Спосіб збільшення чутливості бактерій у складі біоплівки до амінопеніцилінів in vitro

Реферат: Спосіб збільшення чутливості бактерій у складі біоплівки до амінопеніцилінів in vitro шляхом додавання до амінопеніцилінів ферментів, причому як фермент використовуються протеази. UA 120639 U (54) СПОСІБ ЗБІЛЬШЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ БАКТЕРІЙ У СКЛАДІ БІОПЛІВКИ ДО АМІНОПЕНІЦИЛІНІВ IN VITRO UA 120639 U UA 120639 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, зокрема до педіатрії та мікробіології, і призначена для покращення ефективності дії амінопеніцилінів на бактерії у складі біоплівки in vitro шляхом додавання ферментів протеаз. На сучасному етапі, підвищення антибіотикорезистентності та розвиток бактеріальних біоплівок є основними проблемами в лікуванні інфекцій сечових шляхів у дітей. Контент-аналіз електронної бази наукових видань ScinceDirect демонструє невпинний ріст публікацій статей, в ключових словах яких, фігурує термін "biofilm" (біоплівка). Так, в 1991 році цей термін в наукових статтях взагалі не використовувався, в 2000 році знаходимо близько 50 посилань, а в 2011 р. - майже 300 статей [3]. Відомо, що більше 90 % усіх відомих бактерій формують біоплівки, серед збудників інфекцій людини близько 80 % здатні утворювати біоплівки [3, 12]. Понад 60 % усіх внутрішньолікарняних інфекцій є результатом діяльності мікроорганізмів, що перебувають всередині біоплівки [2]. Біоплівки різних мікроорганізмів мають подібний тип будови. Так, біоплівка складається з бактерій та міжклітинного матриксу, в якому виділяють поверхневу оболонку, яка обмежує біоплівку від оточуючого середовища [5, 9]. До складу поверхневої оболонки та матриксу біоплівок входять білки, полісахариди, ліпіди та нуклеїнові кислоти (ДНК та РНК) [10,11]. Формування біоплівки складний, багатоетапний процес. Утворення плівки починається з оборотного прикріплення бактерій до поверхні [1]. Адгезія відбувається за рахунок неспецифічних (хімічні зв'язки, наявність глікокаліксу) та специфічних механізмів (взаємодія рецепторів епітеліальних клітин зі специфічними адгезинами) [6]. Наступною фазою генерації плівки є перманентне прилипання до поверхні з подальшим формуванням слизового захисного матриксу біоплівки. Важливу роль у перманентній адгезії бактерій відіграють пілії IV типу [13]. Продемонстровано, що бактерії, які не здатні утворювати пілії, не формують біоплівку [8]. Завершальною фазою біоплівкоутворення є фаза дисперсії, протягом якої від зрілої плівки періодично відокремлюються окремі клітини, які контамінують нові поверхні [7], Перебування бактерій у біоплівці дозволяє мікроорганізмам збільшувати толерантність до імунної системи хазяїна (антитіла, фагоцитоз), антимікробних агентів (антибіотики, антисептики, дезінфектанти), а також до обмежень у кисні, харчуванні [1]. Стійкість біоплівок пояснюються наявністю бактерій "персистерів". Антибіотики не вбивають клітину, а пошкоджують її, запускаючи механізм апоптозу. Розвиток резистентності пояснюється інгібуванням механізму апоптозу у субпопуляціях клітин [4]. Спостерігається різна ефективність антибіотиків відносно бактерій всередині біоплівки в залежності від їх здатності проникати крізь ліпідні бар'єри. Таким чином, актуальність дослідження полягає в широкому розповсюдженні проблеми формування біоплівок збудниками інфекцій сечовивідних шляхів у дітей та недостатніми даними щодо ефективності впливу антибактеріальних препаратів на біоплівки. Найбільш близьким до способу, що заявляється, вибраний як прототип, є спосіб впливу антимікробної речовини левофлоксацину з ферментом ДНКазою на збудників у складі біоплівки [14]. Недоліком цього способу є використання препарату левофлоксацин, який дозволений для лікування інфекцій сечовивідних шляхів у дітей тільки з 12 років, а також вартість ферменту ДНКази. В основу корисної моделі поставлена розробка способу підвищення чутливості бактерій у складі біоплівки до амінопеніцилінів шляхом додавання ферментів протеаз. Технічний результат, що вирішується, буде полягати в підвищенні ефективності дії амінопеніцилінів. Поставлена задача вирішується тим, що збільшення чутливості бактерій у складі біоплівки до амінопеніцилінів in vitro здійсняється шляхом додавання до амінопеніцилінів ферментів протеаз. Основною відмінністю способу, що заявляється, є визначення дії амоксициліну на біоплівочні та планктонні форми бактерій у комбінації з протеазою. Спосіб здійснюють таким чином. Досліджено 8 клінічних ізолятів бактерій, виділених від дітей, що мали клінічні ознаки гострого пієлонефриту та дітей, що мали безсимптомну бактерійурію, та 2 лабораторні штами (E.coli K12, S. aureus). Інтенсивність