Спосіб імунологічного дослідження у хворих на меланому шкіри

Реферат: UA 111776 U UA 111776 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявка належить до галузі медицини, а саме - клінічної онкології, і може бути використана при комбінованому лікуванні хворих на меланому шкіри. Меланому шкіри відносять до пухлин з високою імуногенністю і розглядають як одну з найбільш перспективних пухлин для імунотерапевтичного впливу. Проте з прогресуванням захворювання у хворих на меланому шкіри спостерігається розвиток дисфункції імунної системи, ступінь якої залежить від стадії пухлинного пронесу і біологічних особливостей пухлини. Показано, що в периферичній крові хворих на меланому шкіри відбуваються зміни основних популяцій лімфоцитів (В-лімфоцитів, Т-лімфоцитів та природних кіперних клітин), які можуть виникати вже на початку захворювання. Крім того, у таких хворих відмічають зміни з боку мінорних субпопуляцій Т-лімфоцитів, зокрема γδT- та NKT-клітин [1,2]. Розвиток меланоми шкіри хоча і супроводжується посиленням експресії маркерів активації (CD25, CD71, CD95, HLA-DR та ін.) на лімфоцитах периферичної крові, призводить до зниження цитотоксичної активності та проліферативної відповіді клітин-ефекторів імунної системи [3] і зростання рівня апоптозу цих клітин [4]. Відбувається порушення балансу між ефекторними та регуляторними клітинами імунної системи, що пов'язано зі збільшенням кількості регуляторних Т-лімфоцитів і клітин-супресорів мієлоїдного походження та посиленням їх супресорних властивостей [5, 6]. Таким чином, важливим є оцінка імунологічних показників в комплексному обстеженні хворих на меланому шкіри для визначення індивідуальних особливостей перебігу пухлинного процесу, прогнозування відповіді організму на імунотерапію з метою оптимізації тактики лікування. За прототип вибрано спосіб імунологічного дослідження у хворих на меланому шкіри (Олейник Е.К. Маркеры активации лимфоцитов крови (CD25, CD71, CD95, HLA-DR) у онкологических больных / Е.К. Олейник, М.И. Шибаев, В.М. Олейник // Гематология и трансфузиология. - 2006. -Т. 51, № 1. - С. 18-22), за яким у онкологічних хворих, у тому числі хворих на меланому шкіри, проводили дослідження імунного статусу з визначенням відносної кількості лімфоцитів периферичної крові за експресією антигенів (CD3, CD4, CDS, CD16, CD 19, CD25, CD71, CD95, HLA-DR) методом проточної цитофлуориметрії та проводили аналіз змін цих показників в залежності від стадії захворювання. Перевагою прототипу є можливість оцінки імунологічних параметрів хворих на меланому шкіри, що може бути використано для прогнозування ефективності імунотерапії. Недоліком прототипу є визначення у хворих на меланому шкіри субпопуляційного складу Тлімфоцитів за експресією лише одного з антигенів CD4 або CD8, що обмежує оцінку стану імунної системи. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб імунологічного дослідження у хворих на меланому шкіри шляхом визначення методом проточної + + цитофлуориметрії складу Т-лімфоцитів периферичної крові за субпопуляціями CD3CD4 CD8 -, + dim bright + bright dim CD3 CD4 CD8 - та CD3 CD4 CD8 -клітин, що дасть можливість покращити моніторинг хворих в процесі імунотерапії та допоможе розробити більш ефективні схеми її застосування. Поставлена задача вирішується наступним чином: Хворим на меланому шкіри після клініко-рентгенологічного обстеження, що включає комп'ютерну томографію головного мозку, органів грудної та черевної порожнин, органів таза, ультразвукове дослідження реґіонарних лімфатичних вузлів, до початку лікування проводять імунологічне дослідження, для цього вранці натщесерце з ліктьової вени відбирають периферичну кров в об'ємі 2 мл в пробірку з гепарином. Методом проточної цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-FITC ("Beckman Coulter", США) + + + + dim bright + dim bright в крові визначають відносний вміст CD3 CD4 CD8 -, CD3 CD4 CD8 - та CD3 CD4 CD8 клітин серед популяції