Спосіб визначення оксидативного стресу в програмах допоміжних репродуктивних технологій

Реферат: Спосіб визначення оксидативного стресу в програмах допоміжних репродуктивних технологій, який включає оцінку показників оксидативного стресу по концентрації 8-ізопростану в сироватці крові. Додатково виявляють ступінь природного антиоксидантного захисту організму. Як маркер оксидативного стресу вибирають показник концентрації 8-ізопростану. Як маркер природного антиоксидантного захисту організму - показник концентрації мелатоніну в сироватці крові і в фолікулярній рідині. Визначають показники концентрації 8-ізопростану і мелатоніну в сироватці крові на вихідному етапі дослідження. Якщо ці показники перевищують аналогічні у здорових людей (норма), констатують наявність оксидативного стресу і вважають недоцільним проведення контрольованої оваріальної стимуляції (КОС). Якщо показники не перевищують норми, проводять КОС, потім повторно визначають показники 8-ізопростану і мелатоніну в сироватці крові. Якщо показники 8-ізопростану в сироватці крові перевищують вихідні показники, констатують наявність оксидативного стресу і високу імовірність отримання ооцитів низької якості. Потім проводять трансвагінальну пункцію, визначають показники 8-ізопростану і мелатоніну в фолікулярній рідині і якщо ці показники перевищують вихідні показники, імовірність отримання ооцитів низької якості вважать підтвердженою, а виконання ембріотрансферу недоцільним. UA 112968 U (12) UA 112968 U UA 112968 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до акушерства та гінекології, і може бути використана в протоколах контрольованої оваріальної стимуляції (КОС) при екстракорпоральному заплідненні (ЕКЗ) для контролю доцільності призначення КОС, а також для оцінки імовірності отримання ооцитів високої якості після КОС. Згідно з статистичними даними максимальна частота настання вагітності в програмах ЕКЗ, тобто запліднення in vitro, досягається при отриманні 11-15 ооцитів достатньої якості. Для підвищення ефективності цього процесу як етапу ЕКЗ або інтрацитоплазматичної ін'єкції сперматозоїду (ІКСІ) проводять контрольовану оваріальну стимуляцію (КОС). В процесі КОС відбувається медикаментозний вплив на фолікулярний апарат з метою формування фолікулярного пулу. Результативність запліднення є суттєво вищою в стимульованих циклах у порівнянні з ЕКЗ в природному циклі, оскільки навіть при нормальних метаболічних процесах в яйцеклітині серед побічних продуктів є цілий ряд таких, що мають оксидативні властивості, які є мембраноруйнівним фактором. Серед них головне місце належить так званим "активним формам кисню" (АФК), до яких належать супероксидний радикал (О2), гідроксильний радикал (ОН), оксид азоту (NO-), пероксинітрит (ONOO-), перекис водню (Н2О2), гіпохлорна кислота (HOCl). Вони є цитотоксичними. Перекисне окислення ліпідів - нормальний фізіологічний процес, але його інтенсивність різко підвищується при патологічних станах. Щодо оксидативного стресу (ОС), навіть при мінімальних проявах, то генерація вільних радикалів при ньому підвищується в десятки разів і супроводжується руйнівною цитотоксичною дією, активацією апоптозу. На противагу вільнорадикальним процесам в організмі існує антиоксидантна система (АОС), яка є сукупністю захисних механізмів клітин, тканин, органів і систем, що спрямована на збереження і підтримку гомеостазу в організмі. Рівновага між цими двома протилежними складовими в стані фізіологічного оптимуму утримує організм від розвитку ланцюгового окислювального процесу. Дисбаланс між оксидантною та антиоксидантною системами призводить до оксидативного стресу. Вивчення показників оксидативного стресу дозволяє розкрити патогенез багатьох патологічних процесів, оцінити ступінь ризику їх виникнення, прогнозувати особливості перебігу захворювання. Відомий спосіб визначення оксидативного стресу, описаний в статті М.В. Заика, О.Η. Ковалева "8-изопростан как маркер оксидантного стресса у больных с хронической сердечной недостаточностью" (див. Український кардіологічний журнал, - 2006. - №4. - С.55-57). Він включає дослідження показників оксидативного стресу визначенням рівня концентрації 8ізопростану в сироватці крові, а також в сечі хворого при надходженні хворого в стаціонар. Спосіб дозволяє виявити наявність оксидативного стресу та зробити прогноз подальшого перебігу хронічної серцевої недостатності, оскільки рівень 8-ізопростану прямо корелює з функціональним класом хвороби. Але він дозволяє оцінити компенсаторні можливості організму лише побічно, за ступенем розвитку оксидативного стресу. Слід також додати, що оцінка показника проводилась удалині від патогенних осередків. Тому спосіб не є достатньо інформативним. Найбільш близьким аналогом до запропонованої корисної моделі є спосіб визначення оксидативного стресу, описаний в статті Корнилова Н.