Спосіб діагностики та визначення тяжкості і типу перебігу розсіяного склерозу на ранній стадії захворювання

Реферат: Спосіб діагностики розсіяного склерозу включає лабораторні дослідження крові хворих та визначення рівня мікрофіламентів. При цьому шляхом послідовного осадження сироваткових білків, електрофорезу та цифрового аналізу одержаних електрофореграм у сироватці крові хворих на розсіяний склероз визначають вміст неконвенційного міозину 1с (Муо 1с), і за його присутності підтверджують діагноз розсіяного склерозу на ранній стадії захворювання. За рівнем Муо 1с визначають тяжкість та тип перебігу захворювання: при високому (більше 8 мкг/мл) рівні Муо 1с - рецидивуючо-ремітуючий тип перебігу розсіяного склерозу з мінімальною неврологічною симптоматикою та низьким ступенем інвалідності, а при низькому (менше 0,01 мкг/мл) рівні Муо 1с - вторинно-прогресуючий тип перебігу з вищим рівнем інвалідності. UA 114894 U (12) UA 114894 U UA 114894 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, зокрема до неврології, і може бути використана для діагностики розсіяного склерозу на ранній стадії захворювання, коли неврологічних проявів хвороби обмаль та ступінь інвалідності пацієнтів є мінімальним. Діагностика розсіяного склерозу ґрунтується на клініко-неврологічних, інструментальних та лабораторних методах. Серед інструментальних методів діагностики магнітно-резонансна томографія (МРТ) головного та спинного мозку має вирішальне значення [Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н. Разсеяный склероз. - М.: Медпресс-информ, 2012. - С. 86-97]. Основними недоліками даного методу є його недостатня специфічність та висока ціна. Окрім цього МРТ ознаки (кількість, розміри і локалізація вогнищ) слабко корелюють із клінічним перебігом хвороби. Іншим інструментальним методом діагностики розсіяного склерозу є визначення викликаних потенціалів [Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н. Разсеяный склероз. - М.: Медпресс-информ, 2012. - С. 9799]. Однак цей метод дозволяє виявляти лише локалізацію патологічного процесу, а не його характер. Він не придатний для визначення загальної активності чи тяжкості розсіяного склерозу, а подібні зміни можуть також спостерігатися при інших захворюваннях. Враховуючи те, що розсіяний склероз є автоімунним захворюванням, перспективним напрямом у діагностиці та прогнозуванні даної патології є використання лабораторних імунологічних методів. Найпоширенішим та статистично обґрунтованим лабораторним методом є визначення рівнів олігоклональних антитіл (імуноглобулінів класу G) у цереброспінальній рідині, а також IgG індексу (співвідношення лікворного до сироваткового рівнів IgG) [Шмидт Т.E., Яхно H.H. Разсеяный склероз. - М.: Медпресс-информ, 2012. - С. 99-101]. Однак цей метод лише підтверджує діагноз, але не використовується самостійно для встановлення діагнозу розсіяного склерозу. Окрім цього він достатньо інвазивний, адже вимагає люмбальної пункції, не відображає клінічного перебігу захворювання та є високовартісним. На додаток, олігоклональні імуноглобуліни G визначаються і при інших запальних та імунологічних захворюваннях. За останні роки знайдено багато потенційних біомаркерів при розсіяному склерозі, однак лише деякі з них мають доказову прогностичну цінність. Окрім цього більшість з цих біомаркерів є маркерами загальною запалення, тобто не є специфічними для розсіяного склерозу. Найближчим аналогом корисної моделі прийнято відомий спосіб діагностики розсіяного склерозу, що включає виявлення збільшення концентрації мікрофіламентів у лікворі хворих на розсіяний склероз, а також встановлення їх чіткого зв'язку із стадійністю хвороби [Intense Inflammation and Nerve Damage in Early Multiple Sclerosis Subsides at Older Age: A Reflection by Cerebrospinal Fluid Biomarkers / Mohsen Khademi, Ann M. Dring, Jonathan I). Gilthorpe [el al.] // PLOS ONE. - 2013. - Vol. 8, № 5. - P. e63172]. Серед недоліків найближчого аналога