лімфоцитів. Результати обчислюють на проточному цитофлуориметрі FACScan ("Becton Dickinson", США) з використанням програми "Cell Quest". Під час обліку + + + результатів підраховують 10 × 10 лімфоцитів. Абсолютну кількість CD3 CD4 CD8 -, + dim brigh + bright dim CD3 CD4 CD8 - та CD3 CD4 CD8 -клітин визначають виходячи із вмісту лейкоцитів у периферичній крові та відсотка лімфоцитів в лейкоцитарній формулі. За заявленим способом імунологічне дослідження було проведено у 70 хворих з гістологічно підтвердженим діагнозом меланоми шкіри з І-IV стадією захворювання. Прикладами реалізації заявленого способу є витяги з історій хвороб наступних пацієнтів. І. Хвора К., 1952 р. н., історія хвороби № 6106. Звернулась у відділення пухлин шкіри та м'яких тканин Національного інституту раку зі скаргами на наявність пігментної пухлини на шкірі правого передпліччя, що з'явилась 3 роки тому і останні півроку стала кровить. 1 UA 111776 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Після обстеження, що включало рентгенографію органів грудної клітки, ультразвукове дослідження органів черевної порожнини та загальноклінічні дослідження, встановлено клінічний діагноз: меланома шкіри правого передпліччя, II клінічна група. 28.05.2012 р. хворій до початку лікування провели імунологічне дослідження, для цього вранці натщесерце з ліктьової вени відібрали периферичну кров в об'ємі 2 мл в пробірку з гепарином. Методом проточної цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл CD3-PC5/CD4-RD1/CD8 FIТС ("Beckman Coulter", СІЛА) в крові визначили відносний вміст + + + + dim brigh + bright dim CD3 CD4 CD8 -, CD3 CD4 CD8 - та CD3 CD4 CD8 -клітин серед популяції лімфоцитів. Результати обчислювали на проточному цитофлуориметрі FACScan ("Becton Dickinson", США) з 3 використанням програми "Cell Quest". Під час обліку результатів підраховували 1010 + + + + dim brigh + bright dim лімфоцитів. Абсолютну кількість CD3 CD4 CD8 -, CD3 CD4 CD8 - та CD3 CD4 CD8 клітин визначали виходячи із вмісту лейкоцитів у периферичній крові та відсотка лімфоцитів в лейкоцитарній формулі. Абсолютна кількість Т-лімфоцитів досліджуваних субпопуляцій в + + + периферичній крові була в межах нормальних значень: вміст CD3 CD4 CD8 -клітини складав 9 9 + dim bright 0,03110 /л проти (0,020-0,032)  10 /л у практично здорових людей (ПЗЛ), CD3 CD4 CD8 9 9 + bright dim 9 клітин 0,00610 /л проти (0,004-0,006)  10 /л у ПЗЛ, CD3 CD4 CD8 -клітин - 0,01310 /л 9 проти (0,012-0,016) 10 /л у ПЗЛ. 06.06.2012 р. під внутрішньовенним наркозом виконано широке висічення меланоми шкіри правого передпліччя та біопсія "сторожового" лімфатичного вузла правої пахової ділянки. Після хірургічного лікування хвора упродовж 12 місяців отримувала рекомбінантний α2bінтерферон (лаферобіон, виробництво Україна) по 3 млн ОД тричі на тиждень підшкірно. Патогістологічний висновок № 26686-93/12 від 14.06.2012 p.: епітеліоїдноклітинна меланома шкіри, що поверхнево розповсюджується, з наявністю вузлового компоненту, III-IV рівень інвазії за Clark, товщина пухлини за Breslow більш 1,0 мм. В "сторожовому" лімфатичному вузлі пухлина не визначається. Встановлено заключний діагноз: меланома шкіри правого передпліччя, T1bN0M0, стадія IB, клінічна група II. За період спостереження (46 місяців) рецидиву або метастазів пухлини у хворої не виявлено. II. Хвора Д., 1941 р. н., історія хвороби № 1495. Звернулась у відділення пухлин шкіри та м'яких тканин Національного інституту раку зі скаргами на наявність пігментної пухлини на шкірі правої гомілки, що з'явилась в 2010 році, стала швидко збільшуватись в розмірах та періодично кровити. Після обстеження, що включало рентгенографію органів грудної клітки, ультразвукове дослідження органів черевної порожнини та загальноклінічні дослідження, встановлено клінічний діагноз: меланома шкіри правої гомілки, II клінічна група. 