Спосіб прогнозування канцер-специфічного виживання після проведення нефректомії у хворих із нирково-клітинним раком за допомогою молекулярного біомаркера мікрорнк-15а в тканинах пухлини

Реферат: Спосіб прогнозування канцер-специфічного виживання після проведення нефректомії у хворих із нирково-клітинним раком за допомогою молекулярного біомаркера, при якому виконують визначення експресії генетичного молекулярного біомаркера. Проводять виділення РНК, зворотну транскрипцію та полімеразну ланцюгову реакцію у peaльному часі для визначення експресії молекулярного біомаркера мікроРНК-15а в тканинах пухлини та за отриманими показниками прогнозують виживання хворих із нирково-клітинним раком. UA 120883 U (12) UA 120883 U UA 120883 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, зокрема урології, і може бути застосована для підвищення точності прогнозування перебігу нирково-клітинного раку у хворих після радикальної чи парціальної нефректомії. Нирково-клітинний рак (НКР) складає близько 3 % серед злоякісних пухлин дорослого населення. В онкоурології цей вид новоутворень займає третє місце після раку передміхурової залози і сечового міхура [Федоренко З.П., Михайлович Ю.Й., Гулак Л.О., Рак в Україні. 2014 2015. / Бюл. нац. канцер-реєстру України № 17. - Київ, 2015. С. 56-57]. Нe зважаючи на широке застосування сучасних методів діагностики і лікування захворюваність і смертність на НКР в Україні і всьому світі невпинно зростають [Pierorazio PhillipM., Michael Н. et al. Management of Renal Masses and Localized Renal Cancer: Systematic Review and Meta-Analysis. The Journal of Urology. № 4. Vol. 196. 2016. P. 989-99]. Перебіг захворювання та прогноз хворого із НКР залежить від низки факторів, серед яких, згідно з Рекомендаціями Європейської Асоціації Урології, виділяють анатомічні, гістологічні, клінічні та молекулярні. До анатомічних факторів відносять TNM-класифікацію American Joint Committeeon Cancer; до гістологічних - ступінь ядерної атипії за Furhman, гістологічний підтип НКР, наявність саркоматоїдної диференціації, мікроваскулярної інвазії, некрозу пухлини, інвазії збиральної системи нирки; до клінічних факторів належать загальний стан хворого, локальні симптоми, кахексія, анемія, рівні тромбоцитів та нейтрофілів, співвідношення кількості нейтрофілів до кількості лімфоцитів [Ljungberg В., Albiges L., Bensalah A., et al. EAU Guidelineson Renal Cell Carcinoma. European Association of Urology., 2016. p. 17-20]. Так, коефіцієнт ризику хворих із НКР та стадіями T2N0M0, T3N0M0 та T4N0M0 (відносно до стадії T1N0M0) має значні відмінності і становить відповідно 2.71. 5.20 га 18.88. Водночас, 5-річне канцер-специфічне виживання cancer specific survival (CSS) хворих із світло клітинним, папілярним та хромофобним НКР також значно відрізняється і становить 71 %, 91 % та 88 % відповідно, а коефіцієнт ризику (hazard ratio) при II. Ill та IV ступенях диференціації пухлини за Furhman (відносно І ступеня) становить відповідно 1,16, 1.97 та 2.82 [Keegan, К.А., et al. Histopathology of surgically treated renal cell carcinoma: survival differences by subtype and stage. J Urol, 2012. 188: 391]. За останні десятиріччя було вивчено чимало молекулярних прогностичних факторів, серед яких вуглецева ангідраза СаІХ, васкулярний ендотеліальний фактор росту VEGF, гіпоксія-індукований фактор HIF, клітинний маркер проліферації Кi67, гомолог фосфатази і тензину PTEN, Е-кадгерин, протеїни р53, р21 та багато інших [Nofech-Mozes. Roy. HebaW. Z. Khella, Andreas Scorilas, Leza Youssef, Sergey N. Krylov, Evi Lianidou, Konstantinos G. Sidiropoulos, Manal Gabril, Andrew Evans, and George M. Yousef. MicroRNA-194 Is a Marker for Good Prognosis in Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cancer Medicine 5. no. 4 (April 2016): 656 64]. В останні роки увага дослідників сфокусована на визначенні експресії різноманітних генів для прогнозування перебігу НКР, серед яких обнадійливу роль відводять мікроРНК (міРНК) [Samaan, Sara, Heba W. Z. Khella, Andrew, Girgis, Andreas Scorilas, Evi Lianidou, Manal Gabril, Sergey N. Krylov. et al. miR-210 Isa Prognostic Markerin Clear Cell Renal Cell Carcinoma. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD 17, no. 2 (March 2015): 136 44]. Існують дані щодо важливого значення у перебігу НКP miR-15a, яка походить з кластеру хромосомної ділянки 13q14, у патогенезі НКР [Brandenstein Melanie, Jency J. Pandarakalam, Lukas Kroonetal. MicroRNA 15a, Inversely Correlated to PKCα. Is a Potential Marker to Differentiate between Benign and Malignant Renal Tumors in Biopsy and Urine Samples. The American Journal of Pathology. N. 5(180). 