 900 самців і 600 самок одного віку у тому випадку, якщо обробці ксенобіотиками підлягають самці, та, відповідно, 900 самок і 600 самців при обробці самок, що робить спосіб неекономічним. Результати експериментів на ембріональній стадії розвитку дрозофіли потребують використання бінокулярної лупи та старанності в підрахунку різних класів яєць можливі помилки при аналізі та обліку запліднених, незапліднених, та нерозвинутих яєць. Все це призводить до невисокої достовірності і експресності тестування, що потребує обліку великої кількості яєць (1000 яєць на кожний варіант досліду) і робить спосіб неекономічним. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу тестування мутагенної активності чинників, у якому за рахунок створення нової сукупності ознак була б підвищена інформативність, економічність, вірогідність і експресність тестування. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення мутагенної активності чинників на Drosophila melanogaster шляхом обробки мутагенним чинником самців, їх схрещування з інтактними віргінними самками та подальшого обліку індукованих домінантних летальних мутацій у їх нащадків, згідно з корисною моделлю, домінантні летальні мутації визначають на постембріональній стадії розвитку (стадії лялечок) за рівнем постембріональних втрат, а наявність мутагенної активності констатують при достовірному перевищенні частоти домінантних леталей над спонтанним рівнем більш ніж у 2 рази. Корисною моделлю передбачено, що оброблених мутагенним чинником самців схрещують з віргінними самками індивідуально у співвідношенні 1:1. Заявлений спосіб здійснюють шляхом визначення домінантних летальних мутацій у дрозофіли, який полягає в обліку індукованих мутагенним чинником мутацій у статевих клітинах дрозофіли. Виконують додаткові підрахунки частоти індукованих домінантних летальних мутацій. З цією метою оброблених самців схрещують з інтактними віргінними самками не 1 UA 111215 U 5 10 15 масово, а індивідуально в окремих пробірках у співвідношенні 1:1. Це дає змогу проаналізувати дію мутагену окремо на геном кожного самця і, таким чином, підвищити інформативність методу і зменшити об'єм експериментального матеріалу, що аналізується. Пробірки з дрозофілами (1520 пробірок) культивують у термостаті при температурі 24 °C протягом 8-10 діб. В зв'язку з тим, що домінантні летальні мутації - генетичні зміни, що відбуваються в батьківських статевих клітинах і викликають загибель першого покоління нащадків, реалізуються на різних етапах онтогенезу дрозофіли-як на ембріональному (яйця), так і на постембріональному (личинки та лялечки) [2, 3], в новому способі підрахунок домінантних летальних мутацій пропонується проводити не на стадії яйця, а на стадії лялечок. Для цього після виходу личинок на стінки пробірок спостерігають утворення лялечок. На цій стадії розраховують загальну кількість лялечок у дослідній та контрольній групах. Якщо з лялечки виходить імаго (доросла муха), то від неї на стінках пробірок залишається порожня прозора оболонка, яка легко відрізняється від загиблих темних непрозорих лялечок. Тому після закінчення виходу імаго виконують підрахунок загиблих лялечок. Основним показником рівня домінантних летальних мутацій є частота постембріональних втрат, яка оцінюється за відношенням кількості загиблих лялечок до загальної кількості лялечок за формулою: ДЛМ = ЗЛ / (ЖЛ + ЗЛ) х 100 %, 20 25 30 35 40 45 50 55 60 де: ЗЛ - кількість загиблих лялечок; ЖЛ - кількість живих лялечок. Про мутагенну активність неіонізуючих видів випромінювання роблять висновок за перевищенням мутагенного ефекту над спонтанним рівнем більш ніж у 2 рази. У новому способі відпадає необхідність великого масового попереднього розведення дрозофіли (900 самців і 600 самок), що робить метод більш економічним. У новому способі схрещування оброблених самців з самками відбувається індивідуально, а не масово, що дає змогу проаналізувати дію мутагену окремо на геном кожного самця, що робить спосіб більш інформативним. Аналіз індукованих домінантних летальних мутацій у новому способі відбувається на стадії лялечок, а не на стадії яйця, що унеможливлює появу суб'єктивних помилок під час підрахунків великої кількості різних класів яєць - 1000 яєць на кожний варіант досліду (незапліднених, запліднених, загиблих на ранній стадії, різного кольору, що загиблі на пізній стадії ембріонального розвитку), що підвищує інформативність та достовірність методу. Таким чином, сукупність суттєвих ознак способу, що заявляється, дозволяє підвищити інформативність, економічність, достовірність та експресність тестування. Запропонований спосіб дозволяє дослідити активність мутагенів різноманітних видів неіонізуючого випромінювання, визначити дозові залежності, виявити реальну небезпеку для здоров'я людини використання певних видів випромінювання та провести пошук чинників з антимутагенними властивостями. Спосіб визначення мутагенних властивостей неіонізуючих видів випромінювання на Drosophila melanogaster служить вирішенню проблеми профілактики індукованого мутагенезу, а саме запобіганнюнегативного впливу мутагенів різної природи на структури спадковості людини, сприяє широкому генетичному скринінгу, спрямованому на виявлення й усунення з оточуючого середовища чинників з мутагенними властивостями. Приклад використання способу, що заявляється: Приклад Метою дослідження було визнання мутагенної активності мікрохвильового випромінювання здатності індукувати домінантні летальні мутації. Аналізували самців Drosophila melanogaster лінії Canton-S, що були вирощені з опромінених яєць. Густина потоку потужності на поверхні опроміненого об'єкта в усіх випадках становила 30 2 мкВт/см . Використовували метод обліку домінантних летальних мутацій, індукованих у статевих клітинах дрозофіли. Показником домінантних летальних мутацій була частота постембріональних втрат. Статистичний аналіз результатів проводили з використанням 2 критерію χ та критерію Стьюдента t [4]. У цій серії експериментів частота домінантних летальних мутацій у контролі становила 6,7±0,86 %. Рівень адаптивних ознак за показниками плодючості дорівнював: за кількістю лялечок - 84,5±5,1; за кількістю імаго - 78,8±4,7. Вплив мікрохвильового випромінювання індукував статистично значуще збільшення частоти домінантних летальних мутацій в 3,9 раза порівняно з контролем. Частота індукованих 2 UA 111215 U 2 5 10 15 20 домінантних летальних мутацій у цьому експерименті становила 23,3±1,7 % (χ =108,0; р