звертають на себе увагу недостатньо висока специфічність методу та складна методика забору біологічного матеріалу. Окрім цього автори даної роботи не ставили за мету оцінити залежності рівнів мікрофіламентів та клінічного перебігу розсіяного склерозу (характеристики дебюту, активності хвороби, рівня інвалідності хворих). В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб діагностики розсіяного склерозу шляхом оцінки залежності рівнів мікрофіламентів та визначення клінічного перебігу захворювання, чим буде досягнута можливість як раннього встановлення діагнозу розсіяного склерозу, так і визначення тяжкості та типу перебігу патологічного процесу. Поставлену задачу вирішують тим, що у способі діагностики розсіяного склерозу, що включає лабораторні дослідження крові хворих та визначення рівня мікрофіламентів, згідно з корисною моделлю, шляхом послідовного осадження сироваткових білків, електрофорезу та цифрового аналізу одержаних електрофореграм у сироватці крові хворих на розсіяний склероз визначають вміст неконвенційного міозину 1с (Муо 1с) - специфічного білка, що входить до складу мікрофіламентів, і за його присутності підтверджують діагноз розсіяного склерозу на ранній стадії захворювання, а за рівнем Муо 1с визначають тяжкість та тип перебігу захворювання: при високому (більше 8 мкг/мл) рівні Муо 1с - рецидивуючо-ремітуючий тип перебігу розсіяного склерозу з мінімальною неврологічною симптоматикою та низьким ступенем інвалідності, а при низькому (менше 0,01 мкг/мл) рівні Муо 1с - вторинно-прогресуючий тип перебігу з вищим рівнем інвалідності. Суть корисної моделі полягає в тому, що за детекцією Муо 1с у сироватці крові підтверджують діагноз розсіяного склерозу, а за його рівнем визначають тяжкість та тип перебігу захворювання: при високому (більше 8 мкг/мл) рівні Муо 1с рецидивуючо-ремітуючий тип перебіг розсіяного склерозу з мінімальною неврологічною симптоматикою та низьким ступенем інвалідності, а при низькому (менше 0,01 мкг/мл) рівні Муо 1с вторинно-прогресуючий тип перебігу з вищим рівнем інвалідності. 1 UA 114894 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявником було виявлено та ідентифіковано у сироватці крові хворих на розсіяний склероз специфічний білок неконвенційний міозин 1с (Муо 1с). Цей білок, разом з іншими ізоформами міозину, формує надсімейство актин-залежних молекулярних субодиниць, що згруповані в 17 класів на основі послідовностей їх каталітичних доменів [Gillespie PG, Albanesi JP, Bahler M. Bement WM. et al. Myosin-1 nomenclature // J Cell Biol. - 2001. - Vol. 155-P. 703-704]. Муо 1с входить до складу мікрофіламентів цитоскелету багатьох видів клітин, але найбільшу його кількість було виявлено у фібробластах, нирковому епітелії та нейроендокринних клітинах [Barbara Barylko, Gwanghyun Jung and Joseph P. Albanesi. Structure, function, and regulation of myosin 1С // Acta Biochimica Polonica. - 2005. - Vol. 52. № 1. - P. 373 380]. Міозин 1с має ряд важливих функцій, серед яких участь у транспортуванні глюкози через клітинні мембрани, стабілізація мембран стереоцилій. Він задіяний в процесах росту нейрональних відростків, бере участь в процесах росту, дозрівання та виділення В-лімфоцитів, і завдяки цьому відіграє роль в імунологічному синапсі та презентації антигенів [Jose' L. Maravillas-Montero, Peter G. Gillespie, Genaro Patino-Lo'pez. Stephen Shaw, et al. Myosin 1c participates in В cell cytoskeieton rearrangements, is recruited to the immunologic synapse, and contributes to antigen presentation // J of Immunology. - 2011. - Print ISSN: 0022-1767 Online ISSN: 1550-6606]. Спосіб діагностики здійснюють наступним чином. У пацієнта з периферійної вени здійснюють забір крові та готують сироватку, яку зберігають при температурі -20 °C протягом 1 місяця. Безпосередньо перед виконанням досліджень сироватку розморожують при кімнатній температурі. 