Ю., Герасимчук У.С., Герасимчук Н.Н. "8изопростан, как главный биологический маркер оксидативного стресса у больных бронхолегочной патологии" (див. Сучасні методи дослідження в пульмонології: наукова конференція молодих вчених та студентів, присвячена 210-річчю ХНМУ. - Харків. - 25.11.2014. 2014. - С. 30-32). Він включає визначення рівня 8-ізопростану в сироватці крові хворого як показника оксидативного стресу і біомаркера активності запалення. Спосіб дозволяє виявляти наявність оксидативного стресу у хворих з бронхо-легеневою патологією. Але у випадку ДРТ він не є досить інформативним, оскільки, згідно з останніми дослідженнями, при дозріванні яйцеклітини в фолікулярній рідині відбувається активація окислювальних процесів, а при індукції суперовуляції перекисне окислення ліпідів і білків збільшується в десятки разів. Перекисне окислення пов'язане з утворенням цілого ряду реакційно здатних форм кисню, що мають широкий спектр руйнівної дії (цитотоксична дія, активація апоптозу). Тобто визначення рівня 8-ізопростану лише в сироватці крові недостатньо для характеристики процесів, які відбуваються при ДРТ. В той же час для запобігання шкідливої дії реакційно здатних форм кисню і підтримки клітинного гомеостазу в організмі функціонує антиоксидантна система (АОС), яка протидіє руйнівним процесам на всіх рівнях організації: від клітинних мембран до організму в цілому. Але її вплив в способі-протипі не оцінюється, притому саме при дисбалансі між активністю процесів перекисного окислення і системою АОС виникає оксидативний стрес (ОС). На сучасному етапі під терміном "оксидативний стрес" (ОС) розуміють стан, при якому кількість вільних радикалів, 1 UA 112968 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що утворюються в організмі, суттєво перевищує активність ендогенних антиоксидантних систем, які забезпечують їх елімінацію. Також оцінку оксидативного стресу проводять не безпосередньо в місці локалізації патогенного процесу. В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу оцінки наявності оксидативного стресу при ДРТ та можливості його корекції, який має підвищену інформативність за рахунок оцінки балансу між активністю процесів перекисного окислення і функціонування антиоксидантної системи (АОС) у всіх ланках процесу штучного запліднення та на всіх його послідовних етапах. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення оксидативного стресу в програмах допоміжних репродуктивних технологій, який включає дослідження показників оксидативного стресу визначенням рівня концентрації 8-ізопростану в сироватці крові хворого, згідно з корисною моделлю, додатково виявляють ступінь природного антиоксидантного захисту організму, причому як додатковий маркер оксидативного стресу вибирають показник концентрації 8-ізопростану в фолікулярній рідині, а як маркер природного антиоксидантного захисту організму - показник концентрації мелатоніну в сироватці крові і в фолікулярній рідині; при цьому визначають показники концентрації 8-ізопростану і мелатоніну в сироватці крові на вихідному етапі дослідження і якщо ці показники перевищують аналогічні у здорових людей (норма), констатують наявність оксидативного стресу та вважають недоцільним проведення контрольованої оваріальної стимуляції (КОС); якщо показники не перевищують норми, проводять КОС, потім повторно визначають показники 8-ізопростану і мелатоніну в сироватці крові, якщо при цьому показники концентрації 8-ізопростану в сироватці крові перевищують вихідні показники, констатують наявність оксидативного стресу і високу імовірність отримання ооцитів низької якості; потім проводять трансвагінальну пункцію, визначають показники 8ізопростану і мелатоніну в фолікулярній рідині, отриманої з кожного фолікула після вилучення ооцитів, і якщо ці показники перевищують вихідні показники, імовірність отримання ооцитів низької якості вважать підтвердженою, а виконання ембріотрансферу недоцільним. Визначення ступеня природного антиоксидантного захисту організму дозволяє по їх характерним маркерам урахувати всі основні складові процесу, що відбувається в організмі як перед, так і при КОС. А послідовність дій способу дозволяє виявити, на якій саме ланці процесу відбувається збій. Вибір способу визначення оксидативного стресу в програмах ДРТ оснований на відборі більш точних та відносно стійких біохімічних продуктів, які можуть виступати маркерами роботи АОС та оксидативного стресу. Вибирання концентрації 8-ізопростану для дослідження показників оксидативного стресу обумовлено тим, що він є біомаркером активності клітинних ефектів оксидативного стресу. 