Спосіб визначення кількості окремих субпопуляцій лімфоцитів у реакції бластної трансформації лімфоцитів
Номер патенту: 112697
Опубліковано: 26.12.2016
Автори: Бєльська Людмила Миколаївна, Гнєдкова Ірина Олександрівна, Потапова Антоніна Ігнатіївна, Лісяний Микола Іванович
Формула / Реферат
Спосіб визначення кількості окремих субпопуляцій лімфоцитів у реакції бластної трансформації лімфоцитів, що є методом діагностики, який відрізняється тим, що після постановки реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) забирають 200,0 мкл суміші поживного середовища та клітин крові, з якими ставлять реакцію з CD-3,4,8,16,20 моноклональними антитілами, для цього до взятих клітин добавляють 200,0 мкл фізіологічного розчину, а потім після перемішування суміш розділяють на 4 пробірки по 50,0 мкл, куди вносять 10,0 мкл відповідних моноклональних антитіл, пробірки перемішують, інкубують 1,0 годину в холодильнику, далі добавляють 0,9 % розчину амонію хлориду, який лізує еритроцити і проводять підрахунок на проточному лазерному цитофлуориметрі та визначають відсоток флуоресцентних клітин, які зв'язались з моноклональними антитілами, результати дослідження периферійної крові в тесті РБТЛ з ФГА та визначенням субпопуляційного вмісту певних субпопуляцій лімфоцитів заносять у таблицю.
Текст
Реферат: Спосіб визначення кількості окремих субпопуляцій лімфоцитів у реакції бластної трансформації лімфоцитів, що є методом діагностики. Після постановки реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) забирають 200,0 мкл суміші поживного середовища та клітин крові, з якими ставлять реакцію з CD-3, 4, 8, 16, 20 моноклональними антитілами, для цього до взятих клітин добавляють 200,0 мкл фізіологічного розчину, а потім після перемішування суміш розділяють на 4 пробірки по 50,0 мкл, куди вносять 10,0 мкл відповідних моноклональних антитіл, пробірки перемішують, інкубують 1,0 годину в холодильнику, далі добавляють 0,9 % розчину амонію хлориду, який лізує еритроцити і проводять підрахунок на проточному лазерному цитофлуориметрі та визначають відсоток флуоресцентних клітин, які зв'язались з моноклональними антитілами, результати дослідження периферійної крові в тесті РБТЛ з ФГА та визначенням субпопуляційного вмісту певних субпопуляцій лімфоцитів заносять у таблицю. UA 112697 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ КІЛЬКОСТІ ОКРЕМИХ СУБПОПУЛЯЦІЙ ЛІМФОЦИТІВ У РЕАКЦІЇ БЛАСТНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ ЛІМФОЦИТІВ UA 112697 U UA 112697 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме імунології, і може бути використана для діагностики стану окремих ланок імунітету. В імунологічних дослідженнях досить широко використовується для оцінки імунного статусу реакція бластної трансформації клітин крові з спеціальними міогенами, в тому числі і фітогемаглютиніном (ФГА), який є лектином простої квасолі. Суть реакції полягає в наступному. Периферичну кров людини в об'ємі 100,0 мкл вносять в стерильне середовище 199 з 10 % телячої ембріональної сироватки та 10 мкг ФГА. Цю суміш інкубують 48 годин в термостаті при 370 °C, а потім із клітин після обробки 3 % оцтовою кислотою, роблять мазки крові, фарбують їх по Романовському-Гімзі та підраховують бластоподібні лімфоїдні клітини на 100 лімфоцитів. Результати реакції визначають у відсотках бластів до кількості підрахованих лімфоцитів. У здорової людини відсоток реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) складає 50-70 %. Якщо показник менше 45 % відсотків - це свідчить про наявність порушень в імунній системі та можливий розвиток імунної недостатності - імунодефіциту. Якщо показник РБТЛ більше 70 %, то це може свідчити про надмірну активність імунної системи. Запропонований нами спосіб полягає в більш поглибленому дослідженні результатів РБТЛ, а саме визначенні характеру та кількості утворених в процесі реакції субпопуляцій лімфоцитів, а саме В лімфоцитів, Τ хелперів, Τ супресорів та натуральних кілерів, які визначаються за допомогою відповідних моноклональних антитіл CD-3,4,8,16,20. Задачею корисної моделі є поглиблене визначення здатності до активації та проліферації різних субпопуляцій лімфоцитів, а саме Τ лімфоцитів (CD-3), Τ хелперів (CD4), Τ цитотоксичних (CD-8), натуральних кілерів (CD-20) та В лімфоцитів (CD-20) при дії міогенів. Поставлена задача вирішується тим, що після постановки реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) забирають 