0,15 мл сироватки крові розводять фосфатним сольовим буфером (рН 7,4) у співвідношенні 1:2. До одержаного розчину додають 0,03 мл 100 % трихлороцтової кислоти (ТХО), після чого витримують 30 хвилин на льоді. ТХО-нерозчинні білки осаджують центрифугуванням при 10 000 g впродовж 10 хвилин. ТХО-розчинну фракцію (0,3 мл) переносять у 2-мілілітрову пробірку типу "Ependorf" і до неї додають 1,5 мл 100 % ацетону (у співвідношенні 1:6). Розчин перемішують та інкубують впродовж 2 годин при температурі -20 °C. Одержані ТХО-розчинні білки осаджують центрифугуванням при 10 000 g впродовж 30 хвилин і піддають електрофорезу у 12 % поліакриламідному гелі за присутності 0,1 % додецилсульфату натрію. Присутність 48 кДа ізоформи неконвенційного міозину 1С визначають за його молекулярною масою після фарбування поліакриламідного гелю 0,05 % фарбою Coomassie BBR-250 впродовж 60 хвилин. Як стандарт молекулярних мас використовують набір білків фірми "Fermentas" (Литва). Отримані електрофореграми сканують і оцифровують за допомогою спеціалізованого програмного забезпечення (Gel-Pro Analyzer, Media Cybernetics. I.P.). Рівень Муо 1с у зразку визначають за калібрувальною кривою, отриманою при оцифруванні забарвлених смуг альбуміну сироватки крові бика з відомою кількістю білка, який використовувався як стандарт. За рівнем Муо 1с визначають тяжкість та тип перебігу захворювання: при високому (більше 8 мкг/мл) рівні Муо 1с - рецидивуючо-ремітуючий тип перебігу розсіяного склерозу з мінімальною неврологічною симптоматикою та низьким ступенем інвалідності, а при низькому (менше 0,01 мкг/мл) рівні Муо 1с - вторинно-прогресуючий тип перебігу з нижчим рівнем інвалідності. Пропонований спосіб діагностики розсіяного склерозу і визначення тяжкості його перебігу пропрацьовано у Львівському обласному науковому центрі з вивчення проблем розсіяною склерозу та інших демієлінізуючих захворювань, що знаходиться на базі Львівської обласної клінічної лікарні, та у відділі регуляції проліферації клітин і апоптозу Інституту біології клітини НАН України. В обстеженні взяли участь 61 пацієнт з розсіяним склерозом, з перевагою жінок (70,5 %, n=43). Вік обстежених пацієнтів коливався від 19 до 57 років, середній вік становив 36,6±1,4 років. Більшість хворих була з рецидивуючо-ремітуючим перебігом розсіяного склерозу (82,0 %, n=50), а найменше - з первинно-прогресуючим (1,6 %). n=1), в дебюті цього захворювання знаходилося 4,9 % (n=3) пацієнтів, з вторинно-прогресуючим 11,5 % (n=7). Середній вік дебюту хвороби становив 29,0±1,2 років. Середня тривалість захворювання становила 7,6±0,9 років. Усіх хворих поділили на 3 групи в залежності від рівня Муо 1с у сироватці крові. У першій групі показник рівня Муо 1с був меншим 0,01 мкг/мл (низький рівень), у другій групі становив 0,01-8 мкг/мл (середній рівень) і у третій - був більшим 8 мкг/мл (високий рівень), Одержані результати порівнювали із результатами контрольної групи, яку сформували 20 практично здорових осіб, середній вік яких становив 33,2±2,2 роки. У ході даної роботи використовувались наступні методи: клінічні - вивчення скарг, анамнезу хвороби та життя, клініко-неврологічний огляд й оцінка неврологічного дефіциту за шкалою Expanded Disability Status Scale (EDSS): лабораторні - імунобіологічне дослідження крові (визначення вмісту Муо 1с); інструментальні - магнітно-резонансна томографія головного та спинного мозку; статистичні - для проведення статистичного аналізу отриманих даних було 2 UA 114894 U 5 10 15 20 25 30 35 40 розроблено аналітичні таблиці в програмі Microsoft Excel, у які вносились зібрані первинні дані. Ця програма слугувала основною платформою, у якій здійснювалось більшість статистичних розрахунків. Складніші математичні розрахунки виконувались в програмі Statistica. В ході дослідження було з'ясовано, що у сироватці крові хворих на розсіяний склероз присутній специфічний білок Муо 1с, а його рівень виявився достовірно вищим, порівняно із групою практично здорових донорів (3,4±1,6 мкг/мл та 0,3±0,1 мкг/мл відповідно) (р