2012. P. 1787-97]. Проте, на даний момент, жоден із вивчених молекулярних факторів не продемонстрував достатньої точності в прогнозуванні перебігу НКР та не є рекомендований до застосування у клінічній практиці [Ljungberg В., Albiges L., Bensalah A., et al. EAU Guidelines on Renal Cell Carcinoma. European Association of Urology., 2016. p. 17-20]. Нa сьогодні не виникає сумніву у необхідності пошуку молекулярних прогностичних біомаркерів нирково-клітинного раку, визначення яких би дозволяло прогнозувати перебіг захворювання в післяопераційному періоді та передбачати канцер-специфічне виживання хворих із даною патологією. Найближчим аналогом пропонованої корисної моделі є спосіб прогнозування канцерспецифічного виживання хворих з неметастатичним світлоклітинним раком нирок після нефректомії чи резекції нирки з новоутворенням [Патент РФ № 2438127 С1. МПК G01N 33/48, опубл. 27.12.2011, Бюл. № 36]. Спільною ознакою найближчого аналога та корисної моделі, що заявляється, є те, що в обох випадках проводять визначення експресії генетичних молекулярних біомаркерів, на основі визначення рівня яких прогнозують 3- та 5-річне виживання хворих із HKP після проведення нефректомії. Проте, найближчий аналог дозволяє прогнозувати виживаність хворих із НКР лише світлоклітинного гістологічного підтипу, який становить до 80 % усіх випадків раку нирки. 1 UA 120883 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб прогнозування виживання хворих із нирково-клітинним раком за допомогою молекулярного біомаркера мікроРНК, що дозволить оцінити його експресію в хворих із світлоклітинним, папілярним та хромофобним НКР річних ступенів диференціації після проведеного оперативного лікування. Поставлена задача вирішується тим, що у способі прогнозування канцер-специфічного виживання після проведення нефректомії у хворих із нирково-клітинним раком за допомогою молекулярного біомаркера, що включає визначення експресії генетичного молекулярного біомаркера, згідно з корисною моделлю, проводять виділення РНК, зворотну транскрипцію та полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛP) у реальному часі для визначення експресії молекулярного біомаркера мікроРНК-15а в тканинах пухлини та за отриманими показниками прогнозують виживання хворих із НКР. Заявлена корисна модель базується на дослідженні, яке дозволяє вперше за допомогою зворотної транскрипції та ПЛР проводити визначення експресії молекулярного біомаркера мікроРНК-15а (мікроРНК-15а) в тканинах хворих із НКР після радикальної чи парціальної нефректомії та прогнозувати у них 3- та 5-річне виживання. Спосіб, що заявляється, здійснюють таким чином. Визначення експресії мікроРНК-15а проводять у свіжих чи парафінованих тканинах видаленої пухлини при НКР після радикальної чи парціальної нефректомії. Для депарафінізації зразків тканин та ізоляції РНК використовують набір PureLink™ FFPE RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, США), згідно з протоколом виробника. Визначення концентрації РНК проводять із використанням спектрофотометру (NanoDrop ND1000, NanoDrop Technologies Inc. CША). MiкроPНK визначають методом зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі. Зворотну транскрипцію виконують, застосовуючи набір Taq Man MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, США), специфічного праймеру для мікроРНК та 10 нг тотальної РНК. Кількісну ПЛР у реальному часі проводять з використанням Taq Man MicroRNA Assays (Applied Biosystems, США): U6 snRNA. ID 001973 (як ендогенний контроль), hsa-miR-15a. ID 000389 (Applied Biosystems. США). Температурні цикли застосовують наступні: крок ініціальної денатурації 95 °C 10 хв.: 50 циклів 95 °C - 15 с та 60 °C - 60 с. Рівень експресії ΔCt 100 miRNA, представлений в умовних одиницях (2 * , УО), нормалізують до U6 snRNA. Ампліфікацію проводять на "7500 FastReal-time PCR" (Applied Biosyslems. США). Отримані результати аналізують за допомогою програмного забезпечення "7500 FastRealtime PCR". Отримані рінні експресії міРНК-15а дозволяють прогнозувати 3- та 5-річне виживання у хворих із НКР після радикальної чи парціальної нефректомії шляхом порівняння значення експресії із її медіаною - 0,10±2,62 УО: у хворих із НКР та рівнем експресії 0,10 УО 3-річне та 5річне CSS становлять 100 % та 97,0 % відповідно, а середня тривалість виживання складає 59,88±0,12 місяців (95 % довірчий інтервал ДІ - 59,66-60,11); у пацієнтів із експресією міРНК-15 >0.10 УО 3-річне та 5-річне CSS значно відрізняються (р