200,0 мкл суміші поживного середовища та клітин крові, з якими ставлять реакцію з CD-3,4,8,16,20 моноклональними антитілами, для цього до взятих клітин добавляють 200,0 мкл фізіологічного розчину, а потім після перемішування суміш розділяють на 4 пробірки по 50,0 мкл, куди вносять 10,0 мкл відповідних моноклональних антитіл, пробірки перемішують, інкубують 1,0 годину в холодильнику, далі добавляють 0,9 % розчину амонію хлориду, який лізує еритроцити і проводять підрахунок на проточному лазерному цитофлуориметрі та визначають відсоток флуоресцентних клітин, які зв'язались з моноклональними антитілами, результати дослідження периферійної крові в тесті РБТЛ з ФГА та визначенням субпопуляційного вмісту певних субпопуляцій лімфоцитів заносять у таблицю. Постановка реакції баластної трансформації периферійної крові проводиться в присутності ФГА протягом 48-72 годин і по завершенні якої визначається не лише відсоток бласттрансформованих клітин, а й визначається за допомогою відповідних моноклональних антитіл CD-3,4,8,16,20 концентрацію окремих субпопуляцій лімфоцитів на основі чого визначаємо стимуляцію або гальмування певної ланки імунітету. Таким чином, оцінку імунної системи можна проводити не лише за показником відсотку бласттрансформації, а й за кількістю окремих субпопуляцій Τ і В лімфоцитів, які утворилися в процесі проліферації лімфоцитів при дії міогенів. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином. Після постановки реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) забирається 200,0 мкл суміші поживного середовища та клітин крові, з якими ставиться реакція з CD-3,4,8,16,20 моноклональними антитілами. Для цього до взятих клітин добавляють 200,0 мкл фізіологічного розчину, а потім після перемішування суміш розділяється на 4 пробірки по 50,0 мкл, куди вноситься 10,0 мкл відповідних моноклональних антитіл. Пробірки перемішуються, інкубуються 1,0 годину в холодильнику. Потім добавляється 0,9 % розчин амонію хлориду, який лізує еритроцити і проводиться підрахунок на проточному лазерному цитофлуориметрі та визначається відсоток флуоресцентних клітин, які зв'язались з моноклональними антитілами. В таблиці показані результати дослідження периферійної крові в тесті РБТЛ з ФГА та визначенням субпопуляційного вмісту певних субпопуляцій лімфоцитів. Таблиця Вміст субпопуляцій лімфоцитів після бласттрансформації n 20,0 Відсоток РБТЛ 49,3± CD-3 55,3±16,0 Вміст субпопуляцій лімфоцитів CD-4 CD-8 CD-19 43,7±15,7 45,3±22,0 57,2±13,7 1 CD-16 41,3±11,5 UA 112697 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Так, відсоток РБТЛ склав 55 %, а склад субпопуляцій був наступний: Τ лімфоцити (CD-3) 55 %, В лімфоцити (CD-20) - 42 %, Τ хелпери (CD-4) - 43,3 %, Τ супресори (CD-8) - 15,4 %, натуральних кілерів (CD-16) - 96 %. Таким чином, ми можемо визначити не один показник (відсоток бласттрансформації), а 6 показників і в залежності від порушень в цьому чи іншому відділі імунітету, можемо його діагностувати, яка ланка імунітету Τ хелпери чи Τ супресори змінена та робити заключения про наявність тих чи інших порушень імунітету. Приклади використання. 1. При дослідженні крові хворого (П-ко) з загостренням розсіяного склерозу прогредієнтний перебіг було виявлено, що в нього в РБТЛ з ФГА відсоток бласттрансформації клітин крові склав 65 %, що свідчить про активацію імунної системи, а при визначенні субпопуляцій, було встановлено, що CD-3 клітин (Т лімфоцити) було 70 %, CD-4 клітин (Т хелпери) було 65 %, CD-8 клітин (цитотоксичних клітин) було 30 %, а В лімфоцитів - 35 %. Тобто була виявлена активація CD-4 ланки імунітету, що свідчить про загострення хвороби і необхідність імуносупресивного лікування. Після курсу лікування - пульс терапія протягом 4 днів дексаметазоном, через 1 місяць було проведено повторне дослідження крові, яке виявило, що відсоток баластної трансформації склав 40 %, рівень CD-3 лімфоцитів упав до 40 %, рівень CD-4 клітин (Т хелпери) знизився до 35 %, a CD-8 клітин збільшився до 60 %, що свідчить про те, що аутоімунна реакція в організмі була подавлена і є певне пригнічення аутологічного процесу, що підтвердив задовільний стан хворого. Дослідження через 7 місяців показало, що імунна система та склад субпопуляцій у цього хворого відновився. Таким чином, можливо контролювати стан імунної системи та визначати у якій її ланці (кілерна, хелперна, цитотоксична ланка) зміни і це дає змогу правильно призначити