17.02.2011 р. хворій до початку лікування провели імунологічне дослідження для цього вранці натщесерце з ліктьової вени відібрали периферичну кров в об'ємі 2 мл в пробірку з гепарином. Методом проточної цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-FITC ("Beckman Coulter", США) в крові визначили відносний вміст + + + + dim bneh + bright dim CD3 CD4 CD8 -, CD3 CD4 CD8 - та CD3 CD4 CD8 -клітин серед популяції лімфоцитів. Результати обчислювали на проточному цитофлюориметрі FACScan ("Becton Dickinson", США) 3 з використанням програми "Cell Quest". Під час обліку результатів підраховували 1,010 + + + + dim brigh + bright dim лімфоцитів. Абсолютну кількість CD3 CD4 CD8 -, CD3 CD4 CD8 - та CD3 CD4 CD8 клітин визначали виходячи із вмісту лейкоцитів у периферичній крові та відсотка лімфоцитів в + + + лейкоцитарній формулі. Абсолютна кількість СОЗ С04 С08 -лімфоцитів в периферичній крові 9 9 була підвищена і складала 0,04010 /л проти (0,020-0,032) 10 /л у ПЗЛ; кількість + dim bneh 9 CD3 CD4 CD8 -клітин була в межах нормальних значень -0,00510 /л проти (0,004-0,006) 9 + bright dim 9 9 10 /л у ПЗЛ; СО3 CD4 CD8 -клітин була знижена - 0,00910 /л проти (0,012-0,016) 10 /л у ПЗЛ. 22.02.2011 р. під внутрішньовенним наркозом виконано широке висічення меланоми шкіри правої гомілки та біопсія "сторожового" лімфатичного вузла правої пахової ділянки. Після хірургічного лікування хвора упродовж 12 місяців отримувала рекомбінантний α2bінтерфсрон (лаферобіон, виробництво Україна) по 3 млн ОД тричі на тиждень підшкірно. Патогістологічний висновок № 7840-46/1 1 від 01.03.201 1 p.: вузлова форма злоякісної меланоми шкіри з поверхневим виразкуванням, IV рівень інвазії за Clark, товщина пухлини за Breslow більш ніж 6,0 мм. Метастази меланоми в "сторожовому" лімфатичному вузлі. Встановлено заключний діагноз: меланома шкіри правої гомілки, T4bN1aM0, стадія IIIВ, клінічна група II. 2 UA 111776 U 5 10 15 20 25 30 За період спостереження (60 місяців) рецидиву або метастазів пухлини у хворої не виявлено. Джерела інформації: 1. Circulating y5T cells in young/adult and old patients with cutaneous primary melanoma / F. Re, A. Donnini, B. Bartozzi [et al.] // Immun. Ageing. -2005. - Vol. 2. - P. 2. 2. Effects of the administration of high-dose interleukin-2 on immunoregulatory cell subsets in patients with advanced melanoma and renal cell cancer / H.J.J. van der Vliet, Ы.В. Koon, S.C. Yue [et al.] // Clin. Cancer Res. - 2007. - Vol. 13, № 7. - P. 2010-2018. 3. Impaired perforin-dependent NK cell cytotoxicity and proliferative activity of peripheral blood T cells is associated with metastatic melanoma / V. Jovic, G. Konjevic, S. Radulovic [et al.] // Tumori. 2001. - Vol. 87, № 5. - P. 324-329. + 4. Spontaneous apoptosis of CD8 T lymphocytes in peripheral blood of patients with advanced melanoma / T. Saito, G. Dworacki, W. Gooding [et al.] // Clin. Cancer Res. - 2000. - Vol. 6, № 4. - P. 1351-1364. + h eh f 5. Strauss L. Functional and phenotypic characteristics of CD4 CD25 ' Foxp3 Treg clones obtained from peripheral blood of patients with cancer / L. Strauss, Ch. Bergmann, Th.L. Whiteside // Int..1. Cancer. -2007.-Vol. 121, № 11.-P. 2473-2483. I' л hl 6. Immature immunosuppressive CD14 HLA-DR cells in melanoma patients are Stat3 and overexpress CD80, CD83, and DC-Sign / I. Poschke, D. Mougiakakos, J. Hansson [et al.] // Cancer Res. - 2010. - Vol. 70, № 11. -P. 4335-4345. 7. Олейник Е.К. Маркеры активации лимфоцитов крови (CD25, CD71, CD95, HLA-DR) у онкологических больных / В.К. Олейник, М.И. Шибаев, В.М. Олейник // Гематология и трансфузиология. - 2006. - Т. 51, № 1. - С. 18-22 (прототип). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб імунологічного дослідження у хворих на меланому шкіри, що включає виявлення змін імунної системи методом проточної цитофлуориметрії, який відрізняється тим, що склад Т+ + лімфоцитів периферичної крові визначають за субпопуляціями CD3 CD4 CD8 -, + dim bright + bright dim CD3 CD4 CD8 -TaCD3 CD4 CD8 -клітин. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3