8Ізопростан є продуктом метаболізму в реакціях перекисного окислення арахідонової кислоти, ізомерний простагландину F2, і його рівень корелює з рівнем утворених вільних радикалів і тяжкістю захворювання. Перевірка його наявності як в сироватці крові, так і в фолікулярній рідині більш точно формує уявлення про характер та ступінь оксидативних порушень на рівні фолікулярного апарату. Вибирання показника концентрації мелатоніну маркером природного антиоксидантного захисту організму в сироватці крові і в фолікулярній рідині дозволяє по його рівню виявити відповідь на оксидативні порушення з боку антиоксидантної системи організму. Мелатонін є найбільш сильним із відомих ендогенних поглиначів вільних радикалів. До того ж, він визначається у вищій, ніж у сироватці крові концентрації у фолікулярній рідині, що підкреслює його важливу роль як інгібітора вільних радикалів саме для процесу штучного запліднення. Заявнику невідомі приклади способів з одночасним використанням обох маркерів активності оксидантної та антиоксидантної систем, притому не тільки в судинному руслі, а й в фолікулярній рідині для визначення ступеня оксидативних порушень на рівні фолікулярного апарату. Спосіб реалізують наступним чином. На вихідному етапі дослідження у пацієнток з безпліддям беруть кров з кубітальної вени в 6.00 ранку натще перед протоколом оваріальної стимуляції. Одномоментно проводять набір крові для визначення концентрації 8-ізопростану. Визначають показники концентрації 8ізопростану і мелатоніну в сироватці крові імуноферментними методами, наприклад, з використанням наборів Melatonin ELISA Kit, 8-Isoprostane EIA Kit, IBL (Німеччина). Якщо ці показники перевищують аналогічні у здорових людей (норма), констатують наявність оксидативного стресу і вважають недоцільним проведення контрольованої оваріальної стимуляції (КОС). Якщо показники не перевищують норми, проводять КОС, потім повторно визначають показники 8-ізопростану і мелатоніну в сироватці крові за аналогічною методикою. 2 UA 112968 U 5 10 15 Якщо показники 8-ізопростану в сироватці крові перевищують вихідні показники, констатують наявність оксидативного стресу і високу імовірність отримання ооцитів низької якості. Потім проводять трансвагінальну пункцію, аспірують вміст фолікулів (дозрілі ооцити та фолікулярну рідину) і одночасно визначають показники 8-ізопростану і мелатоніну в фолікулярній рідині після вилучення з неї ооцитів. Якщо ці показники перевищують вихідні показники, імовірність отримання ооцитів низької якості (а в подальшому і ембріонів) вважать підтвердженою, а виконання ембріотрансферу недоцільним. Таким чином, здійснення способу за корисною моделлю дозволяє отримати достатньо інформативні дані для оцінки наявності оксидативного стресу при ДРТ та можливості його корекції у всіх ланках процесу штучного запліднення та на всіх послідовних етапах КОС. Ефективність способу доведена клініко-експериментальними дослідженнями, в яких взяло участь 96 жінок репродуктивного віку без супутньої соматичної патології з показаннями до застосування методик ДРТ. Спостерігалося покращення ефективності застосування методик ДРТ у хворих на безпліддя жінок з низьким оваріальним резервом та високими показниками оксидативного стресу у вигляді збільшення кількості якісних ооцитів після КОС майже в 2,5 рази. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 30 35 Спосіб визначення оксидативного стресу в програмах допоміжних репродуктивних технологій, який включає оцінку показників оксидативного стресу по концентрації 8-ізопростану в сироватці крові, який відрізняється тим, що додатково виявляють ступінь природного антиоксидантного захисту організму, причому як маркер оксидативного стресу вибирають показник концентрації 8ізопростану, а як маркер природного антиоксидантного захисту організму - показник концентрації мелатоніну в сироватці крові і в фолікулярній рідині; при цьому визначають показники концентрації 8-ізопростану і мелатоніну в сироватці крові на вихідному етапі дослідження, якщо ці показники перевищують аналогічні у здорових людей (норма), констатують наявність оксидативного стресу і вважають недоцільним проведення контрольованої оваріальної стимуляції (КОС), якщо показники не перевищують норми, проводять КОС, потім повторно визначають показники 8-ізопростану і мелатоніну в сироватці крові, якщо показники 8-ізопростану в сироватці крові перевищують вихідні показники, констатують наявність оксидативного стресу і високу імовірність отримання ооцитів низької якості; потім проводять трансвагінальну пункцію, визначають показники 8-ізопростану і мелатоніну в фолікулярній рідині і якщо ці показники перевищують вихідні показники, імовірність отримання ооцитів низької якості вважать підтвердженою, а виконання ембріотрансферу недоцільним. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3