лікування. Приклад 2. У хворого Н-ко, 36 років із злоякісною пухлиною головного мозку до операції визначали імунний статус в РБТЛ. Були такі результати: відсоток бласттрансформації - 43 %, рівень CD-3 клітин - 43 %, CD-4 клітин о 32 %, CD-8 клітин 62 %, CD-16 клітин - 16 %. Що свідчить про пригнічення CD-16 та CD-4 ланки імунітету. Після проведеного хірургічного лікування показники відновились до норми, за виключенням CD-16 клітин, що свідчить про те, що видалена пухлина знімає імуносупресію, але не повністю. Потрібно призначення інтерферонотерапії для відновлення CD-16 кілерної активності. Після 16 добового курсу лікування лаферобіоном на 2,0 млн на добу рівень CD-16 клітин відповідно до 40 %. Таким чином, запропонований метод визначення дає можливість визначення як кількості окремих субпопуляцій лімфоцитів так і їх здатності до активації та проліферації при дії ФГА. Запропонований метод має такі переваги: - дозволяє оцінювати різні ланки імунної системи, а саме Τ та В клітинну ланку, рівень Τ хелперів та цитотоксичних лімфоцитів, рівень натуральних кілерних клітин, що експресують CD16 молекулу; - дозволяє доповнити інтегральний функціональний показник - відсоток баластної трансформації лімфоцитів в тесті РБТЛ допоміжними показниками, які більш широко та глибше характеризують не лише саму кількість, а й чутливість до активації та проліферації при дії ФГА; - запропонований метод дозволяє диференціювати та різнопланово визначати стан імунної системи в цілому та її окремих ланок, наприклад пригнічення Τ клітинного імунітету, гіперактивні В ланки і т.д. Джерела інформації: 1. Валенштай Ф. Трансформация лимфоцитов. Пролиферация лимфоцитов человеческой крови, стимулированных антигенов. / В кн.: Методы изучения n vitro клеточного иммунитета. Под ред. Б. Блина и Ф. Глейда // М.: Медицина, 1974. - С. 185-197. 2. Голубов Н.Н. Методика определения лимфоцитстимулирующей активности фитогемаглютинина /В кн. Современные методы в биохимии. Под ред. Ореховича В.И. // М.: Медицина. - 1977. - С. 257-263. 3. Копелян И.И., Григорьева М.П. Разработка микромодификации культивирования клеток крови человека // Бюлл. эксперим. биологии и медицина. - 1972. - № 8. - С. 119-122. 4. Лисяный Н., Станецькая Д.Н., Гнедкова И.А. Особенности иммунных нарушений при глиобластомах, индуцированных цитомегаловирусом // Імунологія та алергологія. Наука і практика. - 2015. - № 2. - С. 5-11. 5. Фримен Г. Иммунологические методы исследования. - М.: Медицина. - 202 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 60 Спосіб визначення кількості окремих субпопуляцій лімфоцитів у реакції бластної трансформації лімфоцитів, що є методом діагностики, який відрізняється тим, що після постановки реакції 2 UA 112697 U 5 10 бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) забирають 200,0 мкл суміші поживного середовища та клітин крові, з якими ставлять реакцію з CD-3, 4, 8, 16, 20 моноклональними антитілами, для цього до взятих клітин добавляють 200,0 мкл фізіологічного розчину, а потім після перемішування суміш розділяють на 4 пробірки по 50,0 мкл, куди вносять 10,0 мкл відповідних моноклональних антитіл, пробірки перемішують, інкубують 1,0 годину в холодильнику, далі добавляють 0,9 % розчину амонію хлориду, який лізує еритроцити і проводять підрахунок на проточному лазерному цитофлуориметрі та визначають відсоток флуоресцентних клітин, які зв'язались з моноклональними антитілами, результати дослідження периферійної крові в тесті РБТЛ з ФГА та визначенням субпопуляційного вмісту певних субпопуляцій лімфоцитів заносять у таблицю. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3
ДивитисяДодаткова інформація
Автори англійськоюLisianyi Mykola Ivanovych, Potapova Antonina Ihnatiivna
Автори російськоюЛисяный Николай Иванович, Потапова Антонина Игнатьевна
МПК / Мітки
МПК: G01N 33/50
Мітки: трансформації, кількості, лімфоцитів, бластної, окремих, реакції, субпопуляцій, визначення, спосіб
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/5-112697-sposib-viznachennya-kilkosti-okremikh-subpopulyacijj-limfocitiv-u-reakci-blastno-transformaci-limfocitiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб визначення кількості окремих субпопуляцій лімфоцитів у реакції бластної трансформації лімфоцитів</a>
Наступний патент: Пристрій для реєстрації вестибулярних викликаних потенціалів
Випадковий патент: Широкомовна передача із змінною швидкістю з м'якою передачею обслуговування