біоплівкоутворення була визначена у бактерій, що були виділені у дітей з інфекціями сечовивідних шляхів, за допомогою стандартного методу аналізу біоплівок з використанням 96-луночних мікропланшетів. Мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) антибіотиків для планктонних форм бактерій була визначена методом серійних розведень хіміопрепарату. МІК протимікробних препаратів для бактерій у біоплівці визначалася методом серійних розведень після отримання біоплівки методом мікропланшетів. Інтенсивність 1 UA 120639 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 плівкоутворення (ІП) оцінювалася за показниками оптичної щільності (ОЩ) досліджуваних зразків бактеріальної плівки. Усі збудники були здатні до формування біоплівок. Серед досліджуваних антибіотиків найбільшу ефективність мав амінопеніцилін - амоксицилін: МІК - 0,0003 мг/л. Було перевірено ефективність антибіотиків, на бактерії, що сформували біоплівку протягом 24 годин. Бактерії у складі біоплівки стали стійкішими до амоксициліну у 100 разів (МІК - 0,03 мг/л). Чутливість лабораторних штамів бактерій до вказаних антимікробних препаратів була вищою і зменшувалася у біоплівкових форм так само як і у клінічних ізолятів. МІК амоксициліну відносно бактерій у складі біоплівки склало - 0,003 мг/л при додаванні протеаз, які окремо не справляли бактеріостатичного ефекту. Отже, комбінація протеази з амоксициліном збільшує чутливість біоплівкових форм бактерій до антибіотика у 10 разів, в порівнянні з використанням амоксициліна без протеаз, таким чином використання протеази підвищить ефективність дії амоксциліну на бактерії у складі біоплівки. Спосіб, що заявляється, був апробований на базі кафедри мікробіології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. Джерела інформації: 1. Афиногенова А.Г. Микробные биопленки ран: состояние вопроса / А. Г. Афиногенова, Е. Н. Даровская. //Травматология и ортопедия России. - 2011. - № 3. - С. 119-125. 2. Визначення протимікробної дії препарату гатимак на планктонні клітини та біоплівки штамів Staphylococcusaureusinvitro / А.Я. Циганенко, О.В. Лупай, М.М. Мішина, С.М. Граматюк. // Експериментальна і клінічна медицина. - 2012. - С. 11-13. 3. Лямин А.В. Методы выявления биопленок в медицине: возможности и перспективы / А.В. Лямин, Е.А. Боткин, А.В. Жестков. // Болезни и возбудители. - 2012. - С. 17-22. 4. Окулич В.К. Роль микробных биопенок в патогенезе инфекционных процессов на современном этапе / В.К. Окулич, Ф.В. Плотников, А.А. Кабанов. // Иммунология, аллергология, инфектология. - 2012. - С. 70-82. 5. Особенности совместного действия левофлоксацина и днказы на биопленки возбудителей урогенитальных инфекций / Г.В. Тец, Н.В. Артеменко, Н.К. Заславська, Н.К. Тец. // Урология. - 2012. - № 1. - С. 21-24. 6. Пространственно-временная модель формирования биопленки полости рта: взаимосвязь процессов первичной адгезии и микробной колонизации / В.Н.Царёв, А.Г. Трефилов, Г.Н. Клейменова, А.В. Левкин. // Терапевтическая стоматология. - 2012. - С. 12-14. 7. Чеботарь И.В. Механизмы антибиопленочного иммунитета / И.В. Чеботарь. // Вестник Российской Академии медицинских наук. - 2012. - С. 22-29. 8. Vodianyk A.A. Intensity of biofilm formation by urinary tract pathogens in children / A. A. Vodianyk. // Book of Abstracts 22 International Student Congressof (Bio)MedicalSciences. -2015.-P. 393. 9. Tetz VV, Korobov V.P., Artemenko N.K., Lemkina L.M., Panjkova N.V., Tetz G.V. Extracellular phospholipids of isolated bacterial communities Biofilms 2004; 1:149-55. 10. Sutherland IW. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology 2001;147:3-9. 11. Sponza DT Investigation of extracellular polymer substances (EPS) and physicochemical properties of different activated sludge floes under steady-state conditions. Enzyme Microb Technol 2003; 32: 375-85. 12. Soto S. M. Importance of biofilms in urinary tract infections: new therapeutic approaches / Soto. //Advacesin Biology. - 2014. – С. 13 13. O'Toole, G.A. andKolter, R. (1998), Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Molecular Microbiology, 30: 295-304. doi:10.1046/j.1365-2958.1998.01062.x 14. Особенности совместного действия левофлоксацина и днказы на биопленки возбудителей урогенитальных инфекций / Г.В. Тец, Н.В. Артеменко, Н.К. Заславська, Н.К. Тец. // Урология. - 2012. - №1. - С. 21-24. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб збільшення чутливості бактерій у складі біоплівки до амінопеніцилінів in vitro шляхом додавання до амінопеніцилінів ферментів, який відрізняється тим, що як фермент використовуються протеази. 2 